目的:考察联用谷胱甘肽-S-转硫酶(Glutathione-S-transferase,GST)产物抑制反应过程分析法和初速度法测定GST活性的有效性.方法:阳离子交换层析纯化猪肝碱性GST同工酶.在25℃,用1.0 mmol/L 2,4-二硝基氯苯(1-Chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)和50.0 mol/L谷胱甘肽(Glutathione,GSH)跟踪产物在340 nm吸收的变化.5.0 min内底物消耗比例低于设定界限时测定初速度;否则,用以反应时间为自变量且包含产物抑制的积分速度方程分析反应过程确定最大反应速度,再换算成优化GSH浓度下的初速度.结果:优化GST产物抑制常数后,只要被分析数据中GSH消耗55%以上,所得最大反应速度对被分析数据范围不敏感.用48 mol/L GSH将最大反应速度换算成初速度,联用策略所得GST活性的线性下限略高于初速度法,而线性上限提高4倍.结论:用积分速度方程分析酶反应过程并优化最大速度换算成初速度所需底物浓度,联用策略测定酶活性线性范围更宽,有望成为测定酶活性的新方法.
谷胱甘肽-S-转硫酶 积分速度方程 反应曲线 联用策略 线性范围