Second-harmonic imaging microscopy
سیکنڈ ہارمونک امیجنگ مائکروسکوپی (ایس ایچ آئی ایم) ایک غیر لکیری نظری اثر پر مبنی ہے جسے سیکنڈ ہارمونک جنریشن (ایس ایچ جی) کہا جاتا ہے۔ ایس ایچ آئی ایم کو سیل اور ٹشو کی ساخت اور فنکشن کے تصور کے لیے ایک قابل عمل خوردبین امیجنگ برعکس طریقہ کار کے طور پر قائم کیا گیا ہے۔ دوسرا ہارمونک خوردبین واقعے کی روشنی سے دوسرا ہارمونک روشنی پیدا کرنے کی نمونے کی صلاحیت میں تغیرات سے تضادات حاصل کرتا ہے جبکہ ایک روایتی آپٹیکل خوردبین نمونہ کی نظری کثافت، راستے کی لمبائی، یا اضطراری اشاریہ میں تغیرات کا پتہ لگا کر اس کے تضاد کو حاصل کرتا ہے۔ ایس ایچ جی کے لیے شدید لیزر لائٹ کی ضرورت ہوتی ہے جو غیر سنترسیمیٹرک سالماتی ڈھانچے والے مواد سے گزرتی ہے، یا تو موروثی یا بیرونی طور پر متاثر ہوتی ہے، مثال کے طور پر برقی میدان کے ذریعے۔ ایس ایچ جی مواد سے نکلنے والی سیکنڈ ہارمونک روشنی مواد میں داخل ہونے والی روشنی کی طول موج (فریکوئنسی دگنی) کا بالکل نصف ہوتی ہے۔ جبکہ دو فوٹون سے پرجوش فلوروسینس (ٹی پی ای ایف) بھی ایک دو فوٹون عمل ہے، ٹی پی ای ایف پرجوش حالت میں نرمی کے دوران کچھ توانائی کھو دیتا ہے، جبکہ ایس ایچ جی توانائی کا تحفظ کرتا ہے۔ عام طور پر، ایک غیر نامیاتی کرسٹل کا استعمال ایس ایچ جی روشنی پیدا کرنے کے لیے کیا جاتا ہے جیسے لیتھیم نیوبیٹ (لی این بی او 3)، پوٹاشیم ٹائٹینیل فاسفیٹ (کے ٹی پی = کے ٹی آئی او پی او 4)، اور لیتھیم ٹرائبوریٹ (ایل بی او = لی بی 3 او 5)۔ اگرچہ ایس ایچ جی کو کسی مواد کے لیے مخصوص سالماتی واقفیت کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ واقعے کی روشنی کی تعدد دوگنی ہو جائے، کچھ حیاتیاتی مواد انتہائی پولرائزبل ہو سکتے ہیں، اور منصفانہ ترتیب والے، بڑے نان سینٹروسیمیٹرک ڈھانچوں میں جمع ہو سکتے ہیں۔ اگرچہ کچھ حیاتیاتی مواد جیسے کولیجن، مائکرو ٹیوبلز، اور پٹھوں کا مایوسن ایس ایچ جی سگنلز پیدا کر سکتے ہیں، یہاں تک کہ پانی بھی آرڈر ہو سکتا ہے اور بعض حالات میں سیکنڈ ہارمونک سگنل پیدا کر سکتا ہے، جو ایس ایچ مائکروسکوپی کو بغیر کسی لیبلنگ مالیکیول کے سطح کی صلاحیتوں کی تصویر لینے کی اجازت دیتا ہے۔ ایس ایچ جی پیٹرن کا تعین بنیادی طور پر فیز میچنگ کنڈیشن سے ہوتا ہے۔ ایس ایچ جی امیجنگ سسٹم کے لیے ایک عام سیٹ اپ میں لیزر اسکیننگ مائکروسکوپ ہوگا جس میں ٹائٹینیم نیلم موڈ لاکڈ لیزر ایکسائٹیشن سورس کے طور پر ہوگا۔ ایس ایچ جی سگنل کو آگے کی سمت میں پھیلایا جاتا ہے۔ تاہم، کچھ تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ ایس ایچ جی کے پیدا کردہ سگنل کی طول موج کے تقریبا دسویں حصے کی ترتیب پر موجود اشیا تقریبا برابر آگے اور پیچھے کے اشارے پیدا کریں گی۔ فوائد SHIM زندہ خلیے اور ٹشو امیجنگ کے لیے کئی فوائد پیش کرتا ہے۔ ایس ایچ جی میں دیگر تکنیکوں جیسے کہ فلوروسینس مائکروسکوپی کی طرح مالیکیولز کی حوصلہ افزائی شامل نہیں ہوتی ہے، اس لیے مالیکیولز کو فوٹوٹوکسائٹی یا فوٹو بلیچنگ کے اثرات کا شکار نہیں ہونا چاہیے۔ نیز، چونکہ بہت سے حیاتیاتی ڈھانچے مضبوط ایس ایچ جی سگنلز پیدا کرتے ہیں، اس لیے بیرونی تحقیقات والے مالیکیولز کی لیبلنگ کی ضرورت نہیں ہے جو حیاتیاتی نظام کے کام کرنے کے طریقے کو بھی تبدیل کر سکتی ہے۔ واقعے کی روشنی کے لیے قریب اورکت طول موج کا استعمال کرتے ہوئے، ایس ایچ آئی ایم موٹے بافتوں میں گہری امیجنگ کرکے نمونوں کی تین جہتی تصاویر بنانے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ دو فوٹون فلوروسینس (2 پی ای ایف) دو فوٹون فلوروسینس (2 پی ای ایف) کے ساتھ فرق اور تکمیل ایس ایچ جی سے بہت مختلف عمل ہے: اس میں الیکٹرانوں کی اعلی توانائی کی سطح پر حوصلہ افزائی، اور اس کے بعد فوٹون کے اخراج کے ذریعے حوصلہ شکنی شامل ہے (ایس ایچ جی کے برعکس، حالانکہ یہ بھی ایک 2 فوٹون عمل ہے)۔ اس طرح، 2 پی ای ایف ایک غیر مربوط عمل ہے، مقامی طور پر (خارج شدہ آئسوٹروپک طور پر) اور عارضی طور پر (وسیع، نمونے پر منحصر سپیکٹرم)۔ یہ ایس ایچ جی کے برعکس مخصوص ڈھانچے کے لیے بھی مخصوص نہیں ہے۔ لہذا اسے ملٹی فوٹون امیجنگ میں ایس ایچ جی کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے تاکہ کچھ مالیکیولز کو ظاہر کیا جا سکے جو آٹو فلوریسنس پیدا کرتے ہیں، جیسے ٹشوز میں ایلسٹن (جبکہ ایس ایچ جی مثال کے طور پر کولیجن یا میوسن کو ظاہر کرتا ہے)۔ ایس ایچ جی کے امیجنگ کے لیے استعمال ہونے سے پہلے کی تاریخ، ایس ایچ جی کا پہلا مظاہرہ 1961 میں پی اے فرینکن، جی وینریچ، سی ڈبلیو پیٹرز، اور اے ای ہل نے مشی گن یونیورسٹی، این آربر میں کوارٹز نمونے کا استعمال کرتے ہوئے کیا تھا۔ 1968 میں، انٹرفیس سے ایس ایچ جی کو بلومبرگن نے دریافت کیا تھا اور اس کے بعد سے اسے سطحوں کی خصوصیت اور انٹرفیس کی حرکیات کی تحقیقات کے لیے ایک آلے کے طور پر استعمال کیا جاتا رہا ہے۔ 1971 میں، فائن اور ہینسن نے حیاتیاتی بافتوں کے نمونوں سے ایس ایچ جی کے پہلے مشاہدے کی اطلاع دی۔ 