[目的]利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌(De erribacter desul uricans)解旋酶DePif1,并对其结合与解旋DNA的活性进行分析,为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础.[方法]将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连人pET15b载体,获得重组融合表达载体pET15b-SUMO-De-Pif1,然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱获得融合蛋白,SUMO蛋白酶酶切去除融合标签,再经Heparin和Ni-NTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白;采用荧光各向异性分析,研究pH和NaCl浓度对DePif1与DNA结合的影响及DePif1与不同底物(单链DNA、双链DNA和G4-DNA)的结合特性;使用基于荧光共振能量转移的stopped-flow技术,分析DePif1对不同底物(G4-DNA with 5'26 nt tail和dsDNAwith 5'26 nt tail)的解旋活性.[结果]每升菌液可获得9 mg纯度大于95％的DePif1解旋酶.DePif1结合不同DNA底物的强度依次为G4-DNA＞单链DNA＞双链DNA,其对G4-DNA的解旋活力大于双链DNA.[结论]成功表达并纯化了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶,并证明其具有特异的G4-DNA结合和解旋能力.
嗜热脱铁去硫弧菌 Pif1解旋酶 G4-DNA 表达纯化 解旋活性