黄海黄杆菌YS-9412-130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体DNA用Sau 3AⅠ部分酶切后，低熔点琼脂糖回收2-10Kb的DNA片段，用Klenow大片段酶半补齐，与用SalⅠ酶切且半补齐的质粒pUC19连接后，转化E.Coli.JM109，构建基因文库。用酪蛋白平板法和酶联免疫吸附（ELISA）的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆（命名为pHH1）。序列测定分析表明，此重组质粒包含有长度为768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架（ORF）和上游基因调控序列。此片段编码由256个氨基酸组成的酶，计算分子量为33 000Dal。通过Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌YS-9412-130基因组DNA。
低温碱性蛋白酶 基因克隆 序列测定