目的 原核表达抗菌肽,纯化并鉴定其抗菌活性.方法 用人工合成的方法 合成编码thanatin 21肽的DNA序列(并使用了大肠杆菌的偏爱密码子),克隆入pTYB11质粒,转化大肠杆菌ER2566.thanatin与内含肽融合表达,内含肽是一种具有自剪切功能能够自动将目标蛋白及内含肽分离的蛋白剪切元素.内含肽-thanatin以可溶性蛋白的方式表达,存在于细胞裂解液的水相中,将细胞裂解液过几丁质亲和层析柱,内含肽-thanatin能够特异地结合到几丁质柱上.在层析柱上用DTT/半胱氨酸缓冲液在4℃切割过夜,切割下来的thanatin用洗脱液洗脱.结果 在最先洗脱下来的4ml洗脱液中蛋白浓度达到245μg/ml.纯化后的thanatin具有很好的抗革兰氏阴性菌以及真菌的能力,如弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、宋内志贺菌(Shigella snnei)、大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)、产毒大肠杆菌(toxin producing Escherichia coli)、绿脓杆菌(Rseudomonas aeruginosa)、白色念珠菌(Candida albicans),尤其在抗耐药菌方面表现出显著优势,如耐药肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella plieumoniae)及产超广谱β内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)大肠杆菌.重组Thanatin对80株产ESBLs耐药大肠杆菌及30株敏感的大肠杆菌所产生的抑菌圈的大小没有显著性差异(P>0.05,t-test),具有相同的抗菌能力.结论 在大肠杆菌ER2566中表达的thanatin对革兰氏阴性菌尤其是临床耐药菌有很好的抗菌活性,克服了抗生素耐药性的问题.Thanatin具有开发成抗革兰氏阴性菌药物的潜力.
Thanatin 原核表达 抗菌活性