电泳印迹技术是蛋白质化学研究的重要手段之一,主要方法有垂直的槽式和水平的半干式两种,本实验探讨对疏水膜半干式蛋白电泳印迹的影响因素,旨在增强印迹作用.1 材料和方法1.1 试剂两性载体(ampholine pH 3.5～10.0)购自Pharmacy公司;丙烯酰胺(Acrylamide)、N,N′-甲叉双丙烯酰胺(Bis)及疏水膜(PVDF)购自Bio-Rad公司;兔抗鼠α、β、γ抗血清由美国卫生研究院(NIH)Zigler JS 博士惠赠;其余试剂均购自Sigma公司.1.2 仪器等电聚焦采用多用电泳仪(Multiphor Ⅱ, LKB公司,瑞典);SDS-PAGE采用微量蛋白分析系统(MiniProtein 3 System, Bio-Rad公司,美国);半干式印迹仪分别用Z35,877-0型(Sigma公司, 美国)及FB-SDB-2020型(Fisher公司,美国).1.3 实验方法鼠晶状体蛋白分离制备及纯化,等电聚焦,按常规操作.SDS-PAGE, 胶浓度为30%T,交联度为2.67%C,常规操作.1.3.1 电泳印迹不连续缓冲液阳极缓冲液Ⅰ(浸双层滤纸,0.3 mol/L Tris, pH 10.4),阳极缓冲液Ⅱ(浸单层滤纸,25 mmol/L Tris, pH 10.4),阴极缓冲液Ⅲ(浸三层滤纸,40 mmol/L氨基己酸,25 mmol/L Tris pH 9.4),均含20%甲醇;连续缓冲液:甘氨酸39 mmol/L,Tris 48 mmol/L,SDS 0.037 5%(W/V),20%甲醇.1.3.2 步骤第一类电泳印迹模式为阴极在上,阳极在下,操作时先准备阳极侧滤纸"三明治",然后铺疏水膜,再铺凝胶及阴极侧滤纸,缓冲液为连续缓冲液,蛋白移动方向由上而下;第二类电泳印迹模式为阳极在上,阴极在下,操作时程序与第一类相反.电转移均采用1 mA/cm2胶,持续转移90 min.行Western印迹分析,4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphthol)作显色剂,常规操作.
半干式电转移 印迹法 蛋白质