在利用Klebsiella pneumoniae M5aL厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇的过程中,一部分甘油通过氧化代谢途径经醛脱氢酶(ALDH)催化合成大量副产物乙醇,降低了1,3-丙二醇的产量和得率.首次以醛脱氢酶ALDH为改造目标,利用同源重组技术获得了ALDH基因敲除的K.pneumoniae重组菌.首先,采用PCR的方法分别从K. pneumoniae M5aL基因组DNA及质粒pBR322上扩增得到ALDH基因和四环素抗性基因(Tcr);然后将ALDH基因定向插入到质粒pUC18的多克隆位点得到中间载体pUC18-ALDH,该载体与Tcr基因分别用AvaI和BsaAI双酶切后进行连接,得到ALDH基因敲除的重组载体pUCAT;经DNA测序及限制性酶切电泳分析,构建的载体由5′ALDH-Tcr-3′ALDH-pUC18组成,与设计结果相符;最后,利用该载体通过同源重组技术得到两株K. pneumoniae重组菌0623-1hb及0623-1hc,经菌落PCR及酶活鉴定,两株菌的ALDH基因均已缺失.与出发菌株K.pneumonaie M5aL相比,重组菌的乙醇合成浓度降低了43%～53%,1,3-丙二醇合成浓度提高了27%～42%.
醛脱氢酶 1 3-丙二醇 乙醇 克氏肺炎杆菌 基因敲除