Bicinchoninic acid assay
بائیسنکونینک ایسڈ اسیسے (بی سی اے اسیسے)، جسے اسمتھ اسیسے کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، اس کے موجد، پیئرس کیمیکل کمپنی میں پال کے اسمتھ کے بعد، جو اب تھرمو فشر سائنٹفک کا حصہ ہے، ایک حل میں پروٹین کی کل حراستی کا تعین کرنے کے لیے ایک بائیو کیمیکل اسیسے ہے (0.0 μg/mL سے 1.5 mg/mL)، لوری پروٹین اسیسے، بریڈفورڈ پروٹین اسیسے یا بائیوریٹ ریجینٹ کی طرح۔ پروٹین کے کل ارتکاز کو پروٹین کے ارتکاز کے تناسب سے نمونے کے محلول کے سبز سے جامنی رنگ میں تبدیلی کے ذریعے ظاہر کیا جاتا ہے، جسے پھر کلورمیٹرک تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جا سکتا ہے۔ بی سی اے جانچ کو پیئرس کیمیکل کمپنی نے 1989 میں پیٹنٹ کرایا تھا اور پیٹنٹ کی میعاد 2006 میں ختم ہو گئی تھی۔ میکانزم ایک اسٹاک بی سی اے کے محلول میں پی ایچ 11.25 کے ساتھ انتہائی الکلین محلول میں درج ذیل اجزاء ہوتے ہیں: بائیسنکونینک ایسڈ، سوڈیم کاربونیٹ، سوڈیم بائی کاربونیٹ، سوڈیم ٹارٹریٹ، اور کاپر (II) سلفیٹ پینٹاہائڈریٹ۔ بی سی اے جانچ بنیادی طور پر دو رد عمل پر منحصر ہے۔ سب سے پہلے، پروٹین میں موجود پیپٹائڈ بانڈز کاپر (II) سلفیٹ سے Cu2 + آئنوں کو کم کر کے Cu1 + (درجہ حرارت پر منحصر ردعمل) کر دیتے ہیں۔ کم ہونے والی Cu2 + کی مقدار محلول میں موجود پروٹین کی مقدار کے متناسب ہوتی ہے۔ اس کے بعد، بائیسنکونینک ایسڈ کے دو مالیکیول ہر کیو 1 + آئن کے ساتھ چیلیٹ ہوتے ہیں، جو ایک جامنی رنگ کا کمپلیکس بناتے ہیں جو 562 این ایم کی طول موج پر روشنی کو مضبوطی سے جذب کرتا ہے۔ بائیسنکونینک ایسڈ کیو 1 + کمپلیکس پروٹین کے نمونوں میں سسٹین/سسٹین، ٹائروسین، اور ٹرپٹوفین سائیڈ چینز کی موجودگی سے متاثر ہوتا ہے۔ زیادہ درجہ حرارت (37 سے 60 ڈگری سیلسیس) پر، پیپٹائڈ بانڈ ری ایکشن کمپلیکس کی تشکیل میں مدد کرتے ہیں۔ غیر مساوی امینو ایسڈ کی ساخت کی وجہ سے ہونے والے تغیرات کو کم کرتے ہوئے جانچ کی حساسیت کو بڑھانے کے ایک طریقے کے طور پر اعلی درجہ حرارت پر بی سی اے جانچ کو انکیوبیٹ کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔ محلول میں موجود پروٹین کی مقدار کو جذب سپیکٹرم کی پیمائش کرکے اور معلوم ارتکاز کے پروٹین حل کے ساتھ موازنہ کرکے متعین کیا جا سکتا ہے۔ حدود بی سی اے جانچ بڑی حد تک کم کرنے والے ایجنٹوں اور دھاتی چیلیٹرز کے ساتھ مطابقت نہیں رکھتی ہے، حالانکہ ٹریس کی مقدار کو برداشت کیا جا سکتا ہے۔ بی سی اے جانچ مبینہ طور پر عام جھلی لپڈ اور فاسفولیپیڈز کا بھی جواب دیتی ہے۔ جانچ کی مختلف قسمیں بی سی اے جانچ کی چند متبادل قسمیں ہیں: اصل بی سی اے جانچ جیسا کہ اسمتھ نے بیان کیا ہے، اصل بی سی اے جانچ دو اجزاء کا پروٹوکول ہے۔ دونوں ریجینٹ "کمرے کے درجہ حرارت پر غیر معینہ مدت تک مستحکم" ہیں۔ جدید (ممکنہ طور پر درست یا انتہائی مماثل) فارمولیشن کم از کم دو تجارتی دکانداروں سے دستیاب ہیں۔ بی سی اے ورکنگ سولیوشن ریجینٹ اے اور ریجینٹ بی کو 50:1 کے تناسب سے ملا کر تیار کیا جاتا ہے، اور اسے یا تو ہفتہ وار (یہ معتدل طور پر مستحکم ہے)، یا ضرورت کے مطابق تیار کیا جا سکتا ہے۔ ریجینٹ اے 1 ٪ ڈبلیو/وی بی سی اے-نا 2 (سی اے ایس: 979-88-4) 2 ٪ ڈبلیو/وی نا 2 سی او 3 · ایچ 2 او (سی اے ایس: 5968-11-6) 0.16% ڈبلیو/وی نا 2 ٹارٹریٹ (سی اے ایس: 868-18-8) 0.4 ٪ ڈبلیو/وی نا او ایچ (سی اے ایس: 1310-73-2) 0.95% ڈبلیو/وی نا ایچ سی او 3 (سی اے ایس: 144-55-8) پی ایچ کو 11.25 میں ایڈجسٹ کرنے کے لیے 50 ٪ نا او ایچ یا ٹھوس نا ایچ سی او 3 شامل کریں اسمتھ مخطوطے میں تجویز کردہ لیکن غیر تجربہ شدہ متبادل تشکیل NaOH کو چھوڑنا ہے (اور ممکنہ طور پر دستی پی ایچ ایڈجسٹمنٹ انجام نہیں دینا ہے۔ خاص طور پر، اسمتھ نے آئسٹین اور ایسیٹوئن کے پفٹزنگر رد عمل کے ذریعے اپنے خود کے بی سی اے کی ترکیب کی، جس میں NaOH کو KOH کے لیے تبدیل کیا گیا لیکن بصورت دیگر لیسین اور ہینز کے مصنوعی طریقہ کار پر عمل کیا گیا، کیونکہ اس وقت کے تجارتی دکانداروں سے دستیاب بی سی اے ان کے استعمال کے لیے بہت زیادہ ناپاک تھا۔ جانچ کے لیے اسے کافی حد تک صاف کرنے کے لیے 70 ڈگری سینٹی گریڈ پانی سے ان کی ترکیب شدہ بی سی اے کی کم از کم تین مسلسل دوبارہ کرسٹلائزیشن کی ضرورت تھی۔ ریجینٹ بی 4 ٪ ڈبلیو/وی کیو ایس او 4 · 5 ایچ 2 او مائیکرو بی سی اے جانچ (پتلے حل کے لیے) بی سی اے مائیکرو بی سی اے جانچ ایک 3 اجزاء کا پروٹوکول ہے جو بییوریٹ ری ایکشن، بی سی اے، اور تانبے (II) ریجینٹس کے مرتکز اسٹاک کا استعمال کرتا ہے۔ یہ اصل بی سی اے جانچ کی ~ 2-40 ایم جی/ایم ایل بمقابلہ 20-2000 ایم جی/ایم ایل کی بہتر حساسیت کی اجازت دیتا ہے۔ تاہم، اس میں ایک مختلف، اور عام طور پر زیادہ حساس، غیر پروٹین اجزاء کی مداخلت ہوتی ہے۔ مائیکرو بی سی اے جانچ کے لیے کٹس کم از کم دو تجارتی دکانداروں سے دستیاب ہیں۔ خاص طور پر، "مائیکرو بی سی اے ریجینٹ اینڈ پروٹوکول" کی ساخت اور استعمال کو اسمتھ نے اصل مخطوطات میں بیان کیا تھا، اور جدید کٹس ممکنہ طور پر ایک عین مطابق یا انتہائی اسی طرح کی تشکیل پر مشتمل ہیں۔ پروٹوکول مائیکرو ریجینٹ سی (ایم سی) بنانے کے لیے مائیکرو ریجینٹ بی اور کاپر سولیوشن 25:1 کو ملانے پر مشتمل ہے، جو شیلف مستحکم نہیں ہے اور اسے تازہ تیار کیا جانا چاہیے، اور پھر ایم سی 1:1 کو مائیکرو ریجینٹ اے کے ساتھ ملا کر حتمی (غیر مستحکم بھی) جانچ کا کام کرنے والا حل تیار کرنا چاہیے۔ مائیکرو ریجینٹ اے، مائیکرو ریجینٹ بی، اور کاپر سولیوشن کمرے کے درجہ حرارت پر غیر معینہ مدت تک مستحکم ہیں۔ مائیکرو ریجینٹ اے (ایم اے) 8 ٪ ڈبلیو/وی این اے 2 سی او 3 · ایچ 2 او (سی اے ایس: 5968-11-6) 1.6 ٪ ڈبلیو/وی این اے او ایچ (سی اے ایس: 1310-73-2) 1.6 ٪ ڈبلیو/وی این اے 2 ٹارٹریٹ (سی اے ایس: 868-18-8) (اوپر اصل بی سی اے جانچ میں ریجینٹ اے کے طور پر 10x ارتکاز) کافی این اے ایچ سی او 3 (سی اے ایس: 144-55-8) پی ایچ کو 11.25 مائیکرو ریجینٹ بی (ایم بی) 4 ٪ ڈبلیو/وی این اے-این اے 2 (سی اے ایس: 979-88-4) (اوپر اصل بی سی اے جانچ میں ریجینٹ اے کے طور پر 4x ارتکاز) کاپر ایس اگرچہ یہ کم کرنے والے ایجنٹوں کے ساتھ زیادہ مطابقت کی اجازت دیتا ہے، لیکن جانچ میں دیگر غیر پروٹین اجزاء سے مختلف مداخلت پروفائل ہے۔ ریپڈ گولڈ بی سی اے اس قسم کی بی سی اے جانچ صرف تھرمو فشر سائنٹفک سے دستیاب ہوتی ہے۔ مبینہ طور پر یہ تانبے کو کم کرنے کا وہی طریقہ استعمال کرتا ہے جو روایتی بی سی اے پروٹین اسیسے کے طور پر ایک منفرد [ملکیتی] تانبے کے چیلیٹر کے ساتھ استعمال ہوتا ہے۔ "، جو 562 این ایم کے بجائے 480 این ایم پر جذب ہوتا ہے۔ یہ پروپریٹر چیلیٹر اور متوقع بہتر بائیوریٹ ری ایکشن فارمولیشن اسیسے کو اصل بی سی اے اسیسے کے 37 ڈگری سیلسیس + انکیوبیشن کے بغیر تیزی سے (<5 منٹ) نتائج فراہم کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ تاہم جانچ میں دیگر غیر پروٹین اجزاء سے مختلف مداخلت پروفائل ہے۔ پیئرس کوانٹیٹیو کلورمیٹرک پیپٹائڈ اسیس (جو اب تھرمو فشر سائنٹفک کی ملکیت ہے اور اس سے دستیاب ہے) اسی طرح کے یا یکساں 480 این ایم جذب کرنے والے ملکیتی تانبے کے چیلیٹر کا استعمال کرتا دکھائی دیتا ہے۔ یہ بھی دیکھیں کہ بائیوریٹ ٹیسٹ بریڈفورڈ اسیس کولائڈل گولڈ پروٹین اسیس حوالہ جات بیرونی لنکس اوپن ویٹ ویئر بی سی اے اسیس کیمسٹری بائیو کیمسٹری کے طریقے کیمیائی ٹیسٹ ڈی: بیسنکونینسیور