构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证.以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K.lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS.载体经Sac II线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K.lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR(RT-QPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1～3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6％,达到(590±13.33)U/mL.在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59％.通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K.lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K.lactis的进一步分子改造提供参考.
乳酸克鲁维酵母 18SrDNA 整合表达 AMP脱氨酶 RT-QPCR 拷贝数