通过对近平滑假丝酵母(R)-专一性羰基还原酶(rCR)进行氨基酸序列分析并根据其序列的保守性设计PCR引物,以近平滑假丝酵母基因组为模板利用PCR技术得到目的基因rcr.该基因全长1011bp,共编码336个氨基酸.将该基因与表达载体pET21c连接后构建重组质粒pETRCR,并转化入Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达.重组大肠杆菌具有(R)-专一性羰基还原酶活性,可催化不对称还原2-羟基苯乙酮合成(R)-苯基乙二醇.研究发现,在重组菌培养过程中,同添加IPTG诱导培养的情况相比,不添加IPTG诱导培养的酶活及不对称转化(R)-苯基乙二醇的效果较好.在反应过程中,转化48 h及在pH值 8～9的条件下更有利于不对称反应的进行.另外,较高的底物浓度会对反应产生抑制作用,通过提高重组菌细胞浓度可显著提高转化效果.在5 g/L的底物浓度条件下,利用0.3 g/mL重组菌细胞可还原2-羟基苯乙酮得到(R)-苯基乙二醇,产物光学纯度为95.5% e.e,产率为92.6%.
羰基还原酶 不对称还原 重组大肠杆菌 苯基乙二醇