c型溶菌酶是鱼类在先天性免疫机制中抵抗细菌感染的关键性免疫蛋白.鲤鱼(Cyprinus carpio)c型溶菌酶具有鱼类c型溶菌酶的基本特征:N端含有信号肽;C端成熟肽中的Glu35和Asp51构成酶的活性位点,并含有8个保守的半胱氨酸残基.本研究通过反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)获得鲤鱼c型溶菌酶成熟肽的cDNA,该序列全长381 bp,编码由127个氨基酸残基组成的成熟肽;通过PCR在其5'端添加限制性内切酶XhoⅠ位点和6×His标签、3'端添加XbaⅠ位点;获得的目的基因,即鲤鱼c型溶菌酶基因(common carp c-type lysozyme,CLYc),与表达载体pPICZαA连接后电转至毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33,通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子;在29℃、250 r/min条件下,使用1.5％甲醇诱导表达120 h,表达上清液经固化金属离子亲和层析(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)纯化,获得分子量为15.4 kD的重组蛋白,表达量约为40 mg/L;Western blot分析和MALDI-TOF/TOF质谱鉴定表明该重组蛋白为预期的目的重组蛋白CLYc.抑菌试验证明,含重组CLYc的培养上清液对革兰氏阳性的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及革兰氏阴性的大肠杆菌(Escherichia coli)和副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)具有明显的抑菌活性;纯化的重组CLYc对单增李斯特菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌和副溶血性弧菌显示了相同的最小抑菌浓度.本研究结果为鱼类来源的天然抗菌剂的开发和生产提供了技术途径.
鲤鱼 c型溶菌酶 成熟肽 毕赤酵母 重组表达 抗菌活性