Combined bisulfite restriction analysis
مشترکہ بیسلفائٹ پابندی تجزیہ (یا کوبرا) ایک سالماتی حیاتیات کی تکنیک ہے جو جینومک ڈی این اے کے ایک چھوٹے سے نمونے میں ڈی این اے کی ترتیب پر ایک مخصوص جینومک لوکس پر ڈی این اے میتھیلیشن کی سطح کی حساس مقدار کی اجازت دیتی ہے۔ یہ تکنیک بیسلفائٹ سیکوینسنگ کی ایک تغیر ہے، اور پابندی کے ہاضمے کے ساتھ بیسلفائٹ تبادلے پر مبنی پولیمریز چین رد عمل کو جوڑتی ہے۔ اصل میں مائکروڈسیسیکٹڈ پیرافن-ایمبیڈڈ ٹشو کے نمونوں سے جینومک ڈی این اے کی منٹ کی مقدار کو قابل اعتماد طریقے سے سنبھالنے کے لیے تیار کی گئی، اس تکنیک کے بعد سے کینسر کی تحقیق اور ایپیجینٹکس کے مطالعے میں اس کا وسیع پیمانے پر استعمال دیکھا گیا ہے۔ پروسیجر بیسلفائٹ ٹریٹمنٹ دلچسپی کے جینومک ڈی این اے کا علاج سوڈیم بیسلفائٹ کے ساتھ کیا جاتا ہے، جو میتھیلیشن پر منحصر ترتیب کے فرق کو متعارف کراتا ہے۔ سوڈیم بیسلفائٹ علاج کے دوران، غیر میتھیلیٹڈ سائٹوسین کے باقیات کو یوراسل میں تبدیل کر دیا جاتا ہے، جبکہ میتھیلیٹڈ سائٹوسین کے باقیات متاثر نہیں ہوتے ہیں۔ پی سی آر ایمپلیفیکیشن بیسلفائٹ علاج شدہ ڈی این اے کو پھر پی سی آر ایمپلیفایڈ کیا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں سائٹوسین کے باقیات اصل میں میتھیلیٹڈ پوزیشنوں پر ہوتے ہیں، اور تھامین کے باقیات اصل میں غیر میتھیلیٹڈ پوزیشن پر ہوتے ہیں (جو یوراسل میں تبدیل ہو گئے تھے)۔ اس مرحلے کے دوران استعمال ہونے والے پرائمرز میں سی پی جی سائٹس (سائٹوسین میتھیلیشن کا مشترکہ ہدف) نہیں ہوتے ہیں، لہذا امپلیفیکیشن کا عمل میتھیلیشن کی حیثیت کی بنیاد پر ٹیمپلیٹس کے درمیان تفریق نہیں کرتا ہے۔ اگلے مرحلے میں مکمل ہاضمہ کو یقینی بنانے کے لیے پی سی آر مصنوعات کو صاف کیا جاتا ہے۔ ریسٹریکشن ڈائجسٹ مندرجہ بالا اقدامات میتھیلیشن پر منحصر برقرار رکھنے یا سی پی جی پر مشتمل پابندی والے انزائم سائٹس کے نقصان کا باعث بنتے ہیں، جیسے کہ ٹاک آئی (ٹی سی جی اے) اور بی ایس ٹی یو آئی (سی جی سی جی) کے لیے، اس بات پر منحصر ہے کہ سائٹوسین کے باقیات بالترتیب اصل میں میتھیلیٹڈ تھے یا نہیں۔ مندرجہ بالا مرحلے میں میتھیلیشن-آزاد امپلیفکیشن کی وجہ سے، نتیجے میں پی سی آر مصنوعات ان ٹکڑوں کی مخلوط آبادی ہوں گی جنہوں نے سی پی جی پر مشتمل پابندی والے انزائم سائٹس کو کھو دیا ہے یا برقرار رکھا ہے، جن کی متعلقہ فیصد براہ راست نمونے ڈی این اے میں ڈی این اے میتھیلیشن کی اصل سطح سے منسلک ہوں گی۔ اس کے بعد پی سی آر مصنوعات کا علاج ایک پابندی والے انزائم سے کیا جاتا ہے (مثال کے طور پر۔ بی ایس ٹی یو آئی)، جو صرف ان سائٹس کو الگ کرے گا جو اصل میں میتھیلیٹڈ (سی جی سی جی) تھیں، جبکہ ایسی سائٹس کو چھوڑ دیں گی جو اصل میں غیر میتھیلیٹڈ (ٹی جی ٹی جی) تھیں۔ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ تمام سی پی جی سائٹس کو اصل میں میتھیلیٹ ہونے کی وجہ سے برقرار رکھا جاتا ہے، اور نامکمل بیسولفائٹ تبدیلی کے بقیہ حصے کی وجہ سے نہیں، ایک کنٹرول ڈائجشن کیا جاتا ہے، جس میں ایچ ایس پی 92 II جیسے انزائم ہوتے ہیں جو سی اے ٹی جی کی ترتیب کو تسلیم کرتے ہیں، جن میں سے کوئی بھی بیسولفائٹ تبدیلی کے بعد باقی نہیں رہنا چاہیے (غیر سی پی جی میتھیلیشن کے نایاب استثناء کے ساتھ) اور اس طرح اگر بیسولفائٹ تبدیلی مکمل ہو جائے تو کوئی کلیویج نہیں ہونا چاہیے۔ مقدار پھر ہضم شدہ ٹکڑوں کو پولی ایکریلیمائڈ جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے الگ کیا جاتا ہے جس میں بینڈ کی متوقع ظاہری شکل ایک بڑے غیر ہضم شدہ ٹکڑے سے مطابقت رکھتی ہے، اور متعدد چھوٹے بینڈ جو ہضم شدہ ٹکڑوں سے مطابقت رکھتے ہیں۔ ان بینڈوں میں ڈی این اے کی مقداری مقدار کا تعین فاسفو امیجر جیسے آلے سے کیا جا سکتا ہے، جس کے بعد اصل نمونے کے میتھیلیشن فیصد کا حساب اس طرح لگایا جا سکتا ہے: استعمال اور ایپلی کیشنز کوبرا کو بہت سی تحقیق پر مبنی ایپلی کیشنز میں بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے جیسے کینسر کے مطالعے میں جین پروموٹروں پر ڈی این اے میتھیلیشن تبدیلیوں کی اسکریننگ، امپرنٹڈ جینوں پر تبدیل شدہ میتھیلیشن پیٹرن کا پتہ لگانا، اور ممالیہ جانوروں میں نشوونما کے دوران جینوم میں میتھیلیشن پیٹرن کی خصوصیت۔ طب میں، کوبرا کو انسانی بیماری کی تشخیص میں مدد کے لیے ایک آلے کے طور پر استعمال کیا گیا ہے جس میں غیر معمولی ڈی این اے میتھیلیشن شامل ہے۔ محققین نے جینیاتی امپرنٹنگ ڈس آرڈر رسل سلور سنڈروم کی تشخیص میں اعلی کارکردگی والی مائع کرومیٹوگرافی کو ظاہر کرنے کے ساتھ مل کر کوبرا کا استعمال کیا جہاں امپرنٹڈ جین ایچ 19 کا ہائپومیتھیلیشن 50 فیصد تک مریضوں میں اس عارضے کا ذمہ دار ہے۔ طاقت سادہ، تیز اور سستی: کوبرا میں، ڈی این اے میتھیلیشن کی سطحوں کو آسانی سے اور تیزی سے ماپا جاتا ہے بغیر مشقت کے ذیلی کلوننگ اور ترتیب کی ضرورت کے، جیسا کہ بیسلفائٹ ترتیب کے ساتھ ہوتا ہے۔ جانچ سیدھی ہے اور معیاری سستے مالیکیولر بائیولوجی ریجینٹس کے ساتھ کی جا سکتی ہے۔ اعلی مطابقت: پی سی آر اور طہارت کے اقدامات کی وجہ سے، یہ طریقہ نہ صرف بہت کم مقدار میں جینومک ڈی این اے کے ساتھ کام کرتا ہے، بلکہ پیرافن کے ساتھ علاج کیے گئے نمونوں کے ساتھ بھی کام کرتا ہے، یہ دونوں ڈی این اے میتھیلیشن کوانٹیفیکیشن پروٹوکول جیسے سدرن بلاٹنگ اور میتھیلیشن حساس پابندی والے انزائم کے ہاضمے کے بعد پی سی آر میں مسائل ہو سکتے ہیں۔ مقداری: یہ میتھیلیشن مخصوص پی سی آر کے برعکس ہے، جو کہ معیاری ہے۔ کوبرا کے ساتھ، ڈی این اے میتھیلیشن کی سطح کو کسی دیئے گئے لوکس پر براہ راست مقدار میں شمار کیا جا سکتا ہے، جس سے فی جانچ میں مزید معلومات حاصل ہوتی ہیں۔ ہائی تھرو پٹ سیمپل پروسیسنگ کے لیے اسکیل ایبلٹی: کوبرا کے ساتھ، دلچسپی کے بہت سے علاقوں کو اسی پابندی والے انزائم کے ساتھ ہضم ہونے والے الگ الگ نمونوں میں متوازی طور پر پروسیس کیا جا سکتا ہے۔ یہ بیسلفائٹ ترتیب کے تجزیے کے برعکس ہے، جہاں ہر خطے کی فی لوکس بہت سے کلونوں کی ترتیب دے کر سختی سے جانچ کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، جس میں زیادہ وقت لگتا ہے۔ فی جانچ متعدد سوالات: میتھیلیشن کی حیثیت سے ایک ہی ہاضمہ جانچ میں متعدد سی پی جی پر مشتمل پابندی والے مقامات پر پوچھ گچھ کی جا سکتی ہے۔ کمزوریاں جانچ دلچسپی کے علاقے میں موجودہ پابندی والی سائٹوں کے استعمال تک محدود ہے، اور میتھیلیشن جو کسی مخصوص پابندی والی سائٹ کے تناظر میں نہیں ہوتی ہے اس کی جانچ نہیں کی جائے گی۔ پی سی آر کے بعد پابندی والے انزائموں کے ذریعے نامکمل ہاضمہ تجزیہ کو الجھ سکتا ہے: نامکمل ہاضمہ ڈی این اے میتھیلیشن کی کمی کا اشارہ دے گا (اگر میتھیلیشن حساس انزائم جیسے ایچ پی اے آئی کے ساتھ کاٹا جائے)۔ یہ بھی معلوم ہے کہ بی ایس ٹی یو آئی غیر تبدیل شدہ مقامات پر کٹوتی کر سکتا ہے، جس کی وجہ سے میتھیلیشن کی سطح کا حد سے زیادہ اندازہ لگایا جاتا ہے اور اس لیے اکثر ایچ پی اے آئی آئی کے استعمال کی ضرورت ہوتی ہے۔ پیچیدہ نمونوں میں، خلیے کی قسم کی ہیٹرجینیٹی تجزیہ کو الجھا سکتی ہے کیونکہ ڈی این اے کی ترتیب نہیں کی جا رہی ہے، نمونے میں مختلف خلیوں کی ترتیب میں ہیٹرجینیٹی (یعنی۔ ٹیومر کے اندر مختلف خلیوں کی آبادی) جنہوں نے پوچھ گچھ والے علاقے میں تغیرات حاصل کیے ہیں، جیسے کہ سی جی ڈینیوکلیوٹائڈ کو سی اے یا سی ٹی میں تبدیل کرنا، جس کے نتیجے میں پابندی والی جگہ کا نقصان ہوتا ہے جس کی وجہ سے ہاضمہ کی کمی کی وجہ سے بظاہر میتھیلیٹڈ علاقہ پیدا ہوتا ہے۔ یہ کسی دیئے گئے نمونے میں ڈی این اے میتھیلیشن کی سطح کی مقدار کو موڑ دے گا۔ متبادل عام طور پر، کوبرا کو اکثر دیگر ڈی این اے میتھیلیشن تجزیوں کے ساتھ ملایا جاتا ہے اور اکثر دلچسپی کے لوکی کی ابتدائی اسکریننگ میں استعمال کیا جاتا ہے۔ اگر کوبرا میتھیلیشن کے تبدیل شدہ نمونوں کی تجویز کرتا ہے، تو زیادہ سخت، محنت کش تکنیکوں کا اطلاق کیا جا سکتا ہے، جیسے بیسلفائٹ سیکوینسنگ یا ایم ای ڈی آئی پی۔ اس کے علاوہ ڈی این اے میتھیلیشن کا پتہ لگانے کے لیے پیک بائیو سیکوینسنگ کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ حوالہ جات سالماتی حیاتیات کی تکنیکیں