为了在哺乳动物细胞中建立一套用于研究蛋白分子转录激活活性的系统,首先以质粒pTet-Off和真核表达载体pCDNA3.1B(-)/myc-his为基础,分别构建重组质粒pZHO1(用于插入待测基因并作为该系统的阴性对照)、pZHO2(用于作阳性对照),此外,该系统还包括质粒pTRE-luc(编码Firefly荧光素酶报道基因)和质粒pRL-TK(编码Renilla荧光素酶基因,用作内参对照).为验证该系统的可行性,分别将质粒pZHO1、pZHO2、pZHO3(编码p53分子N端转录激活区73个氨基酸片段,作为实验组)与质粒pTRE-luc和pRL-TK共转染至C4-2、MCF-7、COS7 3种不同的细胞株中,通过检测各转染组细胞中Firefly荧光素酶相对活性的大小来判断该系统的可行性.结果表明,所构建的系统可以在哺乳动物细胞中检测目的分子的转录激活活性.
转录激活 双荧光素酶报道系统 Tet-Off