目的:构建线粒体靶向KillerRed(KR)重组表达载体,探讨可见光照射诱导活性氧(ROS)生成规律及其增强电离辐射对HeLa细胞的增殖抑制作用.方法:利用基因重组技术构建线粒体靶向重组载体plxsp-flag-Sarm1-KR和plxsp-flag-Sarm1-mCherry.将宫颈癌HeLa细胞分为对照组、plxsp-flag组、plxsp-flag-Sarm1-KR组、4 Gy组、plxsp-flag+4 Gy组和plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组.细胞转染24 h后,利用荧光显微镜检测mCherry蛋白和细胞色素C氧化酶Ⅳ(COXⅣ)蛋白表达水平;可见光照射后利用DCFH-DA探针检测平均荧光强度(MFI),表示ROS生成水平;4 Gy X射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性.结果:构建载体经测序鉴定并与GenBank序列比对,表明线粒体靶向融合表达载体plxsp-flag-Sarm1-KR(mCherry)构建成功.转染HeLa细胞后,荧光显微镜下可见mCherry蛋白与线粒体示踪COXⅣ蛋白具有相同的定位.ROS生成水平,对照组和plxsp-flag组在可见光照射10、30和60 min后掺入探针,掺入探针10、30和60 min后MFI无明显变化(P>0.05);plxsp-flag-Sarm1-KR组MFI呈时间依赖性增加,与对照组比较,plxsp-flag-Sarm1-KR组可见光照射10和30 min后掺入探针,掺入探针60 min后MFI明显增加(P<0.05);可见光照射60 min后掺入探针,掺入探针30和60 min后plxsp-flag-Sarm1-KR组MFI明显降低(P<0.05).与对照组比较,plxsp-flag组细胞增殖活性无明显变化(P>0.05),10和24 h时plxsp-flag-Sarm1-KR组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),10 h时4 Gy组和plxsp-flag+4 Gy组细胞增殖活性明显降低(P<0.01),10、24和48 h时plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组细胞增殖活性明显降低(P<0.05或P<0.01);与plxsp-flag-Sarm1-KR组和4 Gy组比较,plxsp-flag-Sarm1-KR+4 Gy组细胞增殖活性明显降低(P<0.05).结论:成功构建线粒体靶向融合表达载体,所介导的KR蛋白可以诱导ROS产生,并且增强电离辐射对HeLa细胞的增殖抑制作用.
线粒体 活性氧 KillerRed 电离辐射 细胞增殖