目的 重组表达人细胞色素P450 (CYP)2A13突变体CYP2A13★2,CYP2A13★5,CYP2A13★6,CYP2A13★8和CYP2A13★9,并研究CYP2A13突变体与野生型CYP2A13(CYP2A13★1)对香豆素的代谢活性上的差异.方法 通过点突变法构建各CYP2A13突变体.用杆状病毒表达系统制备含各突变体cDNA的重组病毒,并将其与含人源还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸P450氧化还原酶(POR,野生型)的重组杆状病毒共转染昆虫草地夜蛾细胞(sfg),共表达CYP2A13突变体和POR重组蛋白.将表达产物制备成微粒体与香豆素(0.25 ～ 25μmol·L-1)体外孵育30 min,高效液相色谱法测定各重组酶对香豆素的代谢活性.结果 Western蛋白印迹结果表明,各重组酶在sfg细胞中得到了表达.体外代谢实验显示,CYP2A13野生型及其突变体蛋白代谢香豆素在Km值上无显著差异,而在Vmax(mol· min-1·mol-1CYP)上,CYP2A13★2(0.58±0.05,P＜0.05)、CYP2A13★5 (0.71±0.08,P＜0.01)、CYP2A13★6 (0.84±0.09,P＜0.01)、CYP2A13★9 (0.58±0.04,P＜O.05)等突变体与CYP2A13★1 (0.33±0.06)相比有显著性差异,使得这4个突变体的代谢效率增加了40％～108％.结论 体外成功表达了具有活性的CYP2A13★2,CYP2A13★5,CYP2A13★6,CYP2A13★8和CYP2A13★9重组蛋白.CYP2A13★2,CYP2A13★5,CYP2A13★6和CYP2A13★9等突变体的香豆素代谢活性明显高于CYP2A13★1.
细胞色素P450 CYP2A13 突变体 杆状病毒表达系统 香豆素