为定量测定人血浆中叶酸及5-甲基四氢叶酸浓度,建立了利用HPLC-MS/MS联用技术的分析方法.血浆样品在弱光环境下,经SPE萃取处理,以5 mmo1/L甲醇与乙酸铵(pH6.0)(V(甲醇)/V(乙酸铵)=25:75)为流动相,经Waters XTerra MS C18色谱柱初步分离,利用串联质谱多反应离子监测(MRM)方式监测叶酸、5-甲基四氢叶酸和内标的正离子,然后进行定量测定.结果表明:叶酸和5-甲基四氢叶酸的最低定量浓度均为0.5 ng/mL;线性范围为0.5～25 ng/mL,标准曲线相关系数r≥0.99,精密度和准确度均在士15%之内.此法专属、灵敏、准确,可以用于测定人血浆叶酸和5-甲基四氢叶酸的浓度.