目的:制备和纯化重组人NAMPT和NAMPT(H247A)蛋白,并对其体外酶活性进行检测.方法:以pcDNA3.1-hnampt为模板,通过PCR扩增获得两端分别为BamH I和Nde I酶切位点的hnampt片断,将该片断与pET-11a(+)表达型载体连接,通过点突变获得pET-11a(+)-hnampt(H247A),以测序鉴定构建质粒.将野生型和突变型分别转化至BL21star大肠杆茵,以IPTG诱导蛋白表达,以镍柱和分子筛纯化目标蛋白,以SDS凝胶电泳和质谱鉴定目标蛋白,以核磁共振的方法检测两个重组蛋白在体外酶活性.结果:测序结果表明,pET-lla(+)-hnampt(野生型)及pET-11a(+)-hnampt(H247A)(突变型)表达载体构建成功,突变位点正确.两种蛋白均在BL21star 大肠杆菌获得表达,裂解后为可溶性蛋白,通过镍柱、分子筛获得纯化蛋白,SDS凝胶电泳和质谱鉴定证明重组蛋白为分子量约56 kD的NAMPT.核磁共振体外酶活性检测发现野生型NAMPT具有酶活性,而NAMPT(H247A)的酶活性降低了约5～10倍.结论:成功获得了有体外酶活性的人NAMPT蛋白和酶活性较低的人NAMPT(H247A)蛋白,为NAMPT蛋白作用研究提供了基础.
磁共振波谱学 大肠杆菌 磷酸转移酶类/遗传学 点突变 质粒 遗传载体 重组蛋白质类 NAMPT 蛋白纯化 核磁共振