目的 构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因过表达质粒,体外转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并观察其表达和定位.方法 根据PubMed数据库中GRP78基因信息,设计引物,采用PCR扩增其基因片段;运用基因重组方法双酶切目的基因,并分别将其克隆至含有绿色荧光蛋白(GFP)的pLVX-IRES-ZsGreen1载体以及含有Flag标签的CMV-10载体,经酶切、测序对重组质粒进行鉴定.转染成功构建的质粒至HUVECs,免疫荧光染色法观察蛋白表达和定位,Western blotting验证蛋白过表达情况.结果 酶切和测序鉴定表明成功构建pLVX-GRP78-IRES-ZsGreen1以及CMV-Flag-GRP78的基因重组质粒;将成功构建的pLVX-GRP78质粒转染至HUVECs,可观察到大量绿色荧光表达;将成功构建的Flag-GRP78质粒转染至HUVECs,免疫荧光检测表明Flag-GRP78蛋白表达定位于内质网;Western blotting证实pLVX-GRP78和Flag-GRP78成功过表达.结论 成功构建pLVX-GRP78、Flag-GRP78重组质粒,转染HUVECs并观察到其内质网定位.
葡萄糖调节蛋白78 质粒构建 人脐静脉内皮细胞 内质网