体外胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型.试验旨在探讨视黄酸(retinoic acid,RA)诱导鸡胚胎干细胞(chicken embryonic stem cells,cESCs)向雄性生殖细胞(male germ cells,MGCs)分化的作用效果.利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维(chicken embryo fibroblast,CEF)细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色和胚胎阶段特异性表面抗原(embryo specific surface antigen 1,SSEA-1)检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定.结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性.采用10-5 mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达.结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrinα6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆.本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性.10-5 mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考.
鸡胚胎干细胞 雄性生殖细胞 体外培养 性别鉴定 视黄酸(RA) 诱导分化