目的 探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号转导通路在转化生长因子β1(TGF-β1)引起骨髓间充质干细胞(BMSCs)Snail表达改变中的调控作用. 方法 采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠BMSCs,用免疫荧光法对培养第3代的细胞进行鉴定.应用Western blotting检测TGF-β1对p-ERK1/2及p-Akt表达的影响,以不同浓度ERK特异性抑制剂(PD98059)或PI3K通路特异性抑制剂(Wortmannin)干预后检测BMSCs ERK、Akt磷酸化水平变化,确定PD98059和Wortmannin分别抑制Snail诱导的BMSCs ERK和Akt磷酸化的有效浓度,进而用RT-PCR、Western blotting技术证实TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞Snail mRNA及蛋白表达的影响. 结果 密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠BMSCs,免疫荧光检测显示,培养的细胞CD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性;Western blotting分析显示,TGF-β1作用6h后BMSCs p-Akt和p-ERK水平较对照组明显增高;Wortmannin和PD98059可分别以剂量依赖性抑制BMSCs p-Akt和p-ERK水平;可有效抑制TGF-β1诱导的BMSCs ERK及Akt的磷酸化,PD98059和Wortmannin相应浓度分别为30 μmol/L和40 nmol/L.PD98059(30 μmol/L)、Wortmannin(40 nmol/L)明显抑制了TGF-β1诱导的Snail mRNA及蛋白水平,而两者联合应用对骨髓间充质干细胞Snail mRNA及蛋白表达的抑制作用具有协同作用,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 TGF-β1能促进BMSCs的Snail的转录及蛋白的表达,且ERK1/2及PI3K转导通路的激活在此过程中具有调控作用.
骨髓间充质干细胞 转化生长因子β1 Snail 细胞外信号调节激酶1/2 磷脂酰肌醇3-激酶 免疫印迹法 大鼠