应用"Long-PCR"技术, 用6对p53引物从青NFDA6胚胎干细胞基因组DNA中扩增出6个相互重叠的片段,其中最大的片段长达4.5 kb, 这6个PCR片段覆盖了整个p53基因.序列分析表明青NFDA6p53基因长约8.7 kb,由11个外显子和10个内含子组成.结构比较表明,青NFDA6p53基因在大小上与人和小鼠p53基因存在较大差异.青NFDA6p53基因的内含子1仅为0.85 kb,而人和小鼠p53基因的内含子1则分别长达10 kb和6 kb;青NFDA6p53基因的外显子3(86 bp)明显大于人和小鼠p53基因的外显子3(22 bp);外显子4(170 bp)比人(280 bp)和小鼠(260 bp)的外显子4小; 内含子10(3.5 kb)则比人和小鼠内含子10(0.7 kb和0.9 kb)大得多.用SVTK-neo基因作正选择标记基因,用SVTK-tk基因作负选择标记基因, 用青NFDA6p53基因组片段作同源序列,构建了鱼类p53基因同源重组载体.将此载体转染青NFDA6胚胎干细胞,并经G418和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达,并提供对G418 的抗性和对Ganc的敏感性.
青鳉p53基因 结构 同源重组载体 胚胎干细胞