为了对粪肠球菌EXW27的内源性质粒pXW进行DNA序列的测定和分析,并基于其最小复制子构建大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体.本研究从具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27中分离得到了内源性质粒pXW,对其进行了DNA序列的测定及分析,然后利用质粒pXW的复制子构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体,并研究大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体的宿主范围、转化效率和稳定性.结果表明该质粒大小为8617 bp,GC含量为33.29％,包含8个ORF,推定为θ型复制质粒.质粒pXW在粪肠球菌EXW27中拷贝数最高可达32.09±0.93,表明质粒pXW属于高拷贝数质粒.本研究确定了质粒pXW的最小复制子,并基于该复制子构建了大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体pXWM1.该穿梭载体具有较宽的宿主范围,可成功转化至不同类型乳酸菌,转化效率介于1.96×102～8.96×104 CFU/μg(质粒DNA)之间,质粒丢失率介于28.54％～54.17％之间.本研究成功构建了一个具有宽宿主范围、高转化效率以及高稳定性的大肠杆菌-粪肠球菌穿梭载体,为乳酸菌基因操作提供了新工具.
粪肠球菌 内源性质粒 θ型复制 穿梭载体 大肠杆菌