本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性.试验设计5个长20 bp的单链导向RNA (sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5.化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA.利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性.结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功.靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据.
猪 生长抑素基因 Cas9酶 单链导向RNA (sgRNA) 体外转录