本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子,成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达,通过LB培养基发酵42 h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56 mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-Rh1AB,Pf-5/pBBR1-kan-Plac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135 mg/L,441.135 mg/L,557.764 mg/L,启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍.对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物.并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量,发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhIAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍.本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高,可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考.
RhlAB P.protegens Pf-5 Red/ET同源重组 鼠李糖脂