普通双元载体已被广泛应用于农杆菌介导的植物转化,但这类载体通常只能转移5～20kb的外源DNA片段;而双元细菌人工染色体(BIBAC)载体可以弥补普通双元载体的不足,通过它已在烟草、番茄等双子叶植物中实现了大片段DNA(150kb)的转移.BIBAC载体在单子叶植物转化中的应用尚未见报道.由于单、双子叶植物间以及大、小片段转化间的转化体系存在明显差异,常规的农杆菌介导的水稻转化体系不能适应BIBAC系统转化的要求.因此,建立适于BIBAC系统的水稻转化体系是十分必要的.通过比较不同的受体材料,不同的预培养、共培养条件,不同的去除农杆菌及选择阳性愈伤的方式等对转化效率的影响,建立了适合水稻BIBAC系统的转化体系.该体系的技术要点包括:以水稻品种H1493为转化受体;以含毒性辅助质粒pCH32的LBA4404菌株(HP4404)为侵染菌株;预培养的培养基pH5.6;以N6A代替AAM悬浮农杆菌;侵染菌液浓度为OD600=1.0;共培养温度为24℃;采用过渡(Resting)培养除去农杆菌;采用二步法进行选择等.基于PCR检测、Southern印迹分析的结果表明,BIBAC载体所携带的插入片段及标记基因已整合到转化植株的基因组中.这个体系的建立为在水稻中利用BIBAC系统进行大片段DNA转化奠定基础.
水稻 农杆菌 双元细菌人工染色体 植物大片段DNA转化