目的建立一种对神经细胞中的磷酸化蛋白质进行分离分析的方法.方法培养新生乳小鼠神经细胞,加入32P-NaH2PO4 2.78×106 Bq/ml,37 ℃孵育1.5 h.刺激组分别加入表皮生长因子(EGF)20 ng/ml或胰岛素100 nmol/L,对照组加入等量的培养基,作用不同时间后液氮终止反应.裂解细胞,用Bio-Rad DC Protein Assay kit测定细胞蛋白质含量,双向电泳分离细胞蛋白.放射自显影.结果①双向电泳自显影图谱显示近数十个蛋白质斑点,绝大部分集中于pH偏酸性和中性区域,pH 4.6～6.5,其相对分子质量主要介于20×103～130×103之间.②EGF、胰岛素刺激不同时间后虽出现有磷酸化蛋白质斑点的增加或消失,但更多表现为某些磷酸化蛋白质斑点灰度的增强或减弱.③对比分析发现,放射自显影图谱中只有少数斑点出现在双向电泳Coomassie Brilliant Blue R-250染色图谱中,提示神经细胞中的大多数磷酸化蛋白质为低丰度蛋白.结论采用本研究建立的双向电泳和放射自显影技术可对神经细胞中的蛋白质可逆磷酸化修饰状态进行较为全面、动态的分析,方法灵敏、特异性强,可为细胞信息传递功能蛋白质组的研究奠定了基础.
磷酸化修饰 双向电泳 放射自显影 蛋白质组