合成20 mer随机寡核苷酸文库,与体外转录出的全长survivin cRNA杂交,RNase H酶切割后,经引物延伸、放射自显影,共筛选出13个针对survivin基因的反义结合位点(antisense accessible sites,AAS).运用RNADraw软件分析、选定具有显著茎环结构的4个位点,合成互补性反义寡核苷酸AS-ODN1、AS-ODN2、AS-ODN3、AS-ODN4并转染高表达survivin基因的胃癌细胞株MKN-45.逆转录聚合酶链反应和Western印迹检测发现MKN-45细胞的survivin mRNA和蛋白水平均有显著的下降;MTT比色法证实600 nmol/L AS-ODN1～AS-ODN4转染24 h后细胞生长受到明显抑制,透射电镜、annexin Ⅴ-FITC和PI双染色流式细胞术均检测到细胞凋亡.说明运用随机寡核苷酸文库/RNase H酶切割与计算机分析相结合的方法,在体外有效筛选出survivin的反义核酸结合位点,其相应的反义寡核苷酸能阻断survivin基因的生物学功能.
survivin基因 反义结合位点 随机寡核苷酸文库 基因表达