滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是一种基于病毒DNA复制而发明的新技术.近些年,RCA技术已经被广泛应用于微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)的检测.在miRNA检测研究领域中,鉴别高度同源的家族miRNAs成为该研究领域的瓶颈.本研究引入新型的RCA技术来增加鉴别的灵敏度和特异性,进一步提高家族miRNA鉴别的灵敏度,滚环扩增的程度用相对荧光强度来表示.研究结果显示,T4 RNA连接酶2可在RCA的环化过程中实现最大的环化效率,从而提高RCA的检测特异性.本文利用优化的RCA技术,实现对let 7高度同源的家族miRNAs高灵敏度的鉴别,灵敏度可达5 fmol.let 7a的滚环探针对Let 7a这一miRNA扩增后的相对荧光强度为1 550,而对其他的家族miRNA相对荧光强度仅为260.其他的家族miRNA探针在鉴别时相对荧光强度也显示了较大的差异.而依靠传统的RT-qPCR方法的鉴别灵敏度是4 pmol,与本研究相比,灵敏度低了近1 000倍.本研究的结果表明,利用RCA技术鉴别高度同源性miRNAs是高效灵敏的,此前未见相关研究的报道.RCA技术可能被应用于miRNA高灵敏度检测和鉴别的相关研究中.
滚环扩增 高灵敏度 微小RNA检测