利用PCR技术,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPA cDNA的缺失突变体--rPA;在此基础上,运用定点突变技术,得到rPA的定点突变体--rPA(KHRR296～299AAAA),rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR296～299AAA/A473S);将rP及其3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,获得表达载体pErA,pErA(K),pErA(A)和pErA(KA).酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变.表达载体转化大肠杆菌,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS-PAGE电泳分析发现,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达;蛋白产量分别占菌体总蛋白的35.97%与37.71%,分子量均为39.6 kD.Western blotting显示,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应.该产物经初步纯化后进行复性与活性(mFAPA)测定,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性.以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础.
重组纤溶酶原激活剂 突变体 表达