Intracellular delivery
انٹرا سیلولر ڈیلیوری زندہ خلیوں میں بیرونی مواد کو متعارف کرانے کا عمل ہے۔ خلیوں میں جو مواد پہنچائے جاتے ہیں ان میں نیوکلک ایسڈ (ڈی این اے اور آر این اے)، پروٹین، پیپٹائڈز، ناقابل تسخیر چھوٹے مالیکیولز، مصنوعی نینو میٹریلز، آرگنیلز، اور مائکرون پیمانے کے ٹریسرز، آلات اور اشیاء شامل ہیں۔ اس طرح کے مالیکیولز اور مواد کو سیلولر رویے کی تحقیقات، انجینئر سیل آپریشنز یا پیتھولوجیکل فنکشن کو درست کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے طبی استعمال وٹرو فرٹیلائزیشن (آئی وی ایف) اور ایم آر این اے ویکسین سے لے کر جین تھراپی اور سی اے آر-ٹی خلیوں کی تیاری تک ہوتے ہیں۔ صنعتی ایپلی کیشنز میں پروٹین کی پیداوار، بائیو مینوفیکچرنگ، اور پودوں اور جانوروں کی جینیاتی انجینئرنگ شامل ہیں۔ انٹرا سیلولر ڈیلیوری حیاتیات اور جینیات کے مطالعہ میں ایک بنیادی تکنیک ہے، جیسے کہ زندہ خلیوں میں پروٹین فنکشن کی تحقیقات کے لیے ڈی این اے پلاسمڈ ٹرانسفیکشن کا استعمال۔ انٹرا سیلولر ڈیلیوری انجام دینے کے لیے وسیع پیمانے پر نقطہ نظر موجود ہیں جن میں حیاتیاتی، کیمیائی اور جسمانی تکنیک شامل ہیں جو یا تو جھلی میں خلل ڈالنے یا کیریئرز میں ڈیلیوری مواد کی پیکیجنگ کے ذریعے کام کرتی ہیں۔ انٹرا سیلولر ڈیلیوری سیل بائیولوجی اور ٹیکنالوجی کے چوراہے پر ہے، اور اس کا تعلق سائنس اور طب کے بہت سے شعبوں سے ہے جن میں جینیات، بائیو ٹیکنالوجی، بائیو انجینئرنگ اور منشیات کی فراہمی شامل ہیں۔ ایپلی کیشنز جس طرح سے کمپیوٹر الیکٹرانک سگنلز کے ذریعے کام کرتے ہیں، خلیات پر عمل کرتے ہیں اور مالیکیولز کے ذریعے معلومات منتقل کرتے ہیں۔ خلیوں میں بھرے ہوئے مالیکیولز اور مواد پر منحصر ہے، مختلف نتائج یا ایپلی کیشنز حاصل کیے جا سکتے ہیں (مثال کے طور پر شکل "انٹرا سیلولر ڈیلیوری کی ایپلی کیشنز" دیکھیں)۔ ذیل میں کارگو مواد کی کچھ اہم درجہ بندی ہیں جو انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے ذریعے خلیوں کی تفتیش اور انجینئرنگ کے لیے استعمال ہوتی ہیں۔ کارگو کی اقسام نیوکلک ایسڈ ٹرانسفیکشن سے مراد نیوکلک ایسڈ کی انٹرا سیلولر ڈیلیوری ہے: ڈی این اے، آر این اے اور ان کے اینالاگس۔ نیوکلک ایسڈ کے مواد جو عام طور پر خلیوں میں منتقل ہوتے ہیں وہ پلازمیڈ ڈی این اے، ایم آر این اے، ایس آئی آر این اے، اور اولیگونیوکلیوٹائڈز ہیں۔ ٹرانسفیکشن ایپلی کیشنز 3 اہم شعبوں میں پھیلی ہوئی ہیں: بنیادی حیاتیاتی تحقیق، بائیو مینوفیکچرنگ، اور جین اور سیل پر مبنی تھراپی۔ بنیادی تحقیق میں، ٹرانسفیکشن سیل بائیولوجی اور جینیات سے لے کر امیونولوجی اور منشیات کی دریافت تک کے شعبوں میں ایک بنیادی تکنیک ہے۔ بائیو مینوفیکچرنگ میں، ٹرانسفیکشن کا استعمال ویکسین کے لیے پروٹین، اینٹی باڈیز، وائرل ویکٹرز اور وائرس جیسے ذرات کی تیاری کے لیے کیا جاتا ہے۔ سیل پر مبنی علاج میں ٹرانسفیکشن کا استعمال ایگز ویو جین تھراپی، ہیماٹوپوئیٹک اسٹیم سیل انجینئرنگ، انڈیوسڈ پلور پوٹینٹ اسٹیم سیلز کی تیاری، اور امیونو تھراپی کے لیے خلیوں کی ایگز ویو تیاری جیسے ایپلی کیشنز کے لیے کیا جاتا ہے۔ پچھلے 50 سالوں میں نیوکلک ایسڈ ٹرانسفیکشن انٹرا سیلولر ڈیلیوری کا سب سے عام ذیلی زمرہ رہا ہے۔ پلاسمڈ ڈی این اے کو 1970 کی دہائی کے آخر میں مائیکرو انجیکشن اور کیلشیم فاسفیٹ کے طریقوں کے ذریعے جین کے اظہار کے مقصد سے جانوروں کے خلیوں میں منتقل ہونا شروع ہوا۔ اس کے بعد سے، یہ کئی مطالعات میں جین اور پروٹین فنکشن کی تحقیقات کے لیے استعمال ہوتا رہا ہے۔ ڈی این اے پلازمیڈز جسمانی طور پر بڑے اور پیچیدہ مالیکیول ہوتے ہیں جن میں 5-10 کلو بیس پیئر پلازمیڈ> 100 این ایم قطر کا حل ہوتا ہے جب آزاد اور غیر سنکچڑ ہوتا ہے۔ اس کے باوجود، ان میں ترمیم اور تیاری کے لیے اچھی طرح سے قائم اور نسبتا کم لاگت والی تکنیکوں کی وجہ سے، وہ حیاتیاتی تحقیق میں بہت عام طور پر استعمال ہوتے رہے ہیں۔ 1970 کی دہائی میں یہ دکھایا گیا کہ ایم آر این اے کے مائیکرو انجیکشن کے نتیجے میں پروٹین کا اظہار ہوا۔ بعض حالات میں، ڈی این اے پلازمیڈز کے مقابلے میں پروٹین کے اظہار کو متاثر کرنے کے لیے ایم آر این اے ٹرانسفیکشن کو فائدہ مند سمجھا جاتا ہے کیونکہ مندرجہ ذیل وجوہات سے جینومک انضمام کا خطرہ کم ہوتا ہے، سائٹوسولک ڈیلیوری کافی ہونے کے ساتھ نیوکلیئر ڈیلیوری کی ضرورت نہیں ہوتی ہے، پروٹین کا اظہار خوراک پر منحصر اور تیز، کم زہریلا اور ڈی این اے ویکٹرز کے مقابلے میں امیونوجینک ہوتا ہے جب مناسب کیمیائی طور پر ترمیم کی جاتی ہے۔ اس طرح، زیادہ تر علاج کی ایپلی کیشنز کے لیے ایم آر این اے کو ڈی این اے سے بہتر آپشن سمجھا جاتا ہے حالانکہ یہ زیادہ مہنگا اور اندرونی طور پر غیر مستحکم ہے۔ اولیگونیوکلیوٹائڈز لمبائی میں 30 سے کم نیوکلیوٹائڈز کے ڈی این اے یا آر این اے کے سنگل یا ڈبل اسٹرینڈڈ سیکوینس ہوتے ہیں۔ چھوٹے مداخلت کرنے والے آر این اے (ایس آئی آر این اے) آر این اے کے مختصر 21-22 بیس جوڑی ڈوپلیکس ہوتے ہیں جنہیں جین کے اظہار کو خاموش کرنے کے لیے خلیوں میں منتقل کیا جا سکتا ہے۔ 1998 میں ان کی نوبل انعام یافتہ دریافت کے بعد سے، جین کی تقریب کو خراب کرنے کے لیے ہزاروں حیاتیاتی مطالعات میں ایس آئی آر این اے کو خلیوں میں منتقل کیا گیا ہے۔ انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے دلچسپی کے دیگر اولیگونیوکلیوٹائڈز میں اینٹی سینس اولیگونیوکلیوٹائڈز (اے ایس او)، مائیکرو آر این اے (ایم آئی آر این اے)، اور اپٹیمرز شامل ہیں۔ اس طرح کے اولیگونیوکلیوٹائڈز کو کئی مختلف میکانزم کے ذریعے خلیوں کے رویے کو تبدیل کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ لپڈ نینو پارٹیکلز اور الیکٹروپوریشن فی الحال نیوکلک ایسڈ ٹرانسفیکشن کے لیے وسیع پیمانے پر حکمت عملی ہیں۔ تاہم، بہت سے بنیادی خلیوں، اسٹیم خلیوں، مریض سے ماخوذ خلیوں اور نیوران میں موثر ٹرانسفیکشن ایک رکاوٹ بنی ہوئی ہے۔ حیاتیاتی تحقیق کرنے اور ایسے خلیوں میں ممکنہ طبی ایپلی کیشنز کو انجام دینے کی صلاحیت اکثر ٹرانسفیکشن کی کارکردگی اور علاج کے لیے رواداری کی وجہ سے محدود ہوتی ہے۔ مزید برآں، فی الحال انسانی جسم کے اندر خلیوں پر ٹرانسفیکشن انجام دینے کے طویل مدتی اثرات کے بارے میں ناقص تفہیم موجود ہے۔ پروٹین اور پیپٹائڈز زندہ خلیوں میں پروٹین کی فراہمی، جیسے جینوم میں ترمیم کرنے والے نیوکلیز، فعال روک تھام اینٹی باڈیز، یا محرک نقل و حمل کے عوامل، سیل فنکشن کو جوڑنے اور تجزیہ کرنے کے لیے ایک طاقتور ٹول سیٹ کی نمائندگی کرتے ہیں۔ مزید برآں، مؤثر انٹرا سیلولر ڈیلیوری قابل استعمال پروٹین ادویات کے ذخیرے کو بڑھا سکتی ہے کیونکہ زیادہ تر موجودہ پروٹین پر مبنی علاج بیرونی سیلولر اہداف کو نشانہ بناتے ہیں اور یہ موجودہ تحقیقی کوششوں کا ایک محاذ ہے۔ خلیوں میں صاف شدہ پروٹین کی فراہمی 1960 کی دہائی کے اوائل میں شروع ہوئی۔ مثالوں میں فیریٹن کے ساتھ مائکرو انجیکشن شدہ امیبا اور مویشیوں کے البیومین کے ساتھ مائکرو انجیکشن شدہ چوہے کے انڈے شامل ہیں۔ چونکہ پروٹین کے مختلف سائز، شکل اور چارج ہوتے ہیں، اس لیے انہیں آسانی سے خلیوں میں ایک سائز کے فٹ والے تمام حلوں کے ساتھ نہیں پہنچایا جا سکتا جو کیٹیانک لپڈ نیوکلک ایسڈ کی منتقلی کے لیے استعمال کرتے ہیں۔ اس کے برعکس، خلیوں میں پروٹین پہنچانے کے لیے متنوع طریقوں کا استعمال کیا گیا ہے جن میں مائیکرو انجیکشن، پنوسومز کا اوسموٹک لائسس، ہائپوٹونک شاک، سکریپ لوڈنگ، بیڈ لوڈنگ، سرنج لوڈنگ، ڈٹرجنٹ ایکسپوزر، الیکٹروپوریشن، سوراخ بنانے والے زہریلے مادے، خلیوں میں گھسنے والے پیپٹائڈز، نینو کیریئرز، خلیوں کو نچوڑنا، نینونیڈلز، صوتی خلل اور بخارات کے نینو بلبلے شامل ہیں۔ جینوم ایڈیٹنگ کے مقاصد کے لیے، ایس جی آر این اے کے ساتھ مل کر کاس 9 پروٹین کو الیکٹروپوریشن، مائیکرو انجیکشن، لپڈ نینو پارٹیکل فارمولیشن، اوسموٹک طور پر انڈیوسڈ اینڈوسیٹوسس کے بعد اینڈوسوم میں خلل، مائیکرو فلوئڈک اخترتی، اور خلیوں میں گھسنے والے پیپٹائڈز جیسے طریقوں کے ذریعے فراہم کیا گیا ہے۔ چھوٹے مالیکیولز چھوٹے مالیکیولز جن میں انٹرا سیلولر ڈیلیوری کی ضرورت ہوتی ہے ان میں شامل ہیں: ناقابل تسخیر چھوٹے مالیکیول ڈرگس، چھوٹے مالیکیول پروبز، اور کریوپروٹیکٹینٹس۔ سابقہ کی ایک مثال بلومیسن ہے، جو ایک کینسر مخالف دوا ہے جس کی مثبت چارج اور ہائیڈروفوبیسیٹی کی وجہ سے ناقص پارگمیتا ہے۔ الیکٹروپوریشن کے ساتھ انٹرا سیلولر ڈیلیوری انجام دینے سے، بلومیسن کی طاقت کو سو گنا سے زیادہ بڑھایا جا سکتا ہے۔ جہاں تک چھوٹے مالیکیول تحقیقات کا تعلق ہے، جب سیل کے اندرونی حصے میں پہنچائے جاتے ہیں، تو یہ مالیکیول سیلولر خصوصیات جیسے جھلی کی صلاحیت، پی ایچ، اور آئنوں کے ارتکاز کی اطلاع دینے کے قابل ہوتے ہیں۔ ایک مثال پی ایف بی آئی ہے، جو ایک فلوروسینٹ ڈائی ہے جسے انٹرا سیلولر پوٹاشیم کے ارتکاز کی پیمائش کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ آخر میں، کچھ کینڈیڈیٹ کریوپروٹیکٹینٹ مالیکیول جیسے کہ ناقابل تسخیر شکر انتہائی ہائیڈروفیلک ہوتے ہیں اور سیل میمبرینز میں پھیلنے کے لیے تیار نہیں ہوتے ہیں۔ مثال کے طور پر، ٹری ہیلوز (ایم ڈبلیو = 342 ڈی اے) ایک قدرتی ڈسیکرائڈ ہے جس کی ترکیب مختلف حیاتیات کے ذریعہ کی جاتی ہے تاکہ انہیں خشک ہونے یا منجمد ہونے کا مقابلہ کرنے میں مدد ملے۔ 200 ملی میٹر تک کے ارتکاز پر جانوروں کے خلیوں میں لدے ہوئے ٹریہالوز کو منجمد کرنے اور پگھلنے کے دوران بہترین کرائیوپروٹیکشن فراہم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ مائیکرو اسکیل میں مائیکرو اسکیل کارگو مواد کو مختلف ایپلی کیشنز کے لیے خلیوں میں کامیابی کے ساتھ پہنچایا گیا ہے۔ ایک صدی سے مائیکرو انجیکشن خلیوں میں مائیکرو اسکیل کارگو متعارف کرانے کا غالب طریقہ رہا ہے۔ ایک بہترین مثال مینڈک کے انڈے میں سومیٹک سیل نیوکلئس کا ٹرانسپلانٹ تھا تاکہ یہ ظاہر کیا جا سکے کہ انڈے میں داخل ہونے پر مکمل طور پر مختلف سومیٹک خلیوں سے نیوکلئس ایک نئے جانور میں ترقی کر سکتے ہیں۔ مائیکرو انجیکشن کا استعمال سب سے پہلے جانوروں میں آئی وی ایف کے تصور کے ثبوت کے طور پر انڈوں میں سپرم لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔ مصنوعی کروموسوم تیار کیے گئے ہیں اور تصور جین تھراپی کے ثبوت کے لیے مائیکرو انجیکشن کے ذریعے خلیوں میں منتقل کیے گئے ہیں۔ مائکرو انجیکشن کے ذریعے کئی خلیوں کی اقسام میں مائٹوکونڈریا کے ٹرانسپلانٹ کا بھی مظاہرہ کیا گیا ہے۔ حال ہی میں لیزر سے چلنے والے کھوپڑی کے بلبلوں کو خلیوں کی جھلی میں عارضی سوراخ کھولنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے جس کا مقصد بیکٹیریا اور مائٹوکونڈریا کی فراہمی ہے۔ مائکرو انجیکشن یا بیلسٹک پروپلشن کا استعمال کرتے ہوئے، مائکرون پیمانے کے ذرات، دائرے، اور موتیوں کو سیلولر مائکرو تھیولوجی کے مطالعے کے لیے خلیوں میں لوڈ کیا گیا ہے جو خلیوں کے اندرونی مکینیکل رویے کا اندازہ لگاتے ہیں۔ مثال کے طور پر، 5.6 مائیکرون تک کے مائیکرو انجیکٹڈ پیجیلیٹیڈ ٹریسر موتیوں کا استعمال کرتے ہوئے، یہ دکھایا گیا کہ موٹر سے چلنے والے سائٹوپلاسمک اختلاط نے چھوٹے اور بڑے دونوں سیلولر اجزاء کی انٹرا سیلولر حرکت کو کافی حد تک بڑھا دیا۔ دیگر انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے دلچسپی کے دیگر مواد میں کاربن نینو ٹیوبز، کوانٹم ڈاٹس، مقناطیسی نینو پارٹیکلز، اور نینو ڈیوائس شامل ہیں جو سینسر یا تحقیقات کے طور پر کام کرتے ہیں۔ طبی ایپلی کیشنز درج ذیل طبی علاج کی مثالیں ہیں جو کم از کم ایک مرحلے میں انٹرا سیلولر ڈیلیوری پر انحصار کرتی ہیں۔ ہیماٹوپوئیٹک سٹیم سیل پر مبنی جین تھراپی: اڈینوسین ڈیمینیز کی شدید مشترکہ امیونو ڈیفیشینسی (اے ڈی اے-ایس سی آئی ڈی) کے علاج کے لیے اسٹریمویلس، جو ایک فنکشنل اڈینوسین ڈیمینیز (اے ڈی اے) جین کی ایکس ویو گاما ریٹرو وائرل ویکٹر جین ڈیلیوری کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے (یورپی منظوری 2017 دی گئی)۔ اسٹریمویلس یورپی میڈیسن ایجنسی سے منظوری حاصل کرنے والی پہلی سابق ویو آٹولوگس جین تھراپی تھی۔ میٹا کرومیٹک لیوکوڈسٹروفی (ایم ایل ڈی) کے علاج کے لیے ایٹیڈرسجین آٹوٹیمسل (برانڈڈ کے طور پر لبمیلڈی)، جو ایک فعال انسانی ایرلسلفٹیس اے (اے آر ایس اے) جین کی ایکس ویو لینٹیویرل جین ڈیلیوری کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے (یورپی منظوری 2020 دی گئی)۔ ٹرانسفیوژن پر منحصر بیٹا تھیلیسیمیا (ٹی ڈی ٹی) کے علاج کے لیے بیٹیبیگلوجین آٹوٹیمسل (برانڈڈ زنٹیگلو)، جو ایک فعال انسانی ایچ بی بی جین (یورپی اور امریکی منظوری 2022 دی گئی) کی ایکس ویو لینٹیویرل جین ڈیلیوری کے ذریعے تیار کیا گیا ہے۔ سی اے آر-ٹی سیل امیونو تھراپیز: بی-سیل ایکیوٹ لیمفوبلاسٹک لیوکیمیا (بی-سیل اے ایل ایل) کے علاج کے لیے ٹیزاجینلیکلیوسل (برانڈڈ کیمریا)، جو سی ڈی-19 کو نشانہ بنانے والے سی اے آر جین کی ایکس ویو لینٹیویرل جین ڈیلیوری کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے (2017 میں امریکی منظوری دی گئی)۔ بڑے بی سیل لیمفوما کے علاج کے لیے آکسیکابٹیجین سیلولیسل (یسکارٹا کے طور پر برانڈڈ)، جو سی ڈی-19 کو نشانہ بنانے والے سی اے آر جین کی ایکس ویو گاما ریٹرو وائرل جین ڈیلیوری کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے (2017 میں امریکی منظوری دی گئی)۔ ریلیپسڈ/ریفریکٹری مینٹل سیل لیمفوما (آر/آر ایم سی ایل) والے بالغ مریضوں کے علاج کے لیے بریکسوکیبیٹین آٹولیسل (ٹیکارٹس کے طور پر برانڈڈ)، جو سی ڈی-19 کو نشانہ بنانے والے سی اے آر جین کی ایکس ویوو گاما ریٹرو وائرل جین ڈیلیوری کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے (امریکی منظوری 2021 دی گئی)۔ ویوو وائرل ویکٹر-ثالثی جین تھراپی میں: ریڑھ کی ہڈی کے پٹھوں کی ایروفی کے علاج کے لیے اوناسیمنوجین ابیپاروویک (زولجیسما کے طور پر برانڈڈ)، جو اے اے وی 9 وائرل ویکٹر کے نس کے ذریعے لگایا جاتا ہے جو متاثرہ موٹر نیوران کو ایک فعال ایس ایم این 1 ٹرانسجین فراہم کرتا ہے (2019 میں امریکی منظوری دی گئی)۔ لیبر پیدائشی اموروسس (ایک وراثت میں ملنے والی ریٹنا کی خرابی جس کی وجہ سے ترقی پسند اندھا پن ہوتا ہے) کے علاج کے لیے ووریٹیجین نیپاروویک (برانڈڈ کے طور پر لکسٹرنا)، جو اے اے وی 2 وائرل ویکٹر کے سب ریٹینل انجیکشن کے ذریعے دیا جاتا ہے جو آر پی ای 65 جین کی ایک فعال کاپی آنکھوں کے خلیوں کو آر پی ای 65 اتپریورتن کی تلافی کے لیے فراہم کرتا ہے (امریکی منظوری 2017 دی گئی)۔ ایس آئی آر این اے دوائیں: موروثی ٹرانستھیریٹن کی ثالثی والے امیلائڈوسس والے لوگوں میں پولی نیوروپتی کے علاج کے لیے پیٹیسیرن (آنپیٹرو)، جو لپڈ نینو پارٹیکلز میں تیار کردہ ایس آئی آر این اے کے نس کے ذریعے لگایا جاتا ہے جو پیتھوجینک ٹرانستھیریٹن ایم آر این اے کے اظہار کو خاموش کرنے کے لیے جگر کے خلیوں میں داخل ہوتا ہے (یو ایس اور یورپی منظوری 2018 دی گئی)۔ شدید ہیپاٹک پورفریا والے بالغوں کے علاج کے لیے گیووسران (گیولااری)، جسے سری آر این اے-گیل این اے سی کنجوگیٹس کے انٹراوینس انفیوژن کے ذریعے زیر انتظام کیا جاتا ہے جو پیتھوجینک امینولیولینٹ سنتھس 1 (اے ایل اے ایس 1) ایم آر این اے (2019 میں امریکی منظوری دی گئی) کے اظہار کو خاموش کرنے کے لیے جگر کے ہیپاٹوسیٹس میں داخل ہوتے ہیں۔ ایم آر این اے ویکسین: موڈرنا کووڈ-19 ویکسین (اسپائیک ویکس کے طور پر برانڈڈ) کو سارس-کووڈ-2 وائرس کے انفیکشن کی وجہ سے ہونے والے کووڈ-19 کے خلاف تحفظ فراہم کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے (یو ایس ایمرجنسی استعمال کی اجازت 2020)۔ یہ نمکین میں ایم آر این اے-ایل این پی کمپلیکس کی 0.5 ملی لیٹر خوراکوں کے انٹرامسکلر انجیکشن کے ذریعے دیا جاتا ہے۔ مقامی انجکشن سے ایم آر این اے-ایل این پی کمپلیکس کو رہائشی/دراندازی کرنے والے اے پی سی، متعلقہ مدافعتی خلیوں، اور پٹھوں کے خلیوں تک پہنچانے کی اطلاع ملی ہے، جو کووڈ اسپائیک پروٹین کے مقامی اظہار کو متحرک کرتا ہے تاکہ مستقبل میں سارس-کوو-2 کی نمائش کے خلاف مدافعتی نظام کو بہتر بنایا جا سکے۔ فائزر-بائیو ٹیک کووڈ-19 ویکسین (برانڈڈ کے طور پر کامرناٹی) کو سارس-کوو-2 وائرس کے انفیکشن کی وجہ سے ہونے والے کووڈ-19 کے خلاف تحفظ فراہم کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے (یو ایس ایمرجنسی استعمال کی اجازت 2020)۔ طریقہ کار موڈرنا (اوپر) جیسا ہی ہے سوائے اس کے کہ لپڈ نینو پارٹیکلز کی ساخت مختلف ہے، فائزر میں آئنائزبل لپڈ استعمال کیا جاتا ہے جسے اے ایل سی-0315 کہا جاتا ہے جبکہ موڈرنا ایس ایم-102 نامی آئنائزبل لپڈ استعمال کرتا ہے۔ اینٹی سینس اولیگونیوکلیوٹائڈز (اے ایس او): مائپومرسن (برانڈڈ بطور کینامرو)، ہوموزائگس فیملیئل ہائپر کولیسٹرولیمیا کے علاج کے لیے، کیمیائی طور پر تبدیل شدہ اے ایس اوز کے ذیلی جلد انجکشن کے ذریعے دیا جاتا ہے جو 30 دن کی نصف زندگی کے ساتھ جگر میں جمع ہوتے ہیں۔ اے ایس اوز جگر کے خلیوں میں داخل ہوتے ہیں تاکہ پیتھوجینک اے پی او بی ایم آر این اے (2013 میں امریکی منظوری دی گئی) کے اظہار کو روکا جا سکے۔ سپنرزا (برانڈڈ کے طور پر نوسینرسن) ریڑھ کی پٹھوں کی ایروفی (ایس ایم اے) کے علاج کے لیے، کیمیائی طور پر ترمیم شدہ اے ایس اوز کے انٹرا تھیکل انجیکشن کے ذریعے دیا جاتا ہے جو موٹر نیوران خلیوں میں داخل ہوتے ہیں، ایس ایم این 2 ایم آر این اے کو باندھتے ہیں، اور پروٹین کے اظہار کو بحال کرنے کے لیے ایس ایم این 2 جین کے متبادل اسپلیسنگ کو تبدیل کرتے ہیں۔ انسانی حمل کے لیے ان وٹرو فرٹیلائزیشن (آئی وی ایف): ایسے معاملات میں جیسے کہ سپرم کی کم گنتی یا حرکت پذیری، یا جہاں انڈوں کو آسانی سے سپرم کے ذریعے داخل نہیں کیا جا سکتا، واحد سپرم کو انٹراسائٹوپلاسمک سپرم انجیکشن (آئی سی ایس آئی) نامی طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے براہ راست انڈے میں مائیکرو انجیکٹ کیا جا سکتا ہے۔ انجکشن کے بعد فرٹیلائزڈ انڈے کو تقریبا 48 گھنٹوں کے لیے ایک خاص گروتھ میڈیم میں انکیوبیٹ کیا جاتا ہے جب تک کہ انڈہ چھ سے آٹھ خلیوں پر مشتمل نہ ہو جائے۔ اس کے بعد اسے ایک پتلی، پلاسٹک کیتھیٹر کے ذریعے مریض کے بچہ دانی میں منتقل کیا جاتا ہے، جو اندام نہانی اور گریوا سے گزرتا ہے۔ آئی سی ایس آئی کے ذریعے پیدا ہونے والا پہلا انسانی حمل 1991 میں جیانپیرو پالیرمو اور ان کی ٹیم نے کیا تھا۔ آئی وی ایف نے آئی سی ایس آئی کے ذریعے 1990 کی دہائی سے دنیا بھر میں لاکھوں حمل میں سہولت فراہم کی ہے۔ حفاظت۔ تحقیق ابھی بھی انسانی خلیوں میں مواد کی انٹرا سیلولر ترسیل کے فوری اور طویل مدتی طبی اثرات کو سمجھنے کے ابتدائی مراحل میں ہے۔ مثال کے طور پر، تحقیقات سے پتہ چلا ہے کہ آئی سی ایس آئی کے ذریعے پیدا ہونے والے بچے قدرتی طور پر پیدا ہونے والے بچوں کے مقابلے میں زیادہ صحت کے مسائل کا شکار ہوتے ہیں۔ تاہم، یہ معلوم نہیں ہے کہ آیا یہ والدین کے تولیدی نظام کی خراب صحت کی وجہ سے ہے یا آئی وی ایف اور آئی سی ایس آئی طریقہ کار کے پہلوؤں کی وجہ سے ہے۔ گاما ریٹرو وائرل اور لینٹ وائرل ویکٹروں کے ساتھ تیار کردہ ایچ ایس سی پر مبنی جین تھراپی میں کچھ معاملات میں جینوٹوکسائٹی کی وجہ سے لیوکیمیا کا خطرہ بڑھ گیا ہے، جیسا کہ اسٹریمویلس کے ساتھ ہوا ہے۔ مزید برآں، تھراپیٹک ایس آئی آر این اے اور ایم آر این اے کی انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے استعمال ہونے والے لپڈز سوزش کے رد عمل کا سبب بن سکتے ہیں۔ پیٹیسیرن کے معاملے میں، نینو پارٹیکل کے رد عمل کو کم کرنے کے لیے متعدد اینٹی سوزش ادویات کے ساتھ پری ٹریٹمنٹ کا استعمال کیا جاتا ہے۔ وصول کنندگان کی آبادی کی مختصر اور طویل مدتی صحت دونوں پر ایم آر این اے ویکسین کے نئے کیمیائی اجزاء، جیسے ایس ایم-102 اور اے ایل سی-0315 کی انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے طبی اثرات کے بارے میں فی الحال بہت کم اعداد و شمار دستیاب ہیں۔ اس طرح، حفاظتی اور غیر ارادی ضمنی اثرات طبی علاج کے لیے اہمیت کا موضوع بنے رہیں گے جو انٹرا سیلولر ڈیلیوری کا استعمال کرتے ہیں۔ طریقوں کے زمرے انٹرا سیلولر ترسیل کے موجودہ طریقوں کو دو وسیع زمروں میں رکھا جا سکتا ہے: میمبرین خلل-ثالثی کیریئر-ثالثی میمبرین خلل میمبرین خلل-ثالثی تکنیکوں میں خلیوں کی جھلی میں عارضی سوراخ بنانا اور کارگو مالیکیولز کو دونوں میں سے کسی ایک کے ذریعے پہنچانا شامل ہے۔ خلیے کی پلازما جھلی کو مکینیکل، برقی، کیمیائی، نظری یا تھرمل ذرائع سے متاثر کیا جا سکتا ہے۔ انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے طریقے جو پارگمیبلائزیشن کو استعمال کرتے ہیں ان میں شامل ہیں: الیکٹروپوریشن تھرمل ٹریٹمنٹ آپٹوپوریشن (عام طور پر لیزر کے ساتھ) کیوٹیشن ایفیکٹس (عام طور پر الٹراساؤنڈ یا لیزر/پارٹیکل انٹرایکشن سے) فلوڈ شیر (عام طور پر مائیکرو فلوئڈکس یا کیوٹیشن کے ذریعے) ڈٹرجنٹس/سرفیکٹینٹس سوراخ بنانے والے ٹاکسن اوسموٹک/ہائیڈروسٹیٹک فورسز براہ راست مکینیکل طریقے جیسے مائیکرو فلوئڈک سیل نچوڑنا، سکریپ لوڈنگ، مالا لوڈنگ۔ انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے طریقے جو براہ راست دخول کا استعمال کرتے ہیں ان میں شامل ہیں: کلاسیکی مائیکرو انجیکشن مائیکرو انجیکشن کی نئی شکلیں (جیسے۔ نانوپیپیٹ، آٹومیشن وغیرہ) بیلسٹک ذرات/جین گن نینونیڈلز اور ان کی تغیرات جیسے نینوسٹرا، نینو سپیئرز اور نینو ویئرز۔ میمبرین خلل-ثالثی ترسیل کے طریقے تقریبا کسی بھی ایسے مواد کو فراہم کر سکتے ہیں جسے حل میں منتشر کیا جا سکتا ہے، جس سے وہ کیریئر-ثالثی طریقوں سے زیادہ عالمگیر بن جاتے ہیں۔ جھلی میں خلل ڈالنے کی ثالثی کے طریقوں کے لیے بڑا چیلنج مطلوبہ ترسیل کی درخواست کے لیے زیادہ سے زیادہ شکل، سائز، مقام اور مدت کے سوراخ بنانا ہے۔ جھلی کے بہت زیادہ نقصان سے بچنا چاہیے کیونکہ یہ خلیوں کو مار سکتا ہے یا ان کے کام کو خراب کر سکتا ہے۔ کیریئر کیریئر کی ثالثی کی ترسیل کی تکنیک کارگو کو نینو اسکیل کیریئر میں یا اس پر پیک کرتی ہے، جو اس کے بعد کارگو کی فراہمی کے لیے سیل میں داخل ہوتی ہے۔ کیریئر عام طور پر سیل کے اندرونی حصے میں یا تو اینڈوسیٹوسس (کیریئرز کی اکثریت) یا سیل کے پلازما جھلی کے ساتھ فیوژن کے ذریعے داخل ہوتے ہیں۔ تاہم، بعض کیریئرز کے پلازما جھلی کو عبور کرنے یا عارضی طور پر خلل ڈالنے کی نایاب اطلاعات اب تک نامعلوم میکانزم کے ذریعے ملتی ہیں۔ کیریئر پر مبنی نقطہ نظر مختلف بائیو کیمیکل اسمبلیوں پر مشتمل ہوتے ہیں، جو زیادہ تر سالماتی سے نینو اسکیل طول و عرض کے ہوتے ہیں۔ کیریئرز کا مقصد تین گنا ہے، کارگو کو پیک کرنا اور اسے انحطاط سے بچانا، مطلوبہ انٹرا سیلولر ڈبے تک رسائی حاصل کرنا، اور مناسب وقت اور مقام پر پے لوڈ جاری کرنا۔ کیریئرز بائیو سے متاثر ہو سکتے ہیں، جیسے کہ دوبارہ تشکیل شدہ وائرس، وائرس جیسے ذرات، ویسیکلز، سیل بھوت، اور فنکشنل لگینڈس اور پیپٹائڈز۔ وہ کیمسٹری، میٹریل سائنس اور نینو ٹیکنالوجی کی ترکیبی تکنیکوں پر مبنی ہو سکتے ہیں، جس میں نامیاتی اور غیر نامیاتی ماخذ سے میکرو مالیکیولر کمپلیکس کی اسمبلی شامل ہوتی ہے۔ خلیوں کے اندر ترسیل کے لیے استعمال ہونے والے کیریئرز میں شامل ہیں: پولیمر اسمبلیاں لپڈ اسمبلیاں لیپوسومز (لپڈ اسمبلیوں کے برعکس آبی اندرونی حصے کے ساتھ کھوکھلی) سالٹ کمپلیکس (مثال کے طور پر۔ سی اے پی او 4-نیوکلک ایسڈ کنڈینسیٹس) ایکزوسومز اور دیگر بائیو سے متاثر ویسیکلز سیل-پینٹریٹنگ پیپٹائڈز (سی پی پیز)، جسے پروٹین ٹرانسڈکشن ڈومینز (پی ٹی ڈیز) بھی کہا جاتا ہے۔ لیگینڈ پروٹین یا شوگر پر مبنی نینو اسمبلیوں کو جوڑتا ہے (مثال کے طور پر۔ چیٹوسان) غیر نامیاتی نینو کیریئرز (مثال کے طور پر۔ میسوپورس سلیکا، دھاتی نینو پارٹیکلز، مقناطیسی نینو پارٹیکلز) نینو ٹیکنالوجی پر مبنی کیریئر (مثال کے طور پر۔ کوانٹم ڈاٹس، کاربن نینو ٹیوبز) وائرل ویکٹر (لینٹیوائرس، ریٹرو وائرس، اڈینو وائرس، اڈینو سے وابستہ وائرس (اے اے وی)، اور دیگر وائرسوں پر مبنی) بیکٹیریل ٹاکسن اور وائرل اجزاء کا دوبارہ مقصد یہ تحقیق کہ کیریئر خلیوں میں کیسے داخل ہوتے ہیں اس سے پتہ چلتا ہے کہ زیادہ تر کیریئر سائٹوپلازم میں اینڈوسومل کمپارٹمنٹس سے فرار ہونے سے پہلے اینڈوسیٹوسس کے ذریعے داخل ہوتے ہیں۔ نینو کیریئروں کے لیے دستیاب اینڈوسیٹوسس کے طریقہ کار میں کلاتھرین پر منحصر اور کلاتھرین سے آزاد راستوں کے ذریعے فگوسیٹوسس اور پنوسیٹوسس شامل ہیں۔ ہدف خلیوں کے ذریعہ استعمال ہونے والے داخلی راستے کا انحصار کیریئر کے سائز، شکل، مادی ساخت، سطح کی کیمسٹری، اور/یا چارج پر ہوتا ہے۔ اینڈوسومز سے بچنے کے قابل کارگو کو انحطاط کے لیے لائسوسومز میں اسمگل کیا جاتا ہے یا سیل کی سطح پر دوبارہ استعمال کیا جاتا ہے۔ زیادہ تر غیر وائرل کیریئر حکمت عملیوں کے لیے تقریبا 1 فیصد اینڈوسومل فرار کی افادیت کی اطلاع دی گئی ہے، بشمول لپڈ نینو پارٹیکلز اور سیل میں گھسنے والے پیپٹائڈز۔ مزید برآں، اینڈوسوم کے فرار کا صحیح طریقہ کار غیر واضح ہے اور یہ جاری تحقیق کا معاملہ ہے۔ اینڈوسیٹوسس کے علاوہ، کچھ کیریئر فیوژن کے ذریعے براہ راست پلازما جھلی کے ساتھ ضم ہونے کے قابل ہوتے ہیں۔ حیاتیات میں فیوژن کے واقعات میں ویسیکل فیوژن، سیل سیل فیوژن اور سیل وائرس فیوژن شامل ہیں۔ ان صورتوں میں، جکس ٹیپوزڈ جھلی کو مخصوص پروٹین-پروٹین تعاملات کے ذریعے قریبی رابطے میں کھینچ لیا جاتا ہے اور لپڈ اختلاط اور اس کے بعد کے فیوژن کو فروغ دینے کے لیے انٹرفیسیل پانی کو خارج کر دیا جاتا ہے۔ ڈھکے ہوئے وائرس ہدف سیل جھلی کے ساتھ فیوژن میں ثالثی کے لیے ٹرانس میمبرین وائرل پروٹین کا استعمال کر سکتے ہیں اور اس طریقہ کار کو انجینیئرڈ انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ ایک ابتدائی مثال ہدف خلیوں کی پلازما جھلی کے ساتھ پہلے سے بھری ہوئی سرخ خون کے خلیوں کے بھوتوں کو فیوز کرنے کے لیے سینڈائی وائرس کا استعمال تھا۔ اس تکنیک پر ایک تغیر نے ہدف سیل جھلی پر انفلوئنزا ہیماگگلوٹینن (ایچ اے) کے اظہار کا استعمال کیا، جو پھر فیوژن کو متاثر کرنے کے لیے سرخ خون کے خلیوں کی سطح پر سیالک ایسڈ کے باقیات کو باندھتا ہے۔ وائروسومز، جو وائرل جھلی کے اجزاء پر مشتمل ہوتے ہیں جنہیں لیپوسومز یا ویسیکلز میں دوبارہ تشکیل دیا جاتا ہے، انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے مقاصد کے لیے فیوژن کی صلاحیتوں کو بھی ظاہر کرتے ہیں۔ فنکشنل وائروسومز کو سینڈائی، انفلوئنزا، ویسیکیولر اسٹومائٹس اور دیگر وائرس کے فیوژن اجزاء کے ساتھ بنایا گیا ہے۔ کچھ ایکزوسومز اور ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز کے ہدف خلیوں کے ساتھ فیوز ہونے کی اطلاع دی گئی ہے اور اس کے علاوہ طلب کے مطابق فیوز کرنے کے لیے انجینئرنگ بھی ہو سکتی ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ پروٹین کی ترسیل کے لیے استعمال ہونے والے فیوزوجینک لیپوسومز کو فیوزوجینک پروٹین یا پیپٹائڈز کی موجودگی کی ضرورت کے بغیر صرف لپڈ کی ساخت کو تبدیل کرکے فیوژن کرنے کے قابل بتایا گیا ہے۔ فیوزوجینک کیریئرز جو انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے استعمال کیے گئے ہیں ان میں (1) سیل بھوت، مردہ خلیات جن کے سائٹوپلازم کو کارگو سے تبدیل کر دیا گیا ہے، (2) وائروسومز، کارگو سے بھرے ہوئے ویسیکلز کو فعال وائرل پروٹین کو ظاہر کرنے کے لیے دوبارہ تشکیل دیا گیا ہے، اور (3) فیوزوجینک لیپوسومز شامل ہیں۔ وائرل ویکٹر۔ وائرل ویکٹر خلیوں میں داخل ہونے کے لیے وائرل انفیکشن کے راستے کا استحصال کرتے ہیں لیکن وائرل جین کے بعد کے اظہار سے بچتے ہیں جو نقل اور پیتھوجینسیٹی کا باعث بنتا ہے۔ یہ وائرل جینوم کے کوڈنگ علاقوں کو حذف کرکے اور ان کی جگہ ڈیلیور کیے جانے والے ڈی این اے کے ساتھ کیا جاتا ہے، جو یا تو میزبان کروموسومل ڈی این اے میں ضم ہو جاتا ہے یا ایک ایپیسومل ویکٹر کے طور پر موجود ہوتا ہے۔ وائرل ویکٹر سب سے پہلے 1970 کی دہائی سے جین کی فراہمی کے لیے استعمال کیے گئے تھے، جو ایس وی 40 یا ریٹرو وائرس سے بنائے گئے تھے۔ وائرل ویکٹر پلیٹ فارم کی نئی نسلیں لینٹیوائرس، ریٹرو وائرس، اڈینو وائرس یا اڈینو سے وابستہ وائرس، اور دیگر وائرس کے اجزاء کی بنیاد پر تیار کی گئی ہیں۔ ڈی این اے کی ترسیل کے لیے انتہائی موثر ہونے کے باوجود، وائرل ویکٹرز کی قابل ذکر کمزوریوں میں (1) محنت کش اور مہنگے پروٹوکول، (2) حفاظتی مسائل، (3) مدافعتی/سوزش کے ردعمل کا خطرہ، (4) ریکومبیننٹ ویکٹرز کے ساتھ جینوم میں انضمام، (5) داخل شدہ جینوٹوکسائٹی کا خطرہ، اور (6) محدود پیکیجنگ کی صلاحیت (ایڈینو اور اے اے وی عام طور پر 5−7.5 کے بی لے جانے تک محدود) شامل ہیں۔ منتقلی کے لیے نینو پارٹیکلز۔ نیوکلک ایسڈ کی انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے سب سے زیادہ استعمال ہونے والے نینو پارٹیکلز کیٹیانک لپڈز اور پولیمر کی اسمبلیوں پر مبنی ہوتے ہیں۔ یہ کیٹیشنک مالیکیول ڈی این اے پلازمیڈز (~ 50-200 nm)، mRNA (10-100 nm) اور دیگر نیوکلک ایسڈ (دیکھیں "انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے دلچسپی کے عام مالیکیولز کی خصوصیات") کو کمپیکٹ نینو پارٹیکلز میں گاڑھا کرتے ہیں جن کے طول و عرض دسیوں نینو میٹر تک ہوتے ہیں۔ ان ذرات کا مثبت چارج زیادہ تر جانوروں کے خلیوں کے قدرتی منفی چارج (−35 سے −80 mV جھلی کی صلاحیت) کی وجہ سے خلیوں کی سطح پر ان کی کشش کو آسان بناتا ہے۔ بائنڈنگ کے بعد، اینڈوسیٹوسس کو 100 این ایم سے کم سائز کے ذرات کے لیے سب سے زیادہ موثر سمجھا جاتا ہے۔ نینو پارٹیکلز میں پیچیدگی بھی نیوکلک ایسڈ کو انحطاط کے خلاف تحفظ فراہم کرتی ہے جب تک کہ وہ مناسب انٹرا سیلولر ڈبے میں نہ چھوڑے جائیں۔ 1960 کی دہائی سے یہ مشاہدہ کیا گیا کہ نیوکلک ایسڈ کو کیٹیانک مالیکیولز کے ساتھ ملانے سے میکرو مالیکیولر کمپلیکس کی تشکیل ہوتی ہے جو خلیوں کو منتقل کر سکتے ہیں۔ دو ابتدائی مثالیں پولیمر ڈائیتھیلیمینوتھائل-ڈیکسٹرن (ڈی ای اے ای-ڈیکسٹرن)/نیوکلک ایسڈ کا امتزاج (1968) اور اگھلنشیل آئنک نمک کیلشیم فاسفیٹ/نیوکلک ایسڈ پریپیٹینٹ (1973) تھیں۔ ٹرانسفیکشن کے لیے کیٹیانک لپڈ کا استعمال 1980 کی دہائی میں شروع ہوا، جسے "لیپوفیکشن" کہا جاتا تھا، اور یہ 1993 میں لانچ کیے گئے مقبول پروڈکٹ لیپوفیکٹامین کی بنیاد بن گیا۔ دیگر کیٹیانک ٹرانسفیکشن ریجینٹ 1990 کی دہائی میں ڈینڈریمرز کی بنیاد پر تیار کیے گئے تھے جیسے کہ 1993 میں پی اے ایم اے ایم ("سپرفیکٹ" ریجینٹ 1990 کی دہائی کے آخر میں لانچ کیا گیا) اور کیٹیانک پولیمر جیسے کہ 1995 میں پی ای آئی (اس کے فورا بعد "پولی جیٹ" کے طور پر فروخت کیا گیا)۔ فی الحال تحقیق میں، زیادہ تر نیوکلک ایسڈ کی منتقلی لپڈ ریجینٹس کے ساتھ کی جاتی ہے، جس میں پولیمر ریجینٹس اور الیکٹروپوریشن دوسرے بڑے اختیارات ہیں۔ بعض ریکلسیٹرنٹ خلیات یا ویوو ایپلی کیشنز وائرل ویکٹرز کے لیے بہتر موزوں ہو سکتے ہیں۔ تکنیکی پیش رفت میمبرین ڈسپرشن کی درستگی کو بہتر بنانا مائیکرو فیبریکیشن، نینو ٹیکنالوجی، کیمسٹری اور دیگر تحقیقی شعبوں میں پیشرفت نے انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے طریقوں کی درستگی اور کارکردگی میں بہتری میں اہم کردار ادا کیا ہے۔ الیکٹروپوریشن۔ الیکٹرو کارپوریشن کے ابتدائی ورژن میں کیویٹ میں حل میں خلیوں پر متعین وولٹیج کی برقی دالوں کو لاگو کرنے کے لیے بلک الیکٹروڈ کا استعمال کیا جاتا تھا۔ اس کے بعد الیکٹرو کارپوریشن کو 90 کی دہائی کے آخر میں مائیکرو فلوئڈکس کے استعمال کے ذریعے مائیکرو اسکیل پر لایا گیا۔ اس کے بعد نینو الیکٹروپوریشن نینو ایپرچرز اور نینو اسٹرا کے استعمال کے ذریعے حاصل کی گئی۔ الیکٹرو کارپوریشن کے نینو اور مائیکرو ورژن ہدف خلیوں پر عائد جھلی کی رکاوٹوں کے سائز اور مقام پر بہت زیادہ درستگی اور کنٹرول کی خصوصیت رکھتے ہیں۔ میکسائٹ نامی کمپنی نے فلو الیکٹروپوریشن کا ایک ہائی تھرو پٹ ورژن تیار کیا ہے جو دسیوں منٹ میں سیکڑوں لاکھوں خلیوں کو پروسیس کر سکتا ہے۔ مزید برآں، دیگر تحقیقی گروپوں نے ہائی تھرو پٹ ملٹی ویل سسٹمز میں الیکٹروپوریشن پیرامیٹرز کو بہتر بنانے کے لیے ڈیپ لرننگ کا استعمال کیا ہے۔ مکینیکل رابطہ۔ خلیوں کی جھلی سے ٹکرانے والی اشیاء کی مکینیکل قوت کا استحصال کرنے والے انٹرا سیلولر ڈیلیوری پروٹوکول کے پہلے ورژن آسان اور خام طریقے تھے جیسے سکریپ لوڈنگ اور گلاس بیڈ لوڈنگ۔ سکریپ لوڈنگ میں، مثال کے طور پر، ایک اسپیٹولا کو مستقل خلیوں کے پار گھسیٹا جاتا ہے جنہیں فلیٹ سبسٹریٹ پر کلچر کیا گیا ہے۔ جیسے ہی خلیات سبسٹریٹ کو چھیلتے ہیں وہ جھلی کے نقصان کی متغیر مقدار سے گزرتے ہیں اور حل میں مالیکیول لینے کے قابل ہوتے ہیں۔ خلیوں میں پروٹین اور چھوٹے مالیکیول متعارف کرانے کے لیے بہت سے حیاتیاتی مطالعات میں سکریپ اور بیڈ لوڈنگ کا استعمال کیا گیا ہے۔ 1990 کی دہائی کے آخر سے محققین نے نینونیڈلز اور مائیکرو فیبریکیٹڈ آلات کے استعمال کے ذریعے ٹھوس معاہدہ پر مبنی جھلی میں خلل کی درستگی کو بہتر بنانے کے لیے کام کیا ہے۔ نینونیڈلز کو پہلی بار 2003 میں نیوکلک ایسڈ کی منتقلی کے لیے استعمال کیا گیا تھا پھر 2010 میں متنوع کارگو کی فراہمی کا مظاہرہ کیا گیا۔ انہیں مزید فعالیت شامل کرنے کے لیے الیکٹرو کارپوریشن، فلو ریزروائرز اور ڈٹرجنٹس کے ساتھ جوڑا گیا ہے۔ مزید برآں، نینو اسٹرا کا استعمال وقت کے ساتھ حل شدہ انداز میں خلیوں میں مالیکیول داخل کرنے اور نکالنے دونوں کے لیے کیا گیا ہے۔ 1999 میں یہ پایا گیا کہ پولی کاربونیٹ فلٹرز میں سوراخوں سے گزرنے والے خلیوں نے ڈی این اے ٹرانسفیکشن حاصل کرنے کے لیے سیل جھلی میں عارضی رکاوٹیں پیدا کیں۔ اس طریقہ کو "فلٹروپوریشن" کہا جاتا تھا اور اس وقت اس پر زیادہ توجہ نہیں دی گئی تھی۔ 2012 میں ایم آئی ٹی کے محققین نے پایا کہ سلکان مائکرو فلوئڈک آلات میں رکاوٹوں سے گزرنے والے خلیات خلیات کی جھلی میں خلل ڈالنے کی صلاحیت رکھتے ہیں تاکہ متنوع مواد کی انٹرا سیلولر ترسیل حاصل کی جا سکے۔ یہ طریقہ، جسے سیل نچوڑنا کہا جاتا ہے، ایس کیو زیڈ بائیوٹیک نامی کمپنی میں پھیلایا گیا تھا جو سیل پر مبنی تھراپی تیار کرنے کے لیے انٹرا سیلولر ڈیلیوری ٹیکنالوجی کا فائدہ اٹھانے پر مرکوز ہے۔ خلیوں کے بہاؤ کی رفتار اور مائیکرو فلوئڈک سکڑنے کی شکل اور سائز کو ایڈجسٹ کرکے، خلیوں کے نچوڑ کو مختلف خلیوں کی اقسام اور ترسیل کے استعمال کے مطابق بنایا جا سکتا ہے۔ دیگر تحقیقی گروپوں نے مائکرو سیوز اور پی ڈی ایم ایس پر مبنی مائکرو فلوڈک آلات میں سیل نچوڑنے کے تصور کا مظاہرہ کیا ہے۔ خلیے کے نچوڑ کو الیکٹروپوریشن کے ساتھ جوڑا گیا ہے تاکہ ڈی این اے اور دیگر مواد کو نیوکلئس میں تیزی سے پہنچایا جا سکے۔ یہ پہلے پلازما جھلی میں سوراخ ڈال کر کام کرتا ہے، پھر برقی نبض رکھنے سے 1) جوہری جھلی میں خلل پڑتا ہے، اور 2) سیل میں منفی طور پر چارج شدہ نیوکلک ایسڈ کو چلاتا ہے۔ مائیکرو فلوڈک سیل کے نچوڑنے کے بعد نیچے کی طرف الیکٹروپوریشن کو جوہری جھلی میں عارضی رکاوٹوں کا سبب بنتا ہوا دکھایا گیا ہے جن کی مرمت 15 منٹ کے اندر کی گئی تھی۔ سیال شیر۔ سیل میمبرین کو قابو میں رکھنے کے لیے فلوئڈ شیر فورسز کے استعمال کی ابتدائی مثالوں میں روایتی الٹراساؤنڈ، معطلی میں خلیوں کے لیے سرنج لوڈنگ اور مستقل خلیوں پر شنک پلیٹ وسکومیٹرز کا استعمال شامل ہیں۔ سرنج لوڈنگ میں، خلیوں کے سسپنشن کو چوس لیا جاتا ہے اور ایک باریک سوئی ٹپ کے ذریعے سرنج سے نکال دیا جاتا ہے۔ سوئی کی نوک پر سیال کی شیر قوتوں کا انحصار بہاؤ کی رفتار پر ہوتا ہے اور اسے خلیے کی جھلی میں خلل ڈالنے کے لیے تیار کیا جا سکتا ہے۔ 1990 کی دہائی سے، خلیوں کو پار کرنے کے لیے سیال شیر قوتوں کو استعمال کرنے کی زیادہ درست حکمت عملیوں میں مائیکرو فلوئڈکس، الٹراساؤنڈ، شاک ویوز اور لیزر پر مبنی طریقے شامل ہیں۔ آبی ماحول میں کسی جذب کرنے والی چیز کی لیزر تابکاری مختلف قسم کے اثرات پیدا کر سکتی ہے جن میں کھوکھلی، پلازما کی پیداوار، کیمیائی رد عمل اور حرارت شامل ہیں۔ لیزر-ذرہ اور لیزر-سطح دونوں کے تعاملات کو کھوپڑی کے واقعات پیدا کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے جو خلیوں کو مقامی طور پر مرتکز سیال شیر قوتوں سے بے نقاب کرتے ہیں۔ مثال کے طور پر، ایک دھاتی نینو اسٹرکچر کو مختصر لیزر پلس توانائی حاصل کرنے اور اسے انتہائی مقامی دھماکہ خیز بخارات کے بلبلوں میں تبدیل کرنے کے لیے بیج کے ڈھانچے کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس تصور کے ایک اعلی تھرو پٹ ورژن کی نقاب کشائی 2015 میں کی گئی تھی جس میں دھاتی جذب کاروں سے ڈھکے سوراخوں کے ساتھ صف بند سبسٹریٹس کو منسلک خلیوں کے بیسال سائیڈ کے نیچے پھٹنے والے کھوپڑی کے بلبلے پیدا کرنے کے لیے تابکاری کی گئی تھی۔ کئی خلیوں کی اقسام کے سائٹوپلازم میں زندہ بیکٹیریا (> 1 مائکرون) کو کامیابی کے ساتھ متعارف کرانے کے لیے چھتوں کے ذریعے کارگو کے فعال پمپنگ کے ساتھ میمبرین پارمیبلائزیشن کو ہم آہنگ کیا گیا۔ تھرمل اثرات۔ خلیوں میں مالیکیولز پہنچانے کا ایک آسان طریقہ پلازما جھلی کو گرم کرنا ہے جب تک کہ سوراخ نہ بن جائیں۔ کافی زیادہ درجہ حرارت پر، جزو مالیکیولز کی حرکی توانائی جھلی کی تشکیل کو برقرار رکھنے والی قوتوں سے زیادہ ہونے کی وجہ سے لپڈ بائی لیئرز الگ ہو جائیں گے، یعنی ہائڈروفوبک قوتیں جو لپڈ دم سے پانی کو دور کرتی ہیں۔ اس طریقہ کار کا منفی پہلو یہ ہے کہ یہ ناقابل یقین حد تک غیر مخصوص ہے اور خلیوں کو ضرورت سے زیادہ نقصان پہنچا سکتا ہے۔ تھرمل ذرائع سے خلیوں کو پار کرنے کے لیے حکمت عملیوں میں شامل ہیں (1) کولنگ-ہیٹنگ سائیکل کے ذریعے سائیکلنگ سیل، جس میں منجمد ہونا یا نہ ہونا شامل ہو سکتا ہے، (2) ہیٹنگ سیل سے لے کر سپر فزیولوجیکل درجہ حرارت تک، اور (3) سیل کے ایک چھوٹے سے حصے کی عارضی شدید حرارت۔ بعد کے معاملے میں، تھرمل انک جیٹ پرنٹرز کو جانوروں کے خلیوں میں انٹرا سیلولر ڈیلیوری اور ٹرانسفیکشن کے لیے کامیابی سے استعمال کیا گیا ہے۔ لیزر ذرات کے تعاملات کو خلیوں کی جھلیوں کو درست طریقے سے تھرمل طور پر متاثر کرنے کی اطلاع دی گئی ہے۔ سونے کے نینو پارٹیکلز کو ایک گھنے سطح کی پرت میں پیک کیا جاتا تھا جہاں> 10 سیکنڈ اورکت لیزر تابکاری خلیوں کے نچلے حصے کو گرم کرتی ہے تاکہ رنگوں، ڈیکسٹرنس اور پلازمیڈز کی پارگمیتی اور ترسیل کو متحرک کیا جا سکے۔ 2021 میں یہ تصور مزید تیار کیا گیا جب محققین نے دکھایا کہ بائیو مطابقت پذیر الیکٹروسپن نینو فائبر میں سرایت شدہ ہلکے حساس آئرن آکسائڈ نینو پارٹیکلز خلیوں اور نینو پارٹیکلز کے درمیان براہ راست رابطے کے بغیر فوٹو تھرمل اثرات کے ذریعے جھلی پارگمیلیائزیشن کو متحرک کر سکتے ہیں۔ یہ طریقہ سی آر آئی ایس پی آر-سی اے ایس 9 مشینری اور ایس آئی آر این اے کو مستقل اور معطلی خلیوں تک پہنچانے کے قابل تھا، بشمول جنین اسٹیم سیل اور مشکل سے منتقل ہونے والے ٹی خلیات۔ کارگو اور کیریئرز ایم آر این اے ادویات کا بائیو کیمیکل اضافہ۔ لپڈ نینو پارٹیکل فارمولیشن اور نیوکلک ایسڈ کیمسٹری میں پیش رفت نیوکلک ایسڈ تھیراپیوٹکس، جیسے ایم آر این اے ویکسین کی ترقی میں اہم رہی ہے۔ مثال کے طور پر، ابتدائی اینڈوسومل پی ایچ کے قریب ایسڈ ڈس ایسوسی ایشن کانسٹینٹ (پی کے اے) کے ساتھ کیٹیشنک آئنائزبل لپڈ کا ڈیزائن، جو لپڈ نینو پارٹیکل فارمولیشن کا ایک کلیدی جزو ہے، اینڈوسیٹوسس کے بعد سائٹوپلازم میں اینڈوسومل ریلیز کو قابل بناتا ہے۔ موڈرنا کووڈ ویکسین میں لپڈ نینو پارٹیکلز ایم آر این اے کو شامل کرنے کے لیے آئنائزبل لپڈ ایس ایم-102، کولیسٹرول، 1,2-ڈسٹیرائل-سنگلیسرو-3 فاسفوکولین (ڈی ایس پی سی) اور پی ای جی 2000-ڈی ایم جی پر مشتمل ہوتے ہیں۔ فائزر/بائیو این ٹیک کووڈ ویکسینز ایکیوٹاس تھیراپیوٹکس سے اے ایل سی-0315 لپڈ کا استعمال کرتی ہیں اور اسے ایم آر این اے کے ساتھ کولیسٹرول، ڈی ایس پی سی، اور پی ای جی-لپڈ (اے ایل سی-0159) کے ساتھ تشکیل دیتی ہیں۔ انٹرامسکلر انجیکشن کے بعد نینو پارٹیکلز خلیوں میں داخل ہوتے ہیں، ایم آر این اے کو سائٹوپلازم میں چھوڑا جاتا ہے، اور مریضوں کے خلیوں میں ایس اے آر ایس-سی او وی 2 اسپائیک پروٹین کا اظہار ہوتا ہے۔ ایس آئی آر این اے دوائیں۔ پیٹیسیرن، 2018 میں ایف ڈی اے سے ریگولیٹری منظوری حاصل کرنے والی پہلی ایس آئی آر این اے پر مبنی دوا، لپڈ نینو پارٹیکل فارمولیشن پر مبنی ہے جو ٹرانستھیریٹن جین کی غیر معمولی پیتھوجینک شکل کو خاموش کرنے کے لیے جگر میں ایس آئی آر این اے کو پیک اور ڈیلیوری کرتی ہے۔ تھراپیٹک ایس آئی آر این اے کو 2 لپڈ ایکسائپینٹس، ڈی ایل این-ایم سی 3-ڈی ایم اے اور پی ای جی 2000-سی-ڈی ایم جی کے ساتھ تیار کیا جاتا ہے، جو ایک لپڈ نینو پارٹیکل میں ہوتا ہے جو مریض میں نس کے ذریعے داخل ہوتا ہے اور جگر میں ہیپاٹوسائٹس کو نشانہ بناتا ہے۔ مزید برآں، ایس آئی آر این اے علاج میں کیمیائی طور پر تبدیل شدہ نیوکلیوٹائڈز کیمیائی استحکام اور افادیت کو بہتر بناتے ہیں، بعض خلیوں کی اقسام کو نشانہ بنانے میں مدد کرتے ہیں، اور منفی امیونولوجیکل رد عمل کو کم کرنے کا کام کرتے ہیں۔ چھوٹے مالیکیولز، کاربوہائیڈریٹس، اپٹیمرز، پیپٹائڈز اور اینٹی باڈیز سمیت متنوع لگینڈز کو سیلولر اضافے کو بہتر بنانے اور مخصوص سیل کی اقسام کو نشانہ بنانے کے لیے ایس آئی آر این اے سے مربوط کیا گیا ہے۔ مثال کے طور پر، گال این اے سی-ایس آئی آر این اے کنجوگیٹس نہ صرف کیٹیانک مواد کی ضرورت کے بغیر لگینڈ پر مبنی سیل کی داخلی کاری کے لیے ایک نقطہ نظر فراہم کرتے ہیں، بلکہ خاص طور پر ہیپاٹوسائٹس کو بھی نشانہ بناتے ہیں۔ گال این اے سی-ایس آئی آر این اے کنجوگیٹس کو دوسری ایف ڈی اے سے منظور شدہ ایس آئی آر این اے دوائی، گیووسیرن میں استعمال کیا گیا تھا، جو جگر میں اے ایل اے ایس 1 کے اظہار کو کم کرنے کے ذریعے شدید ہیپاٹک پورفریا کے علاج کے لیے دی جاتی ہے۔ اے ایس او دوائیں۔ پہلی منظور شدہ اینٹی سینس اولیگونیوکلیوٹائڈز (اے ایس او) دوا کی نقاب کشائی 1998 میں فومیویرسن کے ساتھ کی گئی تھی، جو ایک 21-میر اولیگونیوکلیوٹائڈ ہے جو سائٹومیگالو وائرس ایم آر این اے کے ترجمہ کو روکتا ہے۔ پری-ایم آر این اے یا ایم آر این اے کو پابند کرکے، اے ایس اوز پری-ایم آر این اے پروسیسنگ اور اسپلیسنگ، مسابقتی روک تھام، ٹرانسلیشنل مشینری کی سٹیریک ناکہ بندی، اور باؤنڈ ٹارگٹ آر این اے کے انحطاط سمیت میکانزم کے ذریعے پروٹین کی ترکیب کو پوسٹ ٹرانسکرپشن کے ذریعے منظم کر سکتے ہیں۔ اے ایس او نیوکلیو سائیڈز، نیوکلیو بیسز، اور انٹرنیوکلیو سائیڈ ریڑھ کی ہڈی کی کیمیائی تبدیلیاں ہدف کی وابستگی اور افادیت کو برقرار رکھتے ہوئے فارماکوکینٹکس اور فارماکوڈینامکس کو بہتر بنانے کے لیے کلیدی حیثیت رکھتی ہیں۔ علاج کے لحاظ سے موثر اے ایس اوز میں بہت زیادہ ترمیم کی جاتی ہے، لہذا انہیں انٹرا سیلولر ڈیلیوری کے لیے کیریئر کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔ زیادہ تر طبی طور پر قابل اطلاق اے ایس اوز ننگے مالیکیول ہوتے ہیں جو اینڈوسیٹوسس کے ذریعے خلیوں میں داخل ہونے کے قابل ہوتے ہیں اور اپنے انٹرا سیلولر ہدف کو باندھ کر اپنے علاج کے اثرات مرتب کرتے ہیں۔ بہتر وائرل ویکٹر۔ تقریبا 70 فیصد جین تھراپی کلینیکل ٹرائلز نے جین کی ترسیل کے مرحلے کے لیے وائرل ویکٹرز کا استعمال کیا ہے۔ اڈینو وائرس، اڈینو سے وابستہ وائرس (اے اے وی) اور لینٹیویرل ویکٹر فی الحال بائیوٹیکنالوجی اور کلینیکل ایپلی کیشنز میں استعمال ہونے والے اہم وائرل ویکٹر ہیں۔ اے اے وی وائرل ویکٹرز میں ہونے والی بہتری کی ایک نمایاں مثال ہے۔ ویکٹر انجینئرنگ اے اے وی ٹرانسڈکشن کی کارکردگی (ٹرانسجین کیسٹ کو بہتر بنا کر)، ویکٹر ٹراپزم (کیپسیڈ انجینئرنگ کا استعمال کرتے ہوئے) اور میزبان مدافعتی ردعمل سے بچنے کے لیے کیپسیڈ اور ٹرانسجین کی صلاحیت (ان اجزاء کو جینیاتی طور پر تبدیل کر کے) کے ساتھ ساتھ اے اے وی کی بڑے پیمانے پر پیداوار کو بہتر بنا سکتی ہے۔ مزید برآں، ہدایت شدہ ارتقاء سمیت ویکٹر انجینئرنگ کے طریقوں نے اے اے وی ویکٹرز کی کارکردگی اور ہدف میں بہت اضافہ کیا ہے، جس کے نتیجے میں کچھ معاملات میں ترسیل کی کارکردگی میں 100 گنا سے زیادہ بہتری آئی ہے۔ اے اے وی انجینئرنگ کی ایک اور مثال میں، مشین لرننگ کا اطلاق اے اے وی کے مختلف قسموں کو پیدا کرنے کے لیے کیا گیا ہے جو سابقہ نمائش سے مدافعتی ردعمل کو روک سکتے ہیں۔ وائرس جیسے ذرات۔ وائرس نما ذرات (وی ایل پی) وائرل پروٹین کی اسمبلیاں ہیں جو وائرل جینیاتی مواد کے علاوہ یا اس کے بجائے ایم آر این اے، پروٹین، یا آر این پی جیسے کارگو مواد کو پیک کرتی ہیں۔ چونکہ وی ایل پی موجودہ وائرل سکیفولڈز سے اخذ کیے جاتے ہیں، اس لیے وہ وائرس کی قدرتی خصوصیات کا استحصال کرتے ہیں جو کارگوز کو منسلک کرنے، اینڈوسومز سے بچنے، اور مختلف خلیوں کی اقسام کو نشانہ بنانے کے لیے دوبارہ پروگرام کرنے کی صلاحیت سمیت موثر انٹرا سیلولر ڈیلیوری کو قابل بناتے ہیں۔ تاہم، وائرس کے برعکس، وی ایل پی اپنے کارگو کو ڈی این اے کے بجائے ایم آر این اے یا پروٹین کے طور پر فراہم کر سکتے ہیں، جو وائرل جینوم انضمام کے خطرات کو کافی حد تک کم کرتا ہے۔ وی ایل پی اس طرح جین ایڈیٹنگ ایجنٹس جیسے مالیکیولر کارگو کی فراہمی کے لیے دلچسپی رکھتے ہیں کیونکہ وہ وائرل اور غیر وائرل ڈیلیوری دونوں کے فوائد پیش کر سکتے ہیں۔ انجینیئرڈ ڈی این اے فری وی ایل پیز کو حال ہی میں جین ایڈیٹنگ کے مقصد سے ممالیہ خلیوں کو بیس ایڈیٹر یا Cas9 ربنیوکلیوپروٹینز کو مؤثر طریقے سے پیک کرنے اور فراہم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ یہ بتایا گیا ہے کہ وی ایل پیز کے ساتھ جین ایڈیٹنگ پروٹینز کی فراہمی پلازمیڈ اور وائرل ڈیلیوری ان وٹرو کے مقابلے میں کافی حد تک کم سے کم آف ٹارگیٹ ایڈیٹنگ پیش کرتی ہے۔ حوالہ جات جین ڈیلیوری بائیوٹیکنالوجی