目的:构建尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)启动子区的双荧光素酶报告质粒并检测其活性,从而验证SND1蛋白对NNMT基因的调控作用.方法:根据NNMT基因启动子区上、下游-1 500至+200区间的序列设计引物,并以HepG2细胞提取的RNA逆转录得到cDNA为模板进行PCR扩增,得到的NNMT启动子区片段经酶切后连接到双荧光素报告载体GLuc-ONTM启动子报告克隆中,得到Gluc-NNMT启动子重组质粒,分别与pLVX-IRES-Puro-Flag-SND 1质粒和pLVX-IRES-Puro-vector质粒共同转染HeLa细胞,并检测启动子活性.然后用免疫共沉淀的方法验证NNMT蛋白是否与SND1蛋白之间存在相互作用.结果:重组质粒构建成功.双荧光素酶活性实验显示,共转染Gluc-NNMT启动子重组质粒和pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1过表达质粒的实验组与对照组相比,NNMT启动子区活性明显增强.结合免疫共沉淀实验结果,证明NNMT与SND1存在相互作用.结论:成功构建了 NNMT启动子双荧光素酶报告质粒,SND1对NNMT启动子活性有增强作用,SND1与NNMT蛋白之间存在相互作用.
NNMT SND1 双荧光素酶报告基因 免疫共沉淀 蛋白相互作用