[目的]同时敲除苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组的Ac148、Ac149、Ac150(Ac148-150)基因,检测敲除Ac148-150基因片段对AcMNPV复制和外源蛋白表达能力的影响,为基因功能鉴定和缩小杆状病毒基因组提供参考.[方法]利用Red/ET同源重组系统和rpsL-AMP反向筛选系统对Ac148-150基因进行敲除,得到敲除型杆状病毒质粒(KOAc148-150杆状病毒质粒),提取AcMNPV KOAc148-150杆状病毒质粒和野生型杆状病毒质粒,将其分别与报告基因表达载体共转染Sf9细胞,成功构建重组杆状病毒(野生型病毒vAcMNPV/GFP和缺失突变病毒vAc△148-150/GFP),测定2种重组杆状病毒的一步生长曲线并比较其差异.将2种重组杆状病毒感染Sf9细胞后,采用荧光显微镜观察GFP荧光细胞分布,用流式细胞仪检测GFP荧光强度,再通过SDS-PAGE和Western blot检测Ac148-150缺失突变体表达的GFP产量.[结果]菌落PCR结果表明,AcMNPV中Ac148-150基因敲除成功.缺失突变病毒vAc△148-150/GFP与野生型病毒vAcMNPV/GFP的一步生长曲线基本一致,说明Ac148-150缺失不影响病毒的复制.荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果表明,敲除Ac148-150对外源蛋白GFP分布和荧光强度未产生影响.SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,缺失突变病毒vAc△148-150/GFP和野生型病毒vAcMNPV/GFP表达GFP蛋白产量基本一致.[结论]从AcMNPV基因组中同时敲除Ac148、Ac149、Ac150基因后,对病毒的复制和外源蛋白的表达能力无影响.
苜蓿银纹夜蛾 核型多角体病毒 Ac148-150 杆状病毒 基因敲除