目的 研究Kex2 (EC.3.4.21.61)蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达、纯化和部分性质.方法 Kex2基因整合进pPIC9K质粒中,通过电转构建重组毕赤酵母GS115-Kex2,G418筛选多拷贝子,甲醇诱导得到目的蛋白.通过强阴离子交换层析Q-FF对重组蛋白进行纯化,对纯化后的蛋白进行酶学性质研究.结果 通过毕赤酵母表达可以得到具有活性的重组Kex2蛋白酶,以Boc-Gln-Arg-Arg-pNA(叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺,Boc-QRR-pNA)为底物检测酶的活性,发酵外液活性达270U/L,SDS-PAGE检测目的蛋白的分子量为67kDa,经Q-FF纯化后,目的蛋白的活性回收率为84％.重组Kex2蛋白酶在pH5.0～6.0之间稳定,pH9.0时活性最高.在25℃,pH5.0条件下放置12h活力可保持88.2％.以Boc-QRR-pNA为底物,测得重组Kex2蛋白酶的Km值为0.0167 mmol/L,Vmax值为333.3 μmol/min.结论 利用毕赤酵母可成功表达分泌Kex2蛋白,经Q-FF纯化后可得到较纯的Kex2蛋白酶.
Kex2 毕赤酵母 表达 纯化 稳定性