试验旨在克隆中国荷斯坦奶牛CC趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type 5,CCR5)基因,对其进行生物信息学分析,并探究CCR5基因在奶牛炎性和健康组织中的表达水平.采用PCR技术扩增并克隆荷斯坦奶牛CCR5基因CDS区全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑方法筛选阳性克隆并测序,对序列进行相似性比对及系统进化树构建;应用多种在线生物信息学软件对其编码蛋白进行分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测CCR5基因在健康和炎症奶牛乳腺组织中的表达情况.结果 显示,中国荷斯坦奶牛CCR5基因CDS区全长1059 bp,编码352个氨基酸.相似性和遗传进化分析结果显示,奶牛CCR5基因与绵羊的遗传距离最近,高达96.0％,与鸡遗传关系最远,为61.0％,且在不同物种之间CCR5基因高度保守.中国荷斯坦奶牛CCR5蛋白分子质量为40.235 ku,理论等电点(pI)为9.30,为疏水性蛋白但不是分泌蛋白,主要存在于细胞质内;在CCR5蛋白二级结构中α-螺旋和无规则卷曲分别占51.14％和32.95％,三级结构模型预测结果与二级结构一致.实时荧光定量PCR结果显示,CCR5基因在健康奶牛乳腺组织中的表达量极显著低于炎性奶牛乳腺组织(P＜0.01),提示其可能参与奶牛乳腺炎的发生过程.本试验结果为进一步研究奶牛CCR5蛋白的功能提供了理论依据,对探究奶牛CCR5基因在奶牛乳腺炎中的调控功能等具有重要意义.
中国荷斯坦奶牛 CCR5基因 克隆 生物信息学分析 表达