目的：通过敲低微小RNA（microRNA，miRNA）-221和miRNA-222的表达上调组织金属蛋白酶抑制剂3（TIMP3）的方法来研究人乳腺癌 MCF-7细胞系的增殖和迁移能力。方法根据 miRBase 数据库中 Homo sapiens（hsa）-miRNA-221和hsa-miRNA-222的寡核苷酸序列和一段无义序列分别设计并重组成质粒：反义抑制miRNA-221（antisense-miRNA-221，AS-miRNA-221）、反义抑制miRNA-222（antisense-miRNA-222，AS-miRNA-222）、共同反义抑制miRNA-221/222（antisense-miRNA-221/222，AS-miRNA-221/222）和无义抑制（Scramble），并将其分别利用脂质体LipofectamineTM2000转染进人乳腺癌MCF-7细胞中，经G418筛选后建立稳定表达的对照细胞株[未转染正常细胞（Control组）和无义抑制细胞（Scramble组）]和低表达miRNA-221、miRNA-222细胞株（即AS-miRNA-221组、AS-miRNA-222组和AS-miRNA-221/222组）。转染24 h后于荧光显微镜下观察转染效率；采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测各组细胞中miRNA-221和miRNA-222的表达量，采用逆转录PCR检测各组细胞中质粒载体上携带的抗性neo 基因的表达情况，以此来验证转染是否成功；分别采用实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测TIMP3和金属蛋白酶17（ADAM17）的表达差异；采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测并绘制生长曲线，观察低表达miRNA-221、miRNA-222各组细胞的生长能力；采用划痕修复实验观察转染后细胞的迁移能力。结果转染24 h之后，在荧光显微镜下观察到各转染组细胞的绿色荧光蛋白表达较多，即转染效率较高。检测转染后各组细胞中 neo 基因、miRNA-221和 miRNA-222的表达。与 Control 组比较，Scramble 组、AS-miRNA-221组、AS-miRNA-222组、AS-miRNA-221/222组neo基因表达明显升高；与Scramble组比较，AS-miRNA-221组、AS-miRNA-222组、AS-miRNA-221/222组miRNA-221和miRNA-222的表达量明显降低，即证实转染了反义抑制miRNA-221/222的低表达稳定细胞株构建成功。与Scramble组比较，AS-miRNA-221组、AS-miRNA-222组、AS-miRNA-221/222组细胞TIMP3 mRNA表达升高，而其调控的ADAM17水平降低。生长曲线显示低表达miRNA-221、miRNA-222各组细胞的生长能力明显受到抑制。划痕修复实验结果显示低表达 miRNA-221、miRNA-222各组细胞的迁移能力降低。结论通过敲低miRNA-221、miRNA-222、上调TIMP3表达可以抑制人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖和迁移能力。
微小RNA-221 微小RNA-222 转染 组织金属蛋白酶抑制剂3 金属蛋白酶17 人乳腺癌MCF-7细胞