目的 为了深入了解在胚胎发育过程中,尤其是在早期B淋巴细胞的生成和中脑的发育过程中pax5基因可能的作用及其机制,选择斑马鱼作为实验动物,构建野生型斑马鱼pCS2+ -pax5重组质粒,并观察pax5基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达.方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoR Ⅰ、XbaⅠ双酶切后,在T4DNA连接酶的作用下插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针.将得到的探针用全胚胎原位杂交技术检测pax5基因在斑马鱼早期发育过程中的表达.结果 成功构建pCS2+ -pax5重组质粒并制备了pax5基因的反义mRNA探针,通过斑马鱼原位杂交技术,发现在斑马鱼受精后18～72小时(18～72 hpf)胚胎头部的小脑、中脑后脑交界处均可观察到pax5基因阳性杂交信号；在24～72 hpf胚胎的耳蜗均可观察到pax5基因的阳性杂交信号,且随着时相的增长其表达逐渐增多；在18～48 hpf胚胎的脊索部位可见pax5基因的阳性杂交信号.结论 明确了pax5基因在斑马鱼胚胎的脑部、脊索神经系统高表达,并首次证实其在耳蜗听神经的早期发育过程中有表达,可能对斑马鱼早期胚胎神经系统的发育起着某些至关重要的作用.
斑马鱼 pCS2+载体 pax5基因 反义mRNA 原位杂交