Immunoassay
امیونواسے (آئی اے) ایک بائیو کیمیکل ٹیسٹ ہے جو اینٹی باڈی (عام طور پر) یا اینٹیجن (بعض اوقات) کے استعمال کے ذریعے حل میں میکرو مالیکیول یا چھوٹے مالیکیول کی موجودگی یا ارتکاز کی پیمائش کرتا ہے۔ امیونواسے کے ذریعے پائے جانے والے مالیکیول کو اکثر "اینالیٹ" کہا جاتا ہے اور بہت سے معاملات میں یہ ایک پروٹین ہوتا ہے، حالانکہ یہ مختلف سائز اور اقسام کے دیگر قسم کے مالیکیول ہو سکتے ہیں، جب تک کہ مناسب اینٹی باڈیز تیار ہوں جن میں جانچ کے لیے مطلوبہ خصوصیات ہوں۔ حیاتیاتی مائعوں جیسے سیرم یا پیشاب میں تجزیہ اکثر طبی اور تحقیقی مقاصد کے لیے امیونواسس کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جاتا ہے۔ امیونواسے بہت سے مختلف فارمیٹس اور تغیرات میں آتے ہیں۔ امیونواسے کو متعدد مراحل میں چلایا جا سکتا ہے جس میں ریجینٹ شامل کیے جاتے ہیں اور جانچ میں مختلف مقامات پر دھوئے جاتے ہیں یا الگ کیے جاتے ہیں۔ ملٹی اسٹیپ اسیسز کو اکثر سیپرشن امیونو اسیسز یا ہیٹرجینیئس امیونو اسیسز کہا جاتا ہے۔ کچھ امیونواسے محض ریجینٹس اور نمونوں کو ملا کر اور جسمانی پیمائش کر کے کیے جا سکتے ہیں۔ اس طرح کے تجزیے کو یکساں امیونواسے، یا کم کثرت سے غیر علیحدگی امیونواسے کہا جاتا ہے۔ کیلیبریٹر کا استعمال اکثر امیونواسس میں کیا جاتا ہے۔ کیلیبریٹر وہ حل ہیں جو زیر بحث اینالائٹ پر مشتمل ہونے کے لیے جانے جاتے ہیں، اور اس اینالائٹ کا ارتکاز عام طور پر جانا جاتا ہے۔ کیلیبریٹرز کے ذریعہ تیار کردہ جانچ کے ردعمل کے خلاف حقیقی نمونے کے ساتھ جانچ کے ردعمل کا موازنہ نمونے میں تجزیہ کی موجودگی یا ارتکاز کے لحاظ سے سگنل کی طاقت کی تشریح کرنا ممکن بناتا ہے۔ اصول امیونواسس ایک اینٹی باڈی کی صلاحیت پر انحصار کرتے ہیں کہ وہ ایک مخصوص میکرو مالیکیول کو پہچان سکے اور باندھ سکے جو کہ میکرو مالیکیولز کا ایک پیچیدہ مرکب ہو سکتا ہے۔ امیونولوجی میں اینٹی باڈی سے جڑے مخصوص میکرو مالیکیول کو اینٹیجن کہا جاتا ہے اور اینٹیجن پر وہ علاقہ جس سے اینٹی باڈی جڑی ہوتی ہے اسے ایپیٹوپ کہا جاتا ہے۔ بعض صورتوں میں، امیونواسے اینٹی باڈیز کی موجودگی کا پتہ لگانے کے لیے اینٹیجن کا استعمال کر سکتا ہے، جو اس اینٹیجن کو حل میں پہچانتے ہیں۔ دوسرے لفظوں میں، کچھ امیونواسس میں، اینالائٹ اینٹیجن کے بجائے اینٹی باڈی ہو سکتا ہے۔ اینٹی باڈی کو اس کے اینٹیجن سے باندھنے کے علاوہ، تمام امیونواسس کی دوسری کلیدی خصوصیت بائنڈنگ کے جواب میں قابل پیمائش سگنل پیدا کرنے کا ایک ذریعہ ہے۔ زیادہ تر، اگرچہ سبھی نہیں، امیونواسس میں کیمیائی طور پر اینٹی باڈیز یا اینٹی جینز کو کسی قسم کے قابل شناخت لیبل سے جوڑنا شامل ہوتا ہے۔ جدید امیونواسس میں بڑی تعداد میں لیبل موجود ہیں، اور وہ مختلف ذرائع سے پتہ لگانے کی اجازت دیتے ہیں۔ بہت سے لیبل قابل شناخت ہوتے ہیں کیونکہ وہ یا تو تابکاری کا اخراج کرتے ہیں، محلول میں رنگ کی تبدیلی پیدا کرتے ہیں، روشنی کے نیچے فلوروس کرتے ہیں، یا روشنی کو خارج کرنے کے لیے آمادہ کیے جا سکتے ہیں۔ روزالن سوسمین یلو اور سولومن برسن کو 1950 کی دہائی میں پہلی امیونواسس کی ترقی کا سہرا دیا جاتا ہے۔ یالو نے 1977 میں امیونواسس میں اپنے کام کے لیے نوبل انعام قبول کیا، اور یہ ایوارڈ جیتنے والی دوسری امریکی خاتون بن گئیں۔ امیونواسے انجام دینے میں کافی آسان اور زیادہ مقبول ہو گئے جب 1960 کی دہائی کے آخر میں اینٹی باڈیز سے کیمیائی طور پر منسلک انزائموں کی تکنیکوں کا مظاہرہ کیا گیا۔ 1983 میں، کارڈف یونیورسٹی کے پروفیسر انتھونی کیمبل نے امیونواسے میں استعمال ہونے والے تابکار آیوڈین کی جگہ ایکریڈینیم ایسٹر لیا جو اپنی روشنی خود بناتا ہے: کیمیلومینسینس۔ اس قسم کی امیونواسے اب دنیا بھر میں ہر سال تقریبا 100 ملین کلینیکل ٹیسٹوں میں استعمال ہوتی ہے، جس سے معالجین خون کے نمونوں میں پروٹین، پیتھوجینز اور دیگر مالیکیولز کی ایک وسیع رینج کی پیمائش کر سکتے ہیں۔ 2012 تک، تجارتی امیونواسے انڈسٹری نے کمائی کی اور سوچا گیا کہ 2 سے 3 فیصد کی حد میں سست سالانہ نمو کے امکانات ہیں۔ لیبل امیونواسس اینٹی باڈیز اور اینٹی جینز کا پتہ لگانے کی اجازت دینے کے لیے مختلف قسم کے لیبل استعمال کرتے ہیں۔ لیبل عام طور پر مطلوبہ اینٹی باڈی یا اینٹیجن سے کیمیائی طور پر منسلک یا مربوط ہوتے ہیں۔ انزائمز ممکنہ طور پر امیونواسس میں استعمال ہونے والے سب سے مشہور لیبلز میں سے ایک انزائمز ہیں۔ انزائموں کو استعمال کرنے والے امیونواسس کو انزائم امیونواسس (ای آئی اے) کہا جاتا ہے، جن میں سے انزائم سے منسلک امیونوسوربنٹ اسیس (ای ایل آئی ایس اے) اور انزائم ملٹی پلائیڈ امیونواسے تکنیک (ای ایم آئی ٹی) سب سے عام اقسام ہیں۔ ایل آئی ایس اے میں استعمال ہونے والے انزائموں میں ہارس ڈیش پیرو آکسائیڈیز (ایچ آر پی)، الکلائن فاسفیٹیز (اے پی) یا گلوکوز آکسیڈیز شامل ہیں۔ یہ انزائم اکثر پتہ لگانے کی اجازت دیتے ہیں کیونکہ وہ بعض ریجینٹس کی موجودگی میں قابل مشاہدہ رنگ کی تبدیلی پیدا کرتے ہیں۔ بعض صورتوں میں یہ انزائم ریجینٹس کے سامنے آ جاتے ہیں جس کی وجہ سے وہ روشنی یا کیمیلومینسینس پیدا کرتے ہیں۔ تابکار آاسوٹوپس تابکار آاسوٹوپس کو امیونواسے ریجینٹس میں شامل کیا جا سکتا ہے تاکہ ریڈیو امیونواسے (آر آئی اے) تیار کیا جا سکے۔ باؤنڈ اینٹی باڈی-اینٹیجن کمپلیکس سے خارج ہونے والی تابکاری کا روایتی طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے آسانی سے پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ آر آئی اے کچھ ابتدائی امیونواسس تھے جو تیار کیے گئے تھے، لیکن تابکاری کے ساتھ کام کرنے سے پیش آنے والی مشکل اور ممکنہ خطرات کی وجہ سے بڑے پیمانے پر ان کے حق سے باہر ہو گئے ہیں۔ ڈی این اے رپورٹرز امیونواسس کے لیے ایک نئے نقطہ نظر میں ریئل ٹائم مقداری پولیمریز چین ری ایکشن (آر ٹی کیو پی سی آر) اور روایتی امیونواسے تکنیک کو یکجا کرنا شامل ہے۔ ریئل ٹائم امیونوکوینٹیٹو پی سی آر (آئی کیو پی سی آر) کہلانے والا ان جانچوں میں استعمال ہونے والا لیبل ڈی این اے پروب ہے۔ فلورجینک رپورٹرز فلورجینک رپورٹرز جیسے فائیکوریتھرین کا استعمال متعدد جدید امیونواسس میں کیا جاتا ہے۔ پروٹین مائکرو ایریز امیونواسے کی ایک قسم ہے جو اکثر فلوروجینک رپورٹرز کو ملازمت دیتی ہے۔ الیکٹروکیمیلیومینسینٹ ٹیگز کچھ لیبل الیکٹروکیمیلیومینسینس (ای سی ایل) کے ذریعے کام کرتے ہیں، جس میں لیبل برقی کرنٹ کے جواب میں قابل شناخت روشنی خارج کرتا ہے۔ لیبل فری امیونواسے اگرچہ عام طور پر امیونواسے میں کسی قسم کا لیبل استعمال کیا جاتا ہے، لیکن بعض قسم کے اسیسے ہوتے ہیں جو لیبل پر انحصار نہیں کرتے، بلکہ اس کے بجائے پتہ لگانے کے طریقوں کو استعمال کرتے ہیں جن کے لیے اسیسے کے اجزاء میں ترمیم یا لیبلنگ کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔ سرفیس پلازمون ریزونینس ایسی تکنیک کی ایک مثال ہے جو غیر لیبل شدہ اینٹی باڈی اور اینٹی جینز کے درمیان بائنڈنگ کا پتہ لگا سکتی ہے۔ ایک اور بے لیبل امیونواسے میں الیکٹروڈ پر مزاحمت میں تبدیلی کی پیمائش شامل ہے کیونکہ اینٹیجن اس سے جڑے ہوتے ہیں۔ درجہ بندی اور فارمیٹس امیونواسے کو متعدد مختلف فارمیٹس میں چلایا جا سکتا ہے۔ عام طور پر، ایک امیونواسے کئی زمروں میں سے ایک میں آتا ہے جس کا انحصار اس بات پر ہوتا ہے کہ اسے کیسے چلایا جاتا ہے۔ مسابقتی، یکساں امیونواسے ایک مسابقتی، یکساں امیونواسے میں، نمونے میں غیر لیبل شدہ تجزیہ ایک اینٹی باڈی کو باندھنے کے لیے لیبل شدہ تجزیہ کے ساتھ مقابلہ کرتا ہے۔ اس کے بعد لیبل شدہ، غیر پابند تجزیہ کی مقدار کی پیمائش کی جاتی ہے۔ نظریہ طور پر، نمونے میں جتنا زیادہ تجزیہ ہوتا ہے، اتنا ہی زیادہ لیبل شدہ تجزیہ بے گھر ہو جاتا ہے اور پھر ناپا جاتا ہے۔ اس لیے، لیبل شدہ، غیر پابند تجزیہ کی مقدار نمونے میں تجزیہ کی مقدار کے متناسب ہوتی ہے۔ فلوروسینس پولرائزیشن امیونواسے (ایف پی آئی اے) باؤنڈ اور فری لیبلز کو الگ کیے بغیر انکیوبیشن کے بعد فلوروسینس پولرائزیشن سگنل کی پیمائش کرتا ہے۔ نمونے میں فری لیبلڈ اینالیٹ اینالاگ مالیکیولز شامل کیے جاتے ہیں، اور ان کی براؤنین حرکت اس وقت مختلف ہوتی ہے جب وہ ایک بڑے اینٹی باڈی (اے بی) بمقابلہ حل میں فری سے جڑے ہوتے ہیں۔ تجزیہ کار اب کے پابند ہونے کے لیے مقابلہ کرتا ہے، اور اگر لیبل شدہ تجزیہ کار اب کے پابند ہوتا ہے، تو ایک سگنل پیدا ہوتا ہے۔ سگنل کی شدت تجزیاتی ارتکاز کے الٹا متناسب ہوتی ہے۔ انزائم ملٹی پلائیڈ امیونواسے تکنیک (ای ایم آئی ٹی) میں، ایک انزائم (مثال کے طور پر، گلوکوز-6-فاسفیٹ ڈی ہائیڈروجنیز انزائم) کے ساتھ لیبل شدہ فری اینالائٹ اینالاگ مالیکیول ٹیسٹ کیے جانے والے اینالائٹ سے مقابلہ کرتے ہیں۔ فعال انزائم این اے ڈی (کوئی سگنل نہیں) کو این اے ڈی ایچ (جو 340 این ایم پر جذب ہوتا ہے) میں کم کر دیتا ہے، اس لیے جذب کی نگرانی 340 این ایم پر کی جاتی ہے۔ جب لیبل شدہ اینالائٹ اے بی سے جڑا ہوتا ہے، تو انزائم غیر فعال ہو جاتا ہے، اور فری لیبل کے ذریعے ایک سگنل پیدا ہوتا ہے۔ سگنل کی شدت تجزیاتی ارتکاز کے براہ راست متناسب ہوتی ہے۔ لومینسینٹ آکسیجن چینلنگ امیونواسے (ایل او سی آئی) اینالیٹ کے ساتھ مل کر مائیکرو بیڈز میں سنگل آکسیجن پرجاتیوں کو پیدا کرتا ہے، اور جب اینالیٹ متعلقہ اے بی مالیکیول سے جڑا ہوتا ہے، تو دوسری قسم کے مالا کے ساتھ مل کر، اینالیٹ سنگل آکسیجن کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے، جس سے اینالیٹ-اے بی کمپلیکس کے ارتکاز کے متناسب کیمیلومینسینس سگنلز پیدا ہوتے ہیں۔ مائکرو پارٹیکل ان سولیوشن (کے آئی ایم ایس) اور پارٹیکل انہانسڈ ٹربیڈیمیٹرک انفیکشن امیونواسے (پیٹینیا) کے حرکی تعامل میں، آزاد اینٹی باڈیز منشیات کے مائکرو پارٹیکل کنجوگیٹس سے جڑے ہوتے ہیں تاکہ وہ مجموعے تشکیل دے سکیں جو اینالیٹ کی عدم موجودگی میں مرئی حد میں جذب ہوتے ہیں۔ تجزیہ کار کی موجودگی میں، اے بی آزاد تجزیہ کار سے جڑا رہتا ہے، مائکرو پارٹیکل جمع ہونے سے روکتا ہے اور جذب میں کمی کا سبب بنتا ہے۔ سگنل تجزیاتی ارتکاز کے الٹا متناسب ہوتا ہے۔ کلون شدہ انزائم ڈونر امیونواسے (سی ای ڈی آئی اے) میں جینیاتی طور پر ایک انزائم (مثال کے طور پر، بیٹا-گیلیکٹوسیڈیز) کو دو غیر فعال ٹکڑوں میں انجینئرنگ کرنا شامل ہے: ایک چھوٹا انزائم ڈونر (ای ڈی) جو منشیات کے ینالاگ کے ساتھ جڑا ہوا ہے، اور ایک بڑا انزائم قبولیت (ای اے)۔ جب دونوں ٹکڑے مل جاتے ہیں، تو مکمل انزائم ایک سبسٹریٹ کو کلیفڈ رنگین پروڈکٹ میں تبدیل کر دیتا ہے۔ اگر منشیات کے تجزیاتی مالیکیول موجود ہیں، تو وہ محدود اے بی سائٹس کے حل میں ای ڈی لیبل والی دوا سے مقابلہ کرتے ہیں۔ مفت ای ڈی-لیبلڈ ڈرگ اینالاگ ای اے سے منسلک ہوگا، جو تجزیہ کی مقدار کے براہ راست متناسب کلورمیٹرک سگنل پیدا کرے گا۔ مسابقتی، متنوع امیونواسے جیسا کہ ایک مسابقتی، یکساں امیونواسے میں، نمونے میں غیر لیبل شدہ اینالائٹ اینٹی باڈی کو باندھنے کے لیے لیبل شدہ اینالائٹ کے ساتھ مقابلہ کرتا ہے۔ متنوع جانچ میں، لیبل شدہ، غیر پابند تجزیہ کو الگ یا دھویا جاتا ہے، اور باقی لیبل شدہ، پابند تجزیہ کو ماپا جاتا ہے۔ ایک جگہ، غیر مسابقتی امیونواسے نمونے میں نامعلوم تجزیہ لیبل شدہ اینٹی باڈیز کے ساتھ جڑا ہوتا ہے۔ غیر پابند، لیبل شدہ اینٹی باڈیز کو دھو دیا جاتا ہے، اور پابند، لیبل شدہ اینٹی باڈیز کی پیمائش کی جاتی ہے۔ سگنل کی شدت نامعلوم تجزیہ کی مقدار کے براہ راست متناسب ہوتی ہے۔ دو جگہ، غیر مسابقتی امیونواسس نامعلوم نمونے میں اینالیٹ اینٹی باڈی سائٹ سے منسلک ہوتا ہے، پھر لیبل شدہ اینٹی باڈی اینالیٹ سے منسلک ہوتی ہے۔ اس کے بعد سائٹ پر لیبل شدہ اینٹی باڈی کی مقدار کی پیمائش کی جاتی ہے۔ یہ تجزیہ کار کے ارتکاز کے براہ راست متناسب ہوگا کیونکہ اگر تجزیہ کار نامعلوم نمونے میں موجود نہیں ہے تو لیبل شدہ اینٹی باڈی پابند نہیں ہوگی۔ اس قسم کے امیونواسے کو سینڈوچ اسیسے کے نام سے بھی جانا جاتا ہے کیونکہ اینالیٹ دو اینٹی باڈیز کے درمیان "سینڈوچڈ" ہوتا ہے۔ طبی ٹیسٹوں کی مثالیں طبی ٹیسٹوں کی ایک وسیع رینج امیونواسس ہیں، جنہیں اس تناظر میں امیونوڈیاگنوسٹکس کہا جاتا ہے۔ بہت سے گھریلو حمل کے ٹیسٹ امیونواسے ہوتے ہیں، جو حمل کے مارکر ہیومن کوریونک گونڈوٹروپن کا پتہ لگاتے ہیں۔ دیگر طبی امیونواسس میں ایسے ٹیسٹ شامل ہیں جو دل کی بیماری کا اندازہ کرنے کے لیے سی کے-ایم بی کی سطح کی پیمائش کرتے ہیں، ہائپوگلیسیمیا کا اندازہ کرنے کے لیے انسولین، پروسٹیٹ کینسر کا پتہ لگانے کے لیے پروسٹیٹ مخصوص اینٹیجن، اور کچھ کچھ دواسازی مرکبات کا پتہ لگانے اور/یا مقداری پیمائش کے لیے بھی استعمال ہوتے ہیں (مزید تفصیلات کے لیے اینزیم ملٹی پلائیڈ امیونواسے تکنیک دیکھیں)۔ کھیلوں کے اینٹی ڈوپنگ تجزیہ امیونواسے کا استعمال کھیلوں کے اینٹی ڈوپنگ لیبارٹریوں میں ممنوعہ ریکومبیننٹ ہیومن گروتھ ہارمون (آر ایچ جی ایچ، آر جی ایچ، ایچ جی ایچ، جی ایچ) کے لیے کھلاڑیوں کے خون کے نمونوں کی جانچ کے لیے کیا جاتا ہے۔ فوٹوکاسٹک امیونواسے فوٹوکاسٹک امیونواسے دھات کے نینو پارٹیکل ٹیگز سے پیدا ہونے والے کم تعدد والے صوتی اشاروں کی پیمائش کرتا ہے۔ پلازمون گونج طول موج پر ماڈیولیٹڈ روشنی سے روشن، نینو پارٹیکلز مضبوط صوتی سگنل پیدا کرتے ہیں، جسے مائکروفون کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جا سکتا ہے۔ فوٹو اکوسٹک امیونواسے کا اطلاق لیٹرل فلو ٹیسٹوں پر کیا جا سکتا ہے، جو کولائڈیل نینو پارٹیکلز کا استعمال کرتے ہیں۔ ایلیسا میلیسا ایسلیا امیونو اسکریننگ نیفیلومیٹری لیٹرل فلو ٹیسٹ میگنیٹک امیونواسے ریڈیو امیونواسے سراؤنڈ آپٹیکل فائبر امیونواسے (سوفیا) سی ڈی/ڈی وی ڈی پر مبنی امیونواسے ایگلوٹی نیشن-پی سی آر حوالہ جات بیرونی لنکس "دی امیونواسے ہینڈ بک"، تیسرا ایڈیشن، ڈیوڈ وائلڈ، ایڈ۔، ایلسیویئر، 2008 باب 5 اور 6 کتاب "بائیوانالیٹیکل کیمسٹری" میں سوسن آر میکلسن بائیو کیمسٹری میتھڈز امیونولوجیک ٹیسٹ