本文的主要目标是建立绵羊胞内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI).并且尝试了ICSI技术生产绵羊转基因胚胎的可能性.实验1比较了绵羊卵母细胞孤雌激活的3种化学方法.结果显示,Ionomycin/3 h/6-dimethylaminopurine(6-DMAP)和Ionomycin激活胚的卵裂率(71.7%和91.8%)和囊胚率(17.4%和11%)显著(p＜0.01)高于Ca2+激活胚(18.4%和0).Ionomycin/3 h/6-DMAP激活胚的囊胚发育形态和比例相对较高.实验2中,活精子注射至卵母细胞质后,用Ionomycin/3 h/6-DMAP激活,排出第二极体(PB2)的71枚ICSI胚胎用SOFaaBSA溶液培养,卵裂率为71.8%(51/71),显著(p＜0.01)高于体外受精(41.4%,IVF)和阴性对照胚胎(30.2%,sham-ICSI).培养7天后,sham-ICSI组没有囊胚生成;ICSI和IVF胚胎的囊胚率分别为7.0%(5/71)和16.1%(9/56),两者差异不显著(p＞0.05).这些ICSI囊胚在冷冻前后均能孵化,显示初步建立了绵羊ICSI技术.另外,我们探索了ICSI技术生产转基因胚胎的可能性,-20℃冻融1次的死精子与pEGFP-N1质粒共注射,33枚2-细胞期ICSI胚胎中,2枚可见GFP蛋白.其中1枚停止发育,另外1枚继续发育至16-细胞期,仍然可见GFP基因的表达.4枚解冻的ICSI囊胚手术移植给2只发情同期化受体绵羊,60天时,B超未见怀孕.本文初步结果表明,ICSI技术生产转基因绵羊有可能性,需深入研究.
绵羊 孤雌激活 ICSI 转基因 胚胎