本研究旨在通过 CRISPR/Cas9体外酶切法及细胞水平上的 PCR 扩增测序筛选出靶向食蟹猴 NTCP 基因具有高敲除活性的 gRNA。首先通过比对食蟹猴与人类 NTCP 氨基酸序列,选择差异位点,即第84—87位和第157—165位氨基酸作为基因靶点序列区；利用 gRNA 软件设计针对上述基因靶点序列的 gRNA,每个靶点设计3~4条候选 gRNA 序列；然后利用 gRNA 体外检测试剂盒,筛选出靶向 NTCP 基因的体外敲除活性较高的两条gRNA 序列：gRNA1.2和 gRNA2.1。将 gRNA1.2和 gRNA2.1分别插入 pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP 载体中,转染食蟹猴原代肝细胞。提取转染后细胞基因组 DNA,通过 PCR 扩增 NTCP 基因并将其克隆到 T 载体中进行测序分析。结果表明,gRNA1.2和 gRNA2.1均可使 NTCP 基因产生移码突变,但 gRNA2.1比 gRNA1.2具有更高的敲除活性。本研究为下一步编辑食蟹猴 NTCP 基因及研究其在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的功能奠定了基础。
CRISPR/Cas9 gRNA 食蟹猴 NTCP基因 基因敲除