Nuclear magnetic resonance spectroscopy of nucleic acids
نیوکلک ایسڈ این ایم آر نیوکلک مقناطیسی گونج سپیکٹروسکوپی کا استعمال ہے تاکہ ڈی این اے یا آر این اے جیسے نیوکلک ایسڈ مالیکیولز کی ساخت اور حرکیات کے بارے میں معلومات حاصل کی جا سکیں۔ یہ 100 نیوکلیوٹائڈز تک کے مالیکیولز کے لیے مفید ہے، اور 2003 تک، تمام معروف آر این اے ڈھانچوں میں سے تقریبا نصف کا تعین این ایم آر سپیکٹروسکوپی کے ذریعے کیا گیا تھا۔ این ایم آر کے ایکس رے کرسٹلگرافی کے مقابلے میں فوائد ہیں، جو کہ ہائی ریزولوشن نیوکلک ایسڈ ڈھانچے کے تعین کا دوسرا طریقہ ہے، اس میں مالیکیولز کا مشاہدہ کرسٹل لیٹس کے بجائے ان کے قدرتی حل کی حالت میں کیا جا رہا ہے جو مالیکیول کی ساختی خصوصیات کو متاثر کر سکتا ہے۔ این ایم آر کے ساتھ حرکیات کی تحقیقات کرنا بھی ممکن ہے۔ یہ کرسٹلگرافی کے مقابلے میں قدرے کم درست اور تفصیلی ڈھانچے کی قیمت پر آتا ہے۔ نیوکلک ایسڈ این ایم آر پروٹین این ایم آر سے ملتی جلتی تکنیکیں استعمال کرتا ہے، لیکن اس میں کئی فرق ہیں۔ نیوکلک ایسڈ میں ہائیڈروجن ایٹموں کا ایک چھوٹا فیصد ہوتا ہے، جو کہ عام طور پر این ایم آر میں مشاہدہ کیے جانے والے ایٹم ہوتے ہیں، اور چونکہ نیوکلک ایسڈ ڈبل ہیلیکس سخت اور تقریبا لکیری ہوتے ہیں، اس لیے وہ "طویل فاصلے" کے ارتباط دینے کے لیے خود کو پیچھے نہیں موڑتے۔ نیوکلک ایسڈ میں بھی گونج پروٹین کے مقابلے میں چھوٹی رینج میں تقسیم ہوتی ہے، جس سے سپیکٹرم ممکنہ طور پر زیادہ ہجوم اور تشریح کرنا مشکل ہو جاتا ہے۔ تجرباتی طریقے دو جہتی این ایم آر طریقے تقریبا ہمیشہ نیوکلک ایسڈ کے ساتھ استعمال ہوتے ہیں۔ ان میں تھرو بانڈ نیوکلیئر جوڑوں کا پتہ لگانے کے لیے ارتباط سپیکٹروسکوپی (COSY) اور کل ہم آہنگی منتقلی سپیکٹروسکوپی (TOCSY)، اور خلا میں ایک دوسرے کے قریب ہونے والے مرکزوں کے درمیان جوڑوں کا پتہ لگانے کے لیے نیوکلیئر اوور ہاؤزر ایفیکٹ سپیکٹروسکوپی (NOESY) شامل ہیں۔ این ایم آر کی اقسام جو عام طور پر نیوکلک ایسڈ کے ساتھ کی جاتی ہیں وہ 1 ایچ این ایم آر، 13 سی این ایم آر، 15 این این ایم آر، اور 31 پی این ایم آر ہیں۔ 19 ایف این ایم آر اس صورت میں بھی مفید ہے جب غیر قدرتی نیوکلیوٹائڈز جیسے 2 '-فلوورو-2'-ڈیوکسیڈینوسین کو نیوکلک ایسڈ اسٹرینڈ میں شامل کیا جائے، کیونکہ قدرتی نیوکلک ایسڈ میں کوئی فلورائن ایٹم نہیں ہوتے ہیں۔ 1H اور 31P میں تقریبا 100% قدرتی کثرت ہے، جبکہ 13C اور 15N میں قدرتی کثرت کم ہے۔ ان مؤخر الذکر دو مرکزوں کے لیے، مالیکیولز کے اندر مطلوبہ ایٹموں کو آئسوٹوپک طور پر افزودہ کرنے کی صلاحیت ہے، یا تو یکساں طور پر یا سائٹ کے مخصوص انداز میں۔ 