目的 将人膜联蛋白V基因突变后转化入毕赤酵母重组表达,从培养液中纯化出具有内在金属螯合位点的活性突变型人膜联蛋白V.方法应用特异引物将天然人膜联蛋白V基因的5'和3'端进行突变改造,将突变型膜联蛋白V基因插入到pPIC9K质粒并进行基因测序鉴定.将正确连接的表达质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115中.通过MD平板筛选转化子、BMGY培养基培养、甲醇诱导表达目的蛋白质.培养物经过离心获取上清液,用SDS-PAGE和银染分析蛋白质的表达情况,通过外露磷脂酰丝氨酸的红细胞和异硫氰酸荧光素标记膜联蛋白V测定上清液中突变型人膜联蛋白V的结合活性.结果 天然人膜联蛋白V基因5'端融合GCAGGCGGCTGCGGCCAT编码序列,3'端946～948位TGT突变为AGC.毕赤酵母转化子分泌产生相对分子质量为36000的蛋白质,其半数抑制浓度为4nmol/L.结论 利用毕赤酵母系统表达出高活性的、具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V.
膜联蛋白V 突变 表达 毕赤酵母