Proximity ligation assay
پراکسیمیٹی لائیگیشن اسیسے (ان سیٹو پی ایل اے) ایک ایسی ٹیکنالوجی ہے جو روایتی امیونواسس کی صلاحیتوں کو بڑھاتی ہے جس میں پروٹین کا براہ راست پتہ لگانا، پروٹین کے تعاملات، ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز اور اعلی خاصیت اور حساسیت کے ساتھ پوسٹ ٹرانسلیشنل ترمیم شامل ہیں۔ پروٹین کے اہداف کا آسانی سے پتہ لگایا جا سکتا ہے اور واحد مالیکیول ریزولوشن کے ساتھ مقامی بنایا جا سکتا ہے اور غیر تبدیل شدہ خلیوں اور بافتوں میں معروضی طور پر مقدار کی جا سکتی ہے۔ صرف چند خلیوں کا استعمال کرتے ہوئے، ذیلی سیلولر واقعات، یہاں تک کہ عارضی یا کمزور تعاملات، سیٹو میں ظاہر ہوتے ہیں اور خلیوں کی ذیلی آبادی میں فرق کیا جا سکتا ہے۔ گھنٹوں کے اندر، روایتی شریک امیونوپریسیپیٹیشن اور شریک لوکلائزیشن تکنیک کے نتائج کی تصدیق کی جا سکتی ہے۔ پی ایل اے کا اصول مختلف انواع میں پیدا ہونے والے دو بنیادی اینٹی باڈیز دلچسپی کے پروٹین پر ہدف اینٹیجن کو پہچانتے ہیں (شکل 1)۔ ثانوی اینٹی باڈیز (2o Ab) مختلف بنیادی اینٹی باڈیز کے مستقل علاقوں کے خلاف ہدایت کی جاتی ہیں، جنہیں پی ایل اے پروبز کہا جاتا ہے، بنیادی اینٹی باڈیز سے جڑے ہوتے ہیں (شکل 2)۔ پی ایل اے تحقیقات میں سے ہر ایک کے ساتھ ایک مختصر ترتیب مخصوص ڈی این اے اسٹرینڈ منسلک ہوتا ہے۔ اگر پی ایل اے تحقیقات قربت میں ہیں (یعنی، اگر دلچسپی کے دو اصل پروٹین قربت میں ہیں، یا پروٹین کمپلیکس کا حصہ ہیں، جیسا کہ اعداد و شمار میں دکھایا گیا ہے)، ڈی این اے اسٹرینڈز دو دیگر ترتیب کے اضافے پر رولنگ سرکل ڈی این اے کی ترکیب میں حصہ لے سکتے ہیں۔ مخصوص ڈی این اے اولیگونیوکلیوٹائڈز مناسب سبسٹریٹس اور انزائمز کے ساتھ مل کر (شکل 3)۔ ڈی این اے کی ترکیب کے رد عمل کے نتیجے میں ڈی این اے کے دائرے میں کئی سو گنا اضافہ ہوتا ہے۔ اس کے بعد، فلوروسینٹ لیبل والے تکمیلی اولیگونیوکلیوٹائڈ تحقیقات کو شامل کیا جاتا ہے، اور وہ امپلیفائیڈ ڈی این اے (شکل 4) سے جڑے ہوتے ہیں۔ فلوروسینس مائکروسکوپ سے دیکھنے پر فلوروسینس کا نتیجے میں اعلی ارتکاز ایک الگ روشن مقام کے طور پر آسانی سے نظر آتا ہے۔ دکھائے گئے مخصوص معاملے میں (شکل 5)، نیوکلئس بڑھا ہوا ہے کیونکہ یہ بی سیل لیمفوما سیل ہے۔ دلچسپی کے دو پروٹین بی سیل ریسیپٹر اور ایم وائی ڈی 88 ہیں۔ سائٹوپلازم میں تعامل کی تلاش دلچسپ تھی کیونکہ بی سیل ریسیپٹرز کو سیل جھلی میں واقع سمجھا جاتا ہے۔ ایپلی کیشنز پی ایل اے جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے بہت سے دوسرے موضوعات کے درمیان جانوروں کی نشوونما اور چھاتی کے کینسر کے پہلوؤں کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ آئی ایچ سی کے مقابلے میں مختلف فوائد کے ساتھ انسانی بافتوں میں اینٹی باڈی کی توثیق پر ان سیٹو قربت لائیگیشن اسیسز (آئی ایس پی ایل اے) کا اطلاق کیا گیا ہے، جس میں پتہ لگانے کی خاصیت میں اضافہ، غیر مخصوص داغ میں کمی، اور بہتر لوکلائزیشن شامل ہیں۔ پروٹین اور آر این اے کی ایسوسی ایشن کا مطالعہ کرنے کے لیے تکنیک کی ایک تغیر (آر آئی ایس ایچ-پی ایل اے) کا استعمال کیا گیا ہے۔ ان سیٹو پی ایل اے کی ایک اور تبدیلی میں ایک ملٹی پلیکس پی ایل اے جانچ شامل ہے جو متوازی طور پر متعدد پروٹین کمپلیکس کا تصور کرنا ممکن بناتا ہے۔ پی ایل اے کو دیگر پڑھنے والی شکلوں جیسے ایلیسا، فلو سائٹومیٹری کے ساتھ بھی جوڑا جا سکتا ہے۔ اور ویسٹرن بلاٹنگ حوالہ جات بائیو کیمسٹری کا پتہ لگانے کے رد عمل امیونولوجک ٹیسٹ