本研究旨在克隆水牛SIRT6基因,构建真核表达载体,并对该基因进行生物信息学及组织表达谱分析.以牛SIRT6基因编码区为种子序列(GenBank登录号:NM_001098084.1),应用Oligo 7.0软件设计引物序列,用RT-PCR方法扩增水牛SIRT6基因完整编码区序列,测序鉴定后进行生物信息学分析,构建逆转录病毒载体pMXs-SIRT6-IRES-GFP,并在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞上进行重组载体表达鉴定;采集水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴分别提取RNA,反转录后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,检测SIRT6基因在各组织中的表达差异.结果 表明,水牛SIRT6基因编码区全长1 080 bp,编码359个氨基酸,其中亮氨酸及脯氨酸含量最高(10.3％),酪氨酸含量最低(1.1％).水牛SIRT6基因核苷酸序列与牛、人和小鼠的同源性分别为98.4％、86.7％00和78.5％00,物种间同源性较低.系统进化树结果表明,水牛与牛聚为一支,再与人、小鼠聚为一大支,亲缘关系相对较近,与果蝇亲缘关系较远.SIRT6蛋白理论分子质量为39.47 ku,分子式为C1737 H2783 N509 O516 S13,等电点为8.48,不存在跨膜区,为膜内蛋白;含有Sirtuin家族特有的Sir2去乙酰化酶的催化结构.二级结构预测结果显示,水牛SIRT6蛋白包含13个α-螺旋、27个β-折叠、24个T-转角和20个无规则卷曲.逆转录病毒载体介导的SIRT6基因能在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞中表达.实时荧光定量PCR结果显示,SIRT6基因在水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴中均有表达,其中在生殖嵴中表达量最高,在皮肤中的表达量次之,而在肝脏中表达量最低.本试验结果将为水牛SIRT6基因的功能研究提供参考.
水牛 SIRT6基因 克隆 载体构建 表达谱