[目的]构建针对E2F3基因的shRNA表达载体,通过脂质体进行膀胱癌细胞内转染.监测转染效率.[方法]通过软件设计针对E2F3基因的寡核苷酸链,化学合成-对编码短发夹RNA序列,长度为64个碱基.核苷酸链经退火,克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,构建针对E2F3基因的RNA干扰质粒.通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果.通过不同浓度的Lipofectamin 2000及干扰质粒混合物进行膀胱癌细胞系5637细胞转染,通过绿色荧光的表达程度摸索出细胞最佳转染浓度及转染时间.[结果]重组构建的pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.Lipofectamin 2000能够有效的进行pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo质粒的转染.[结论]载体的成功构建及膀胱癌细胞系的高效转染,为进一步研究E2F3基因在膀胱肿瘤中的功能奠定基础.
pRNAT-U6.1/Neo系统 RNAj E2F3