目的 在人胚胎干细胞(hESCs)中建立一种可行的CRISPR文库筛选方法,筛选参与维持hESCs多能性的顺式作用元件.方法 将诱导型Cas9蛋白表达元件插入hESC基因组中,构建诱导型Cas9稳定表达株(iCas9-hESC).通过分析已发表的hESCs中的染色质互作信息,确定可能参与多能性基因调控的顺式作用元件,并以此来构建双gRNA CRISPR敲除文库.使用CIRSPR文库在低感染复数情况下感染iCas9-hESC,诱导Cas9蛋白表达,对细胞进行基因编辑.以OCT4的表达水平作为衡量多能性的标准,对基因编辑后的细胞进行OCT4的流式抗体染色与分析,确定顺式元件敲除后是否影响到hESC的多能性.结果 成功构建iCas9-hESC,且该细胞仍保持多能性状态.构建顺式元件的CRISPR敲除文库,成功感染目的细胞.对文库感染后的细胞进行OCT4表达水平的流式分析,发现基因编辑后的细胞确实存在多能性下降的部分群体.结论 建立了在hESC中通过CRISPR文库筛选参与维持多能性顺式作用元件的可行性方案.
人胚胎干细胞 多能性 顺式元件 CRISPR文库