T7 expression system
T7 اظہار کا نظام مائکروبیولوجی کے میدان میں ای کولی کے تناؤ کا استعمال کرتے ہوئے ریکومبیننٹ ڈی این اے کو کلون کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ ای کولی میں ریکومبیننٹ پروٹین کے اظہار کے لیے یہ سب سے مقبول نظام ہے۔ 2021 تک، اس نظام کو 220,000 سے زیادہ تحقیقی اشاعتوں میں بیان کیا گیا تھا۔ ترقی ٹی 7 بیکٹیریوفیج کے جینوم کی ترتیب اور تشریح 1980 کی دہائی میں امریکی محکمہ توانائی کی بروک ہیوین نیشنل لیبارٹری میں سینئر بائیو فزسٹ ایف ولیم اسٹڈیئر کے ماتحت ہوئی۔ جلد ہی، لیب T7 RNA پولیمریز کو کلون کرنے اور طاقتور T7 پروموٹر کے ساتھ مل کر تقریبا کسی بھی جین کی وافر مقدار کو نقل کرنے کے لیے اس کا استعمال کرنے میں کامیاب ہو گئی۔ T7 ایکسپریشن سسٹم کی ترقی کو بروک ہیوین نیشنل لیبارٹری میں تیار کردہ سب سے کامیاب بائیوٹیکنالوجی سمجھا جاتا ہے، جسے 900 سے زیادہ کمپنیوں نے لائسنس دیا ہے جس نے لیب کے لیے 55 ملین ڈالر سے زیادہ کی آمدنی حاصل کی ہے۔ میکانزم ایک ایکسپریشن ویکٹر، عام طور پر پی ای ٹی ایکسپریشن ویکٹر، دو ضروری اجزاء کو مربوط کرنے کے لیے تیار کیا جاتا ہے: ایک ٹی 7 پروموٹر اور پروموٹر کے نیچے کی طرف اور اس کے زیر کنٹرول دلچسپی کا جین۔ اظہار ویکٹر ای کولی کے کئی متعلقہ تناؤ میں سے ایک میں تبدیل ہو جاتا ہے، اکثر BL21 (DE3)۔ ای کولی سیل کا اپنا کروموسوم بھی ہوتا ہے، جس میں ایک جین ہوتا ہے جس کا اظہار ٹی 7 آر این اے پولیمریز تیار کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ (یہ پولیمریز ٹی 7 فیج سے نکلتا ہے، جو ایک بیکٹیریوفیج وائرس ہے جو ای کولی بیکٹیریل خلیوں کو متاثر کرتا ہے اور اپنے ڈی این اے کو میزبان ڈی این اے میں ضم کرنے کے ساتھ ساتھ اپنی سیلولر مشینری کو اوور رائڈ کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے تاکہ وہ اپنی مزید کاپیاں تیار کر سکے۔) T7 RNA پولیمریز تبدیل شدہ ویکٹر کے T7 پروموٹر پر نقل شروع کرنے کے لیے ذمہ دار ہے۔ T7 جین خود ایک لاکھ پروموٹر کے کنٹرول میں ہے۔ عام طور پر، ایل اے سی پروموٹر اور ٹی 7 پروموٹر دونوں کو ای کولی سیل میں ایل اے سی ریپریسر کے ذریعے دبایا جاتا ہے۔ نقل شروع کرنے کے لیے، ایک انڈسر کو لاک ریپریسر سے جڑا ہونا چاہیے اور اسے T7 جین کے جین کے اظہار کو روکنے سے روکنا چاہیے۔ ایک بار ایسا ہونے کے بعد، جین کو عام طور پر T7 RNA پولیمریز تیار کرنے کے لیے نقل کیا جا سکتا ہے۔ T7 RNA پولیمریز، بدلے میں، اظہار ویکٹر پر T7 پروموٹر سے منسلک ہو سکتا ہے اور اس کے نیچے کی طرف دلچسپی کے جین کو نقل کرنا شروع کر سکتا ہے۔ اس عمل کو متحرک کرنے کے لیے، انڈسر آئی پی ٹی جی کو نظام میں شامل کیا جا سکتا ہے۔ آئی پی ٹی جی ایک ریجینٹ ہے جو ایلولیکٹوز کی ساخت کی نقل کرتا ہے، اور اس وجہ سے لاک ریپریسر سے جڑا رہ سکتا ہے اور اسے جین کے اظہار کو روکنے سے روک سکتا ہے۔ ایک بار کافی آئی پی ٹی جی شامل ہونے کے بعد، ٹی 7 جین عام طور پر نقل کیا جاتا ہے اور اس طرح ٹی 7 پروموٹر کے نیچے کی طرف دلچسپی کے جین کی نقل بھی شروع ہوتی ہے۔ ٹی 7 پروموٹر کے کنٹرول میں ریکومبیننٹ پروٹین کا اظہار ای کولی آر این اے پولیمریز کے کنٹرول میں پروٹین کے اظہار سے 8 گنا تیز ہے۔ خلیے میں T7 RNA پولیمریز کے اظہار کی بنیادی سطحوں کو بیکٹیریوفیج T7 لائسوزیم بھی روکتا ہے، جس کے نتیجے میں T7 RNA پولیمریز کے جمع ہونے میں تاخیر ہوتی ہے جب تک کہ لائسوزیمک سرگرمی سنترپت نہ ہو جائے۔ درخواست کووڈ-19 وبائی مرض کے دوران، وائرس کے پھیلاؤ سے نمٹنے کے لیے موڈرنا اور فائزر کے ذریعے ایم آر این اے ویکسین تیار کی گئی ہیں۔ موڈرنا اور فائزر دونوں نے ویکسین بنانے کے لیے درکار ایم آر این اے کی بڑی مقدار پیدا کرنے کے لیے ٹی 7 ایکسپریشن سسٹم پر انحصار کیا ہے۔ حوالہ جات مائکروبیولوجی کلوننگ