13C اور/یا 15N میں یکساں طور پر افزودہ نیوکلیوٹائڈز بائیو کیمیکل طریقوں کے ذریعے حاصل کیے جا سکتے ہیں، ڈی این ٹی پیز یا این ٹی پیز کا استعمال کرتے ہوئے پولیمریز چین ری ایکشن انجام دے کر جو آئسوٹوپک طور پر افزودہ ماحول میں اگائے گئے بیکٹیریا سے حاصل ہوتے ہیں۔ سائٹ کے لحاظ سے مخصوص آاسوٹوپ کی افزودگی لیبل شدہ نیوکلیوسائڈ فاسفورامائڈائٹ مونومر اور مکمل اسٹرینڈ کی کیمیائی ترکیب کے ذریعے کی جانی چاہیے ؛ تاہم ان کی ترکیب کرنا مشکل اور مہنگا ہے۔ چونکہ نیوکلک ایسڈ میں نسبتا بڑی تعداد میں پروٹون ہوتے ہیں جو سالوینٹ ایکسچینج ایبل ہوتے ہیں، نیوکلک ایسڈ این ایم آر عام طور پر ڈی 2 او سالوینٹ میں نہیں کیا جاتا ہے جیسا کہ این ایم آر کی دیگر اقسام میں عام ہے۔ اس کی وجہ یہ ہے کہ سالوینٹ میں موجود ڈیوٹیریم قابل تبادلہ پروٹانوں کی جگہ لے لے گا اور ان کے سگنل کو بجھا دے گا۔ H2O کو سالوینٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور مضبوط سالوینٹ سگنل کو ختم کرنے کے لیے دیگر طریقے استعمال کیے جاتے ہیں، جیسے کہ نارمل پلس سیکوینس ("پریسیچوریشن") سے پہلے سالوینٹ سگنل کو سیچوریٹ کرنا، جو نیوکلک ایسڈ پروٹون کے ساتھ سیچوریٹڈ سالوینٹ پروٹون کے تبادلے کو روکنے کے لیے کم درجہ حرارت پر بہترین کام کرتا ہے ؛ یا صرف دلچسپ گونج ("سلیکٹو ایکسائٹیشن")، جس میں چوٹی کے طول و عرض کو مسخ کرنے کا اضافی، ممکنہ طور پر ناپسندیدہ اثر ہوتا ہے۔ ساخت کا تعین قابل تبادلہ اور غیر قابل تبادلہ پروٹون عام طور پر ان کی مخصوص چوٹیوں کو دو آزاد گروہوں کے طور پر تفویض کیے جاتے ہیں۔ قابل تبادلہ پروٹانوں کے لیے، جو زیادہ تر بیس جوڑی میں شامل پروٹان ہوتے ہیں، NOESY کو پڑوسی اڈوں کے درمیان تھرو اسپیس ارتباط تلاش کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جس سے ایک پورے ڈوپلیکس مالیکیول کو ترتیب وار چلنے کے ذریعے تفویض کیا جا سکتا ہے۔ غیر متغیر پروٹانوں کے لیے، جن میں سے بہت سے نیوکلک ایسڈ کے شکر کے حصے پر ہوتے ہیں، COSY اور TOCSY کا استعمال جوڑے ہوئے مرکزوں کے نظام کی شناخت کے لیے کیا جاتا ہے، جبکہ NOESY کا استعمال چینی کو بیس اور ہر بیس کو اس کے پڑوسی بیس سے مربوط کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ ڈوپلیکس ڈی این اے کے غیر متغیر پروٹونوں کے لیے بیس پر موجود H6/H8 پروٹون پڑوسی اڈوں پر اپنے ہم منصبوں اور چینی پر موجود H1 پروٹون سے مطابقت رکھتے ہیں، جس سے ترتیب وار چہل قدمی کی جا سکتی ہے۔ آر این اے کے لیے، کیمیائی ساخت اور ہیلکس جیومیٹری میں فرق اس تفویض کو تکنیکی طور پر زیادہ مشکل بناتا ہے، لیکن پھر بھی ممکن ہے۔ غیر ڈبل ہیلیکل نیوکلک ایسڈ ڈھانچوں کے لیے ترتیب وار چلنے کا طریقہ کار ممکن نہیں ہے، اور نہ ہی زیڈ-ڈی این اے فارم کے لیے، جس سے گونج کی تفویض زیادہ مشکل ہو جاتی ہے۔ سپیکٹرم سے لیے گئے پیرامیٹرز، بنیادی طور پر NOESY کراس چوٹیاں اور جوڑے کے مستقل، مقامی ساختی خصوصیات جیسے گلائکوسیڈک بانڈ اینگلز، ڈائی ہیڈرل اینگلز (کارپلس مساوات کا استعمال کرتے ہوئے)، اور شوگر پکر کنفارمیشنز کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ امینو پروٹون گونج کی موجودگی یا عدم موجودگی، یا ہائیڈروجن بانڈ کے پار 15N ایٹموں کے درمیان جوڑے کی موجودگی، بیس پیئرنگ کی موجودگی یا عدم موجودگی کی نشاندہی کرتی ہے۔ بڑے پیمانے کے ڈھانچے کے لیے، ان مقامی پیرامیٹرز کو دیگر ساختی مفروضوں یا ماڈلز کے ساتھ مکمل کیا جانا چاہیے، کیونکہ ڈبل ہیلکس کو عبور کرنے کے ساتھ غلطیاں بڑھ جاتی ہیں، اور پروٹین کے برعکس، ڈبل ہیلکس میں کمپیکٹ داخلہ نہیں ہوتا ہے اور یہ خود پر واپس نہیں آتا ہے۔ تاہم، طویل فاصلے کی واقفیت کی معلومات ایک میڈیم میں بقایا دو قطبی جوڑے کے تجربات کے ذریعے حاصل کی جا سکتی ہیں جو نیوکلک ایسڈ کے مالیکیولز پر کمزور صف بندی عائد کرتی ہے۔ حال ہی میں، نیوکلک ایسڈ کی ساخت کے تعین کے لیے سالڈ اسٹیٹ این ایم آر طریقہ کار متعارف کرایا گیا ہے۔ پروٹوکول دو طریقوں کا اشارہ کرتا ہے: آر این اے کی نیوکلیوٹائڈ قسم کی انتخابی لیبلنگ اور ہیٹرو نیوکلیئر ارتباط تجربات کا استعمال۔ این ایم آر غیر معیاری جیومیٹریز جیسے کہ جھکی ہوئی ہیلیکس، غیر واٹسن-کرک بیس پیئرنگ، اور کوایکسیل اسٹیکنگ کی تحقیقات کے لیے بھی مفید ہے۔ یہ قدرتی آر این اے اولیگونیوکلیوٹائڈز کی ساخت کی تحقیقات میں خاص طور پر مفید رہا ہے، جو اسٹیم لوپس اور سیوڈوکنوٹس جیسی پیچیدہ تشکیلات کو اپناتے ہیں۔ آر این اے اور دھاتی آئنوں کے درمیان تعاملات کی جانچ کئی طریقوں سے کی جا سکتی ہے، جن میں آئن بائنڈنگ پر کیمیائی تبدیلی میں ہونے والی تبدیلیوں کا مشاہدہ کرنا، پیرا مقناطیسی آئن پرجاتیوں کے لیے لکیر کو وسیع کرنے کا مشاہدہ کرنا، اور دھاتی آئنوں کی آرگنامیٹالک نقلوں کے لیے بین سالماتی این او ای رابطوں کا مشاہدہ کرنا شامل ہیں۔ این ایم آر نیوکلک ایسڈ کے مالیکیولز کے دوسرے مالیکیولز، جیسے پروٹین یا منشیات کے پابند ہونے کی تحقیقات کے لیے بھی مفید ہے۔ یہ کیمیائی شفٹ میپنگ کے ذریعے کیا جا سکتا ہے، جو یہ دیکھ رہا ہے کہ دوسرے مالیکیول کے بائنڈنگ پر کون سی گونج منتقل ہوتی ہے، یا کراس سیچوریشن تجربات کے ذریعے جہاں بائنڈنگ مالیکیولز میں سے ایک منتخب طور پر سیچوریٹڈ ہوتا ہے اور اگر بائنڈ ہوتا ہے تو سیچوریشن کمپلیکس میں دوسرے مالیکیول میں منتقل ہو جاتی ہے۔ متحرک خصوصیات جیسے ڈوپلیکس-سنگل اسٹرینڈ ایکویلیبریا اور دوسرے مالیکیولز کی ڈوپلیکسز سے بائنڈنگ کی شرحوں کا تعین بھی اسپن-لیٹس کے آرام کے وقت T1 پر اس کے اثر سے کیا جا سکتا ہے، لیکن یہ طریقے 104-108 s−1 کی درمیانی شرحوں کے لیے غیر حساس ہیں، جن کی ٹھوس حالت این ایم آر جیسے دیگر طریقوں سے تفتیش کی جانی چاہیے۔ نیوکلک ایسڈ ڈبل ہیلکس جیسے موڑنے اور موڑنے کی مکینیکل خصوصیات کی حرکیات کا بھی این ایم آر کا استعمال کرتے ہوئے مطالعہ کیا جا سکتا ہے۔ پلسڈ فیلڈ گریڈینٹ این ایم آر تجربات کو پھیلاؤ کے مستقل کی پیمائش کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ نیوکلک ایسڈ این ایم آر کے مطالعے 1971 کے اوائل میں کیے گئے تھے، اور بیس جوڑی کے تعاملات کی تحقیقات کے لیے کم فیلڈ والے امینو پروٹون گونج کے استعمال پر توجہ مرکوز کی گئی تھی۔ ان ابتدائی مطالعات نے ٹی آر این اے پر توجہ مرکوز کی کیونکہ یہ نیوکلک ایسڈ اس وقت دستیاب واحد نمونے تھے جن کا سالماتی وزن اتنا کم تھا کہ این ایم آر سپیکٹرم لائن کی چوڑائی عملی تھی۔ مطالعہ میں کم فیلڈ والے پروٹانوں پر توجہ مرکوز کی گئی کیونکہ وہ واحد پروٹان تھے جن کا اس وقت دستیاب بہترین سپیکٹرومیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے آبی محلول میں قابل اعتماد مشاہدہ کیا جا سکتا تھا۔ یہ فوری طور پر محسوس کیا گیا کہ کم فیلڈ والے امینو پروٹانوں کا سپیکٹرا حل میں ٹی آر این اے کی ترتیری ساخت کا سراغ فراہم کر رہا ہے۔ ڈبل ہیلکل ڈی این اے کا پہلا این ایم آر سپیکٹرم 1977 میں مصنوعی، 30 بیس جوڑی ڈبل ہیلکس کا استعمال کرتے ہوئے شائع کیا گیا تھا۔ مقامی ڈی این اے میں شدید لکیر کی توسیع پر قابو پانے کے لیے، سراسر انحطاط شدہ قدرتی ڈی این اے تیار کیا گیا اور ڈبل ہیلکل ڈی این اے کی استقامت کی لمبائی کے بارے میں جاننے کے لیے اس کا مطالعہ کیا گیا۔ اسی وقت، ڈبل ہیلکس کی لچک کے بارے میں مزید بصیرت حاصل کرنے کے لیے نیوکلیوسوم کے بنیادی ذرات کا مطالعہ کیا گیا۔ پہلا این ایم آر سپیکٹرا جو یکساں کم سالماتی وزن کے مقامی ترتیب والے ڈی این اے کے لیے رپورٹ کیا گیا تھا، جو پابندی والے انزائموں سے بنایا گیا تھا، 1981 میں رپورٹ کیا گیا تھا۔ یہ کام ہائی فیلڈ پر حاصل ہونے والے نیوکلک ایسڈ این ایم آر سپیکٹر کی پہلی رپورٹ بھی تھی۔ دو جہتی این ایم آر مطالعات کی اطلاع 1982 میں دی جانی شروع ہوئی اور پھر، اولیگونیوکلیوٹائڈ کی ترکیب اور زیادہ نفیس آلات کی آمد کے ساتھ، 1983 میں شروع ہونے والے بہت سے تفصیلی ساختی مطالعات کی اطلاع دی گئی۔ نیوکلیئر مقناطیسی گونج سپیکٹروسکوپی نیوکلک ایسڈ بائیو فزکس