目的:构建人源B细胞淋巴瘤因子11A(B cell CLL/lymphoma 11A,BCL11A)敲除的单克隆细胞系,为BCL11A的功能研究奠定实验基础.方法:利用在线网站设计挑选sgRNA,构建sgRNA表达载体;sgRNA表达载体与Cas9表达载体共转染HKE293T细胞后,提取基因组,扩增靶点区域,T7核酸内切酶I(T7endonucleaseI,T7E1)分析检测sgRNA活性;将检测有活性的sgRNA表达载体与Cas9表达载体共转染HEK293T细胞,克隆化筛选获得单克隆敲除细胞系.结果:挑选3条靶向4号外显子的sgRNA1-3,T7E1检测获得了具有较好活性的sgRNA3;利用sgRNA3在293T细胞中对BCL11A基因进行敲除,筛选获得了4号外显子敲除的两种基因型单克隆细胞系,一种为靶点位置14个碱基缺失,2个碱基突变;一种为靶位点前有236碱基缺失,20个碱基插入.结论:成功构建了大片段缺失的单克隆细胞系,在基因水平实现了对BCL11A的编辑,提供了可供更多后续研究的敲除方法 .
CRISPR/Cas9系统 B-细胞淋巴瘤因子11A 外显子 大片段缺失