目的:为实现人源溶血磷脂酶D(LysoPLD)的原核异源可溶性表达.方法:通过NCBI检索,确定人源LysoPLD基因序列(GenBank:L46720.1).采用密码子优化后的序列,克隆至pET-28a表达载体中,采用共表达麦芽糖结合蛋白融合标签(MBP)和共表达促蛋白正确折叠分子伴侣触发因子Triggerfactor(tig)两种方式提高LysoPLD蛋白在大肠杆菌中的异源可溶性表达,建立对应蛋白的纯化工艺包括离子柱纯化,硫酸铵盐析,疏水柱纯化,淀粉树脂柱(Amylose Resin)纯化,分离纯化获得的重组酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白纯度,以对羟基棕榈酸酯为底物对比两种蛋白的酶学性质.结果:成功构建载体pET28a-MBP-LysoPLD和pET28a-pTF16-LysoPLD,并获得工程菌 BL21(DE3)-pET28a-MBP-LysoPLD 和 BL21(DE3)-pET28a-pTfl6-LysoPLD.BL21(DE3)-pET28a-MBP-LysoPLD经0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导过夜可获得上清表达的 MBP-LysoPLD 蛋白;BL21(DE3)-pET28a-pTfl6-LysoPLD 在含有0.5 μg/mL L-Arabinose 的 LB 培养基中培养,经0.1 mmol/L IPTG低温诱导表达,可获得可溶性表达的LysoPLD蛋白,经纯化,酶纯度可大于80％.以对羟基棕榈酸酿为底物,对比两种方法得到的蛋白的酶学性质,发现二者催化反应的最适温度、最适pH、最适Ca2+浓度、比酶活基本一致.结论:两种基因共表达方式都可实现人源LysoPLD的在大肠杆菌中的可溶性表达,且酶学性质基本相同.
人源溶血磷脂酶D 异源可溶性表达 麦芽糖结合蛋白融合标签 触发因子 酶学性质