目的 通过构建维生素D受体(VDR)基因特异性siRNA(small interfering RNA)真核表达载体,检测其对血管内皮细胞(EC)中VDR基因的沉默作用,为进一步探讨VDR与心血管疾病发生发展关系的研究奠定基础.方法 构建小鼠VDR特异性siRNA表达栽体并测序,进行人EC/鼠EC的培养,进行siRNA转染试验,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率,Western blot进行鉴定.结果针对VDR基因的4个不同位点,设计、构建了4个siRNA干扰载体,经测序,序列全部正确.成功完成了人EC/鼠EC的培养及转染,荧光显微镜观察发现转染的重组质粒在EC内出现不同的转染效率,1号质粒的转粢效率约为65%,2号质拉的转染效率约为50%,3、4号质粒的转染效率比较低.取转染效率较高的1、2号质粒做进一步转染干预,转染72h后,采用Westem blot方法检测人EC/鼠EC内VDR蛋白质表达,与空白对照组比较,1、2号质粒在人EC中对VDR的表达无明显抑制作用,而在鼠EC中则有明显抑制作用,其中以1号质粒抑制效果最为明显,目的 蛋白10D/内参蛋白10D比值发现两干扰组在人EC中对VDR的表达无明显抑制作用.而在鼠EC中则有明显抑制作用,其中以1号干扰质粒抑制效果最明显,抑制率达到了70%.结论成功完成了人EC/鼠EC的培养、转染及转染干预,并行Westem bloI鉴定,发现抑制效率明显的为鼠EC 1号质粒组.表明针对鼠VDR基因的siRNA表达载体有很强的特异性,并且对VDR基因干扰的位点不同表现的抑制效应不一.
维生素D受体 血管内皮细胞 转染 质粒