DNA construct
ڈی این اے کی تعمیر ڈی این اے کا ایک مصنوعی طور پر ڈیزائن کیا گیا حصہ ہے جو ایک ویکٹر پر پیدا ہوتا ہے جسے جینیاتی مواد کو ہدف ٹشو یا سیل میں شامل کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ڈی این اے کی تعمیر میں ایک ڈی این اے داخل ہوتا ہے، جسے ٹرانسجین کہا جاتا ہے، جو ایک ٹرانسفارمیشن ویکٹر کے ذریعے پہنچایا جاتا ہے جو داخل کی ترتیب کو ٹارگٹ سیل میں نقل کرنے اور/یا اظہار کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ اس جین کو قدرتی طور پر پائے جانے والے جین سے کلون کیا جا سکتا ہے، یا مصنوعی طور پر بنایا جا سکتا ہے۔ ویکٹر کو فزیکل، کیمیائی یا وائرل طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے پہنچایا جا سکتا ہے۔ عام طور پر، ڈی این اے کی تعمیرات میں استعمال ہونے والے ویکٹروں میں نقل کی ابتدا، ایک سے زیادہ کلوننگ سائٹ، اور ایک قابل انتخاب مارکر ہوتا ہے۔ کچھ ویکٹر شامل اظہار کے نظام کی بنیاد پر اضافی ریگولیٹری عناصر کو لے جا سکتے ہیں۔ ڈی این اے کی تعمیرات اتنی ہی چھوٹی ہو سکتی ہیں جتنی کہ ایک ہی جین کو لے جانے والے ڈی این اے کے چند ہزار بیس جوڑے (کے بی پی)، جن میں پلازمیڈز یا بیکٹیریوفیجز جیسے ویکٹر استعمال ہوتے ہیں، یا مصنوعی کروموسوم کا استعمال کرتے ہوئے بڑے پیمانے پر جینومک مطالعات کے لیے سینکڑوں کے بی پی تک بڑے ہو سکتے ہیں۔ ڈی این اے کی تعمیر جنگلی قسم کے پروٹین کا اظہار کر سکتی ہے، حریفوں یا انابائٹرز کا اظہار کرکے بعض جینوں کے اظہار کو روک سکتی ہے، یا میوٹینٹ پروٹین کا اظہار کر سکتی ہے، جیسے کہ حذف شدہ تغیرات یا مسسینس میوٹیشنز۔ ڈی این اے کی تعمیرات کو ڈی این اے کی ترتیب، پروٹین کے اظہار، اور آر این اے کے مطالعے جیسی تکنیکوں کے لیے سالماتی حیاتیات کی تحقیق میں بڑے پیمانے پر ڈھال لیا جاتا ہے۔ پہلا معیاری ویکٹر، پی بی آر 220، 1977 میں ہربرٹ بوئر کی لیب کے محققین نے ڈیزائن کیا تھا۔ پلازمیڈ میں مختلف پابندی والے انزائم سائٹس اور ٹرانسپوسن سرگرمیوں سے پاک ایک مستحکم اینٹی بائیوٹک مزاحمت جین ہوتا ہے۔ 1982 میں، جیفری ویئرا اور جوآخم میسنگ نے ایم 13 ایم پی 7 سے ماخوذ پی یو سی ویکٹرز کی ترقی کو بیان کیا جو ایک سے زیادہ کلوننگ سائٹ پر مشتمل ہے اور یونیورسل ایم 13 پرائمرز کے ایک سیٹ کا استعمال کرتے ہوئے زیادہ موثر ترتیب اور کلوننگ کی اجازت دیتا ہے۔ تین سال بعد، فی الحال مقبول پی یو سی 19 پلاسمڈ کو انہی سائنسدانوں نے تیار کیا تھا۔ دلچسپی کی ڈی این اے ترتیب پر موجود جین کو یا تو موجودہ ترتیب سے کلون کیا جا سکتا ہے یا مصنوعی طور پر تیار کیا جا سکتا ہے۔ کسی جاندار میں قدرتی طور پر پائے جانے والے سلسلے کو کلون کرنے کے لیے، جاندار کے ڈی این اے کو پہلے پابندی والے انزائموں سے کاٹا جاتا ہے، جو ڈی این اے کے سلسلے کو پہچانتے ہیں اور انہیں ہدف جین کے ارد گرد کاٹتے ہیں۔ اس کے بعد جین کو پولیمریز چین ری ایکشن (پی سی آر) کا استعمال کرتے ہوئے بڑھایا جا سکتا ہے۔ عام طور پر، اس عمل میں ابتدائی طور پر ٹارگٹ سیکوینس میں ہائبرڈائز کرنے کے لیے پرائمرز کے نام سے جانے والے مختصر سیکوینسز کا استعمال شامل ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، پوائنٹ میوٹیشنز کو پرائمر سیکوینسز میں متعارف کرایا جا سکتا ہے اور پھر ٹارگٹ سیکوینس میں ترمیم کرنے کے لیے ہر سائیکل میں کاپی کیا جا سکتا ہے۔ ڈی این اے کی تعمیر کے لیے ہدف ڈی این اے اسٹرینڈ کی ترکیب کرنا بھی ممکن ہے۔ ڈی این اے کے چھوٹے تار جو اولیگونیوکلیوٹائڈز کے نام سے جانے جاتے ہیں کالم پر مبنی ترکیب کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے جا سکتے ہیں، جس میں اڈوں کو ایک ٹھوس مرحلے سے منسلک ڈی این اے کے تار میں ایک وقت میں شامل کیا جاتا ہے۔ ہر بیس میں ربط کو روکنے کے لیے ایک حفاظتی گروپ ہوتا ہے جسے اس وقت تک نہیں ہٹایا جاتا جب تک کہ اگلا بیس شامل کرنے کے لیے تیار نہ ہو، اس بات کو یقینی بناتے ہوئے کہ وہ صحیح ترتیب میں جڑے ہوئے ہیں۔ اولیگونیوکلیوٹائڈز کو مائیکرو آرے پر بھی ترکیب کیا جا سکتا ہے، جو لاگت کو کم کرنے کے لیے دسیوں ہزار ترتیبات کو ایک ساتھ ترکیب کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ ایک بڑے جین کی ترکیب کے لیے، اولیگونیوکلیوٹائڈز سروں پر اوور لیپنگ ترتیب کے ساتھ تیار کیے جاتے ہیں اور پھر ایک ساتھ جڑ جاتے ہیں۔ سب سے عام طریقہ کو پولیمرس سائیکلنگ اسمبلی (پی سی اے) کہا جاتا ہے: ٹکڑے اوور لیپنگ علاقوں میں ہائبرڈائز ہوتے ہیں اور توسیع پذیر ہوتے ہیں، اور ہر سائیکل میں بڑے ٹکڑے بنائے جاتے ہیں۔ ایک بار جب کسی ترتیب کو الگ کر دیا جاتا ہے، تو اسے ویکٹر میں داخل کرنا ضروری ہے۔ ایسا کرنے کا سب سے آسان طریقہ یہ ہے کہ پابندی والے انزائموں کا استعمال کرتے ہوئے ویکٹر ڈی این اے کو کاٹا جائے۔ اگر وہی انزائم ہدف کی ترتیب کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے، تو ہر سرے پر وہی "اوور ہینگ" ترتیبات بنائے جائیں گے جو ہائبرڈائزیشن کی اجازت دیتے ہیں۔ ایک بار جب ہدف جین ویکٹر ڈی این اے میں ہائبرڈ ہو جاتا ہے، تو انہیں ڈی این اے لیگز کا استعمال کرتے ہوئے شامل کیا جا سکتا ہے۔ ایک متبادل حکمت عملی ہدف جین اور ویکٹر ترتیب پر ہومولوگس سائٹس کے درمیان دوبارہ ملاپ کا استعمال کرتی ہے، جس سے پابندی والے انزائموں کی ضرورت ختم ہو جاتی ہے۔ ترسیل کے طریقے ڈی این اے کی تعمیر کی ترسیل کے تین عمومی زمرے ہیں: جسمانی، کیمیائی اور وائرل۔ جسمانی طریقے، جو جسمانی طور پر خلیے میں گھس کر ڈی این اے فراہم کرتے ہیں، ان میں مائیکرو انجیکشن، الیکٹروپوریشن، اور بائیولسٹکس شامل ہیں۔ کیمیائی طریقے ڈی این اے کی فراہمی کے لیے کیمیائی رد عمل پر انحصار کرتے ہیں اور ان میں کیلشیم فاسفیٹ کا استعمال کرتے ہوئے قابل بنائے گئے خلیوں کے ساتھ تبدیلی کے ساتھ ساتھ لپڈ نینو پارٹیکلز کے ذریعے ترسیل بھی شامل ہے۔ وائرل طریقے ڈی این اے کی فراہمی کے لیے مختلف قسم کے وائرل ویکٹرز کا استعمال کرتے ہیں، جن میں اڈینو وائرس، لینٹیوائرس، اور ہرپس سمپلیکس وائرس ویکٹر ڈھانچہ شامل ہیں۔ ٹارگٹ جین کے علاوہ، ویکٹر میں تین اہم عناصر ہوتے ہیں: نقل کی ابتدا، ایک منتخب مارکر، اور ایک سے زیادہ کلوننگ سائٹ۔ نقل کی ابتدا ایک ڈی این اے ترتیب ہے جو ڈی این اے نقل کا عمل شروع کرتی ہے، جس سے ویکٹر خود کلون کر سکتا ہے۔ ایک سے زیادہ کلوننگ سائٹ میں کئی پابندی والے انزائموں کے لیے بائنڈنگ سائٹس ہوتے ہیں، جس سے ویکٹر میں مختلف ڈی این اے کے سلسلے داخل کرنا آسان ہو جاتا ہے۔ ایک سلیکٹ ایبل مارکر کچھ ایسی خاصیت فراہم کرتا ہے جسے میزبان خلیے میں آسانی سے منتخب کیا جا سکتا ہے، تاکہ اس بات کا تعین کیا جا سکے کہ آیا تبدیلی کامیاب رہی تھی۔ سب سے عام منتخب کردہ مارکر اینٹی بائیوٹک مزاحمت کے لیے جین ہیں، تاکہ تعمیر کے بغیر میزبان خلیات اینٹی باڈی کے سامنے آنے پر مر جائیں اور صرف تعمیر کے ساتھ میزبان خلیات ہی رہیں گے۔ ڈی این اے کی تعمیر کی اقسام بیکٹیریل پلازمیڈز ڈی این اے کے سرکلر حصے ہیں جو قدرتی طور پر بیکٹیریا میں نقل کرتے ہیں۔ پلازمیڈز لمبائی میں تقریبا 20 کے بی پی تک داخل کرنے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔ اس قسم کی تعمیرات میں عام طور پر ایک جین ہوتا ہے جو اینٹی بائیوٹک مزاحمت پیش کرتا ہے، نقل کی ابتدا، ریگولیٹری عناصر جیسے لیک انفیکٹرز، ایک پولی لنکر، اور ایک پروٹین ٹیگ ہوتا ہے جو پروٹین کی صفائی کو آسان بناتا ہے۔ بیکٹیریوفیج ویکٹر وہ وائرس ہیں جو بیکٹیریا کو متاثر کر سکتے ہیں اور اپنے ڈی این اے کی نقل تیار کر سکتے ہیں۔ مصنوعی کروموسوم عام طور پر جینوم پروجیکٹ کے مطالعے میں 350 کے بی پی تک داخل کرنے کی صلاحیت کی وجہ سے استعمال ہوتے ہیں۔ یہ ویکٹر ایف پلازمیڈ سے اخذ کیے گئے ہیں، جو ایف فیکٹر کے ذریعے متعارف کرائی گئی اعلی استحکام اور جوڑنے کی صلاحیت سے فائدہ اٹھاتے ہیں۔ فوسمائڈز بیکٹیریل ایف پلاسمائڈز اور λ فیج کلوننگ تکنیک کے درمیان ایک ہائبرڈ ہیں۔ داخل کو فیج ذرات میں پہلے سے پیک کیا جاتا ہے، پھر میزبان خلیے میں ~ 45 کے بی پی رکھنے کی صلاحیت کے ساتھ داخل کیا جاتا ہے۔ وہ عام طور پر ان کے بڑھتے ہوئے استحکام کی وجہ سے ڈی این اے لائبریری بنانے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ ڈی این اے تعمیرات کو پروٹین تیار کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، بشمول قدرتی طور پر پائے جانے والے پروٹین اور انجینیئرڈ میوٹینٹ پروٹین دونوں۔ ان پروٹینوں کو علاج کی مصنوعات، جیسے دواسازی اور اینٹی باڈیز بنانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ڈی این اے کی تعمیرات ریگولیٹری ترتیبات جیسے پروموٹرز اور انفیکٹرز کا اظہار کرکے دوسرے جینوں کے اظہار کی سطح کو بھی تبدیل کر سکتی ہیں۔ مزید برآں، ڈی این اے تعمیرات کو تحقیق کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جیسے کہ جینومک لائبریریاں بنانا، کلون شدہ ڈی این اے کی ترتیب، اور آر این اے اور پروٹین کے اظہار کا مطالعہ کرنا۔ ویکٹر (سالماتی حیاتیات) حوالہ جات ڈی این اے جینوم ایڈیٹنگ بھی دیکھیں۔