以康宁木霉AS3.2774 mRNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增了1413 bp的CBHⅡ全长基因,利用T-A克隆,将CBHⅡ克隆至克隆载体pMD 18-T SimpleVector,构建质粒pMD 18-T-CBHⅡ.以SmaⅠ和SphⅠ双酶切pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t,将纯化的CBHⅡ亚克隆到pW425t中,得到原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ,可在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达.将pW425t-CBHⅡ转化在thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定、分析测序以及生长功能弥补筛选阳性克隆.SDS-PAGE分析,约49.6 kD的蛋白可见,刚果红染色显示重组大肠杆菌可产生明显的水解圈,并用pNPC法测得重组大肠杆菌的CBHⅡ酶活力在温度50℃、pH值5.0时达到最大.
纤维素酶 CBHⅡ基因 大肠杆菌 表达