目的 设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体.方法 依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo.利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体.把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定.再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1 p24抗原ELISA法"测定样品滴度.选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率.并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量.2组间比较采用两独立样本t检验.结果 (1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆.经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒.物理检测与无菌检测合格.(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108 TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒.(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80％,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均<0.05),敲减效率达到70.5％.结论 成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404).
ECEL1基因 慢病毒载体 肝肿瘤