目的 建立可模拟人类KRT14强致病位点突变的高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统.方法 本研究通过检索多个数据库筛查人类单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)致病的基因KRT14强致病突变位点,并通过人和小鼠KRT14蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上.根据CRISPR/Cas9系统的基因打靶原理,设计了4个靶向小鼠Krt14的单导RNA(sgRNA),并对应构建了4个sgRNA表达质粒.将sgRNA表达质粒分别与Cas9表达质粒共转染小鼠NIH 3T3细胞,转染细胞经过药物筛选、PCR扩增产物测序、TA克隆测序等实验验证4个sgRNAs的打靶效率.结果 根据数据库筛查结果 判定人KRT14蛋白的p.Arg125位点为强致病位点,与小鼠KRT14蛋白的p.Arg131位点相对应;根据小鼠p.Arg131位点的DNA序列,成功构建了4个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序表明4个位点均发生了突变;TA克隆测序结果 表明4个位点的突变效率分别为70％、90％、65％和100％.结论 根据数据库筛查的人KRT14强致病位点,成功构建了高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统,为深入研究KRT14的功能以及建立KRT14基因编辑小鼠模型、探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础.
单纯性大疱性表皮松懈症 KRT14 基因编辑 CRISPR/Cas9