[目的]构建表达不同片段长度和GC含量的dsegfp片段,比较4种dsRNA提取方法,获得最佳的提取方法以及dsRNA相对最优的表达载体,为dsRNA的降解研究提供基础.[方法]以pET-2p和L4440为载体,分别构建5组不同长度、不同CG含量的gfp-201-30CG、gfp-201-50-CG、gfp-423-30CG、gfp-423-50CG和gfp-423-70CG为目的片段的dsgfp表达载体,运用Trizol法、酚氯仿法、RNA-easy提取液以及75％酒精沉淀法分别提取1和50 mL经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导菌液表达的dsgfp,核酸检测A260/A280、A260/A230比较纯度,以体外合成dsgfp为对照,评价4种方法提取效率及2种载体dsgfp表达能力.[结果]4种提取方法经多重方差分析,其中提取纯度最高的是Trizol法和酚氯仿法A260/A280、A260/A230均值分别可达1.83、1.79;1.78、2.1,损失率分别为23.83％,21.44％.其次是75％酒精沉淀法A260/A280、A260/ A230均值可达1.8、1.78,损失率为32.3％.提取纯度最低的为RNA-easy提取液,其A260/A280、A260/A230均值可达1.56、1.56,损失率为37.62％.利用内标混合纯dsRNA的方法,计算获得每毫升pET-2P和L4440表达载体诱导菌液可发酵产生8.7～24.39 μg、7.48～22.47μgdsgfp.[结论]提取pET-2p和L4440表达的dsgfp,其中酚氯仿法可用于快速提取高质量、高纯度原核表达的dsgfp,pET-2p为dsgfp最优表达载体.
原核 双链RNA 提取 降解