为降低体外扩增DNA而引入随机突变的风险,仅通过PCR在CDK2序列5′端接入连接序列.由于双BamHⅠ位点的干扰,cyclin E与CDK2序列无法依次插入载体,故采用双片段连接法将两者一起连接插入质粒载体以构建融合基因;采用相似策略,用CDK2突变体序列替换融合基因中对应野生型序列以构建融合基因突变体.两组双片段连接物转化感受态大肠杆菌后均能筛选出若干菌落,并成功鉴定出目标克隆.双片段连接法突破了严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,拓宽了酶切-连接法拼接DNA片段的适用范围.据此可充分利用现有条件,通过灵活置换DNA片段简化融合基因及其突变体克隆流程.
基因克隆 融合基因 双片段连接法 周期蛋白E 周期蛋白依赖性激酶2