为分析催化四联体中关键氨基酸突变对黄鳝醛酮还原酶活性的影响,本研究利用重叠PCR技术对黄鳝Eakr基因进行了A81K定点突变,将突变基因亚克隆至pET-28a (+)构建了重组表达载体.重组载体转化BL21 (DE3)菌株后经IPTG诱导,镍离子柱亲和层析获得了突变型蛋白(EakrA81K);以NADPH为辅酶,分析了突变型蛋白EakrA81K的底物谱,并比较了野生型(Eakr)和突变型蛋白(EakrA81K)对不同底物的还原活性;最后,以甲醛为底物比较了野生型和突变型蛋白的最适反应温度和最适pH.结果表明:EakrA81K对醛类物质以及中长链酮类物质具有较高的还原活性,而对醇、糖、酸类物质没有明显活性;A81K位点特异突变使得黄鳝醛酮还原酶和底物之间的亲和力显著增加,并提高了酶对大部分底物的还原活性;突变稍降低了黄鳝醛酮还原酶的酸度耐受能力但提升了该酶的温度耐受能力.这暗示着黄鳝醛酮还原酶Eakr的81位氨基酸在底物识别上具有重要作用.
醛酮还原酶 定点突变 催化四联体 底物识别