采用RT-PCR方法克隆到绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)的cDNA序列,测序后构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上,转化酿酒酵母,转化子用2%的β-D-半乳糖进行诱导,用Northern杂交、刚果红染色法和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测.结果表明,EGⅠ的cDNA基因开放阅读框长度为1 377 bp,编码459个氨基酸,推测蛋白质分子量为48.1 kD.刚果红染色显示,转化子可产生明显的水解圈;CMC酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EGⅠ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在培养60 h达到最高0.06U/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.4.
绿色木霉 葡聚糖内切酶Ⅰ 酿酒酵母 表达