Electrophoretic color marker
الیکٹروفوریٹک کلر مارکر ایک کیمیکل ہے جو ایگروز جیل الیکٹروفورسس اور پولی ایکریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (پی اے جی ای) کی پیشرفت کی نگرانی کے لیے استعمال ہوتا ہے کیونکہ ڈی این اے، آر این اے، اور زیادہ تر پروٹین بے رنگ ہوتے ہیں۔ رنگین نشانات رنگوں کے مرکب سے بنے ہوتے ہیں جو دلچسپی کے نمونے کے ساتھ جیل میٹرکس کے ذریعے منتقل ہوتے ہیں۔ وہ عام طور پر نمونے کے اجزاء سے مختلف نقل و حرکت کرنے اور رنگین بینڈ تیار کرنے کے لیے ڈیزائن کیے جاتے ہیں جو نمونے کے اجزاء کی منتقلی اور علیحدگی کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ رنگین مارکر اکثر سالماتی وزن کے معیار، لوڈنگ ڈائز، ٹریکنگ ڈائز، یا داغدار حل کے طور پر استعمال ہوتے ہیں۔ سالماتی وزن کی سیڑھیاں ڈی این اے اور پروٹین کے ٹکڑوں کے سائز کا اندازہ لگانے کے لیے ان کی منتقلی کے فاصلے کا رنگین بینڈوں سے موازنہ کرنے کے لیے استعمال کی جاتی ہیں۔ ڈی این اے اور پروٹین کے معیارات تجارتی طور پر سائز کی ایک وسیع رینج میں دستیاب ہیں، اور اکثر آسان شناخت کے لیے پہلے سے داغدار یا رنگین کوڈ والے بینڈ فراہم کیے جاتے ہیں۔ نمونے کو جیل پر لوڈ کرنے سے پہلے لوڈنگ ڈائز عام طور پر نمونے کے بفر میں شامل کیے جاتے ہیں، اور وہ الیکٹروفورسس کے دوران اس کی پیشرفت کو ٹریک کرنے میں مدد کے لیے نمونے کے ساتھ جیل کے ذریعے منتقل ہوتے ہیں۔ ٹریکنگ رنگوں کو الیکٹروفورسس بفر میں شامل کیا جاتا ہے بجائے اس کے کہ بفر فرنٹ کا بصری مارکر فراہم کیا جائے۔ نمونے کے بینڈوں کو دیکھنے کے لیے الیکٹروفورسس کے بعد داغدار حل کا اطلاق کیا جاتا ہے، اور یہ مختلف رنگوں میں دستیاب ہوتے ہیں۔ مختلف قسم کے الیکٹروفوریٹک رنگین مارکر تجارتی طور پر دستیاب ہیں، جن میں مختلف تعداد اور اقسام کے رنگ یا روغن مرکب میں استعمال ہوتے ہیں۔ کچھ مارکر معروف نقل و حرکت کے ساتھ رنگین بینڈوں کا ایک سلسلہ تیار کرتے ہیں، جبکہ دوسرے ایک مخصوص رنگ کا ایک واحد بینڈ تیار کرتے ہیں جسے حوالہ نقطہ کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ وہ تحقیق، طبی تشخیص، اور فارنسک سائنس میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتے ہیں۔ پیش رفت مارکر لوڈ کرنے والے بفرز میں اکثر آئنک رنگ ہوتے ہیں جو نظر آنے والے روشنی کے سپیکٹرم کے نیچے نظر آتے ہیں، اور نیوکلک ایسڈ سے پہلے جیل میں شامل کیے جاتے ہیں۔ ٹریکنگ رنگوں کو رد عمل نہیں ہونا چاہیے تاکہ نمونے کو تبدیل نہ کیا جا سکے، اور ڈی این اے یا آر این اے نمونے کے ساتھ جیل کو نیچے منتقل کیا جا سکے۔ عام طور پر استعمال ہونے والے رنگین نشانات میں بروموفینول بلیو، کریسول ریڈ، اورنج جی اور زائلین سیانول شامل ہیں۔ زائلین اور بروموفینول بلیو سب سے زیادہ استعمال ہونے والے رنگ ہیں۔ عام طور پر، اورنج جی بروموفینول بلیو سے زیادہ تیزی سے منتقل ہوتا ہے، جو زائلین سائنول سے زیادہ تیزی سے منتقل ہوتا ہے، لیکن ان رنگوں کے ظاہری "سائز" (ڈی این اے مالیکیولز کے مقابلے میں) اگروز کے ارتکاز اور استعمال شدہ بفر سسٹم کے ساتھ مختلف ہوتے ہیں۔ مثال کے طور پر، ٹی اے ای بفر (ٹرس-ایسیٹیٹ-ای ڈی ٹی اے) میں بنے 1 فیصد ایگروز جیل میں، زائلین سائنول ڈی این اے کے 3000 بیس جوڑے (بی پی) مالیکیول کی رفتار سے منتقل ہوتا ہے اور بروموفینول بلیو 400 بی پی پر منتقل ہوتا ہے۔ تاہم، ٹی بی ای بفر (ٹرس-بورٹ-ای ڈی ٹی اے) میں بنے 1 فیصد جیل میں، وہ بالترتیب 2000 بی پی اور 250 بی پی پر منتقل ہوتے ہیں۔ ڈی این اے اور آر این اے سٹیننگ اگاروز جیل الیکٹروفورسس ایک ایسی تکنیک ہے جو نیوکلک ایسڈ کے ٹکڑوں کے سائز کا اندازہ لگانے اور جیل میں ان کی تفریقی نقل و حرکت کی بنیاد پر ان کی شناخت کرنے کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی ہے۔ نیوکلک ایسڈ عام طور پر ایتھیڈیم برومائڈ یا ایس وائی بی آر گرین رنگوں کا استعمال کرتے ہوئے داغدار ہوتے ہیں اور ان کا پتہ لگایا جاتا ہے۔ اگروز جیل میں سب سے عام الیکٹروفوریٹک داغ ایتھیڈیم برومائڈ ہے، تاہم، ایس وائی بی آر گرین سنگل اسٹرینڈڈ نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے لیے زیادہ ریزولوشن اور پیداوار پیش کرتا ہے۔ رنگ 300 این ایم یو وی روشنی کے تحت ڈی این اے اور آر این اے کو فلوروسینس فراہم کرتے ہیں۔ یہ ان کی باہمی نوعیت کی وجہ سے ہوتا ہے۔ ڈبل ہیلیکل نیوکلک ایسڈ میں، رنگ دو تاروں کے درمیان باندھتے ہیں، اور سنگل اسٹرینڈڈ نیوکلک ایسڈ میں، رنگ ایک تار کے اندر بنے چھوٹے، ڈوپلیکس حصوں کو باندھتے ہیں۔ ڈی این اے اور آر این اے کے ایگروز جیل الیکٹروفورسس میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والا رنگ، جو 1970 کی دہائی تک کا ہے، ایتھیڈیم برومائڈ (2,7-ڈائامینو-10-ایتھائل-9-فینائلفینانتھریڈینیمبرومائڈ) ہے۔ ایتھڈیم برومائڈ (ای ٹی بی آر) ایک نارنجی رنگ کا فلوروسینٹ انٹرکالیٹنگ ڈائی ہے۔ ڈائی خود کو نیوکلک ایسڈ کی ڈبل ہیلیکل ساخت کے درمیان داخل کرتا ہے، جس سے یو وی روشنی کے تحت مالیکیولز کا تصور ہوتا ہے۔ ای ٹی بی آر میں 300-360 این ایم پر جذب زیادہ سے زیادہ اور 500-590 این ایم پر فلوروسینٹ اخراج زیادہ سے زیادہ ہے، جس میں پتہ لگانے کی حد 0.5-5.0 این جی/بینڈ ہے۔ تاہم، ڈائی نے سنگل اسٹرینڈڈ نیوکلک ایسڈ کے نمونوں کا پتہ لگانے میں حساسیت کو کم کر دیا ہے۔ ای ٹی بی آر کو احتیاط سے سنبھالا جانا چاہیے، کیونکہ یہ ایک طاقتور میوٹیجن ہے۔ جیل الیکٹروفورسس میں نیوکلک ایسڈ کے داغ کے لیے ایک زیادہ حساس متبادل ایس وائی بی آر ٹی ایم گرین I ہے۔ ڈائی ڈی ایس ڈی این اے کے داغ میں ای ٹی بی آر سے 25 گنا زیادہ حساس ہے، اور خاص طور پر سنگل اسٹرینڈڈ نیوکلک ایسڈ پر مشتمل داغدار جانچ میں مفید ہے۔ تاہم، ای ٹی بی آر کے مقابلے میں ایس وائی بی آر گرین زیادہ مہنگا ہے۔ پروٹین سٹیننگ کوماسی بلیو پروٹین کی مقدار کے لیے ایس ڈی ایس پولی ایکریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والا غیر ہم آہنگ داغ ہے۔ داغدار رنگ پروٹین بینڈ سے جڑا رہتا ہے اور ایک نیلا رنگ پیدا کرتا ہے جس کا بصری طور پر پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ کوماسی برلینٹ بلیو آر-250 (سرخ)، عام طور پر الیکٹروفورسس کے لیے استعمال ہوتا ہے، جبکہ کوماسی برلینٹ بلیو جی-250 (سبز)، بریڈفورڈ اسیس کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ اس رنگ کی حد یہ ہے کہ یہ غیر مخصوص ہے، اور حل میں موجود تقریبا کسی بھی پروٹین سے جڑا ہوگا، اور کم حساس ہے۔ جیل میں پروٹین کے تصور کا ایک اور عام طریقہ سلور سٹیننگ ہے، جہاں گھلنشیل سلور آئن مستقل طور پر پروٹین کو نشان زد کرتے ہیں اور فارملڈیہائیڈ کے ذریعے کم کر کے براؤن پریپیٹیٹ بناتے ہیں۔ کوماسی بلیو کے مقابلے میں سلور سٹیننگ ایک زیادہ حساس سٹیننگ طریقہ ہے، تاہم، نتائج آلودگی کا زیادہ خطرہ ہیں۔ ڈی این اے کے ٹکڑوں کی علیحدگی میں جیل الیکٹروفورسس کے لیے رنگوں کو لوڈ کرنے میں بعض اوقات رنگین مارکر شامل کیے جاتے ہیں۔ رنگوں کو لوڈ کرنے سے ڈی این اے کے نمونے اگروز جیل کی سطح کے نیچے رہتے ہیں، اور اس کے اندر موجود رنگین نشانات ڈی این اے کے منتقلی کے محاذ پر نظر رکھنے میں مدد کرتے ہیں جب یہ جیل کے ساتھ ساتھ حرکت کرتا ہے۔ پی اے جی ای کے لیے، کچھ تجارتی طور پر دستیاب سالماتی وزن کے مارکر (جسے "سیڑھی" بھی کہا جاتا ہے کیونکہ وہ علیحدگی کے بعد سیڑھی کے ٹانگوں کی طرح نظر آتے ہیں) میں مختلف رنگوں کے پہلے سے داغدار پروٹین ہوتے ہیں، لہذا زیادہ درست طریقے سے اس بات کا تعین کرنا ممکن ہے کہ نمونوں میں دلچسپی کے پروٹین کہاں ہو سکتے ہیں۔ حوالہ جات حیاتیاتی تکنیک اور اوزار الیکٹروفورسس جینیاتی تکنیک