1974 میں، ہیلورتھ اور کرسٹینسن نے پہلی بار پولی کرسٹل لائن ZnSe سے SHG سگنلز کی امیجنگ کے ذریعے SHG اور خوردبین کے انضمام کی اطلاع دی۔ 1977 میں، کولن شیپرڈ نے اسکیننگ آپٹیکل خوردبین کے ساتھ مختلف ایس ایچ جی کرسٹل کی تصویر کشی کی۔ پہلے حیاتیاتی امیجنگ تجربات 1986 میں فرینڈ اور ڈوئچ نے چوہے کی دم کے تناؤ میں کولیجن ریشوں کی واقفیت کا مطالعہ کرنے کے لیے کیے تھے۔ 1993 میں، لیوس نے برقی شعبوں میں اسٹائریل رنگوں کے دوسرے ہارمونک ردعمل کا جائزہ لیا۔ انہوں نے زندہ خلیوں کی امیجنگ پر بھی کام دکھایا۔ 2006 میں گورو میزوتانی گروپ نے ایک غیر اسکیننگ ایس ایچ جی خوردبین تیار کیا جو بڑے نمونوں کے مشاہدے کے لیے درکار وقت کو نمایاں طور پر کم کرتا ہے، چاہے دو فوٹون کا وسیع میدان خوردبین 1996 میں شائع ہوا ہو اور اسے ایس ایچ جی کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا تھا۔ نان اسکیننگ ایس ایچ جی خوردبین کا استعمال پودوں کے نشاستے، میگا مالیکیول، مکڑی ریشم وغیرہ کے مشاہدے کے لیے کیا گیا تھا۔ 2010 میں ایس ایچ جی کو ویو امیجنگ میں پورے جانور تک بڑھا دیا گیا تھا۔ 2019 میں، ایس ایچ جی ایپلی کیشنز میں توسیع ہوئی جب اسے کیڑے مار ادویات کی تاثیر کا اندازہ کرنے کا طریقہ فراہم کرنے کے لیے براہ راست پتی کی سطحوں پر منتخب امیجنگ زرعی کیمیکلز کے استعمال پر لاگو کیا گیا۔ مقداری پیمائش اورینٹیشنل انیسوٹروپی ایس ایچ جی پولرائزیشن انیسوٹروپی کو بافتوں میں پروٹین کی تنظیم کی واقفیت اور ڈگری کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے کیونکہ ایس ایچ جی سگنلز میں اچھی طرح سے متعین پولرائزیشن ہوتی ہے۔ انیسوٹروپی مساوات کا استعمال کرتے ہوئے: اور متوازی اور عمودی سمتوں میں پولرائزیشن کی شدت کو حاصل کرنا۔ ایک اعلی قدر ایک اینسوٹروپک واقفیت کی نشاندہی کرتی ہے جبکہ کم قدر ایک آئسوٹروپک ساخت کی نشاندہی کرتی ہے۔ کیمپگنولا اور لو کی طرف سے کیے گئے کام میں، یہ پایا گیا کہ کولیجن ریشے ایک قدر کے ساتھ اچھی طرح سے منسلک ڈھانچے بناتے ہیں۔ پسماندہ ایس ایچ جی ایس ایچ جی ایک مربوط عمل (مقامی اور عارضی طور پر) ہونے کی وجہ سے آگے بڑھتا ہے، یہ محرک کی سمت کے بارے میں معلومات رکھتا ہے اور آئسوٹروپک طور پر خارج نہیں ہوتا ہے۔ یہ بنیادی طور پر آگے کی سمت میں خارج ہوتا ہے (جوش و خروش کی طرح)، لیکن مرحلے سے ملنے والی حالت کے لحاظ سے پیچھے کی سمت میں بھی خارج کیا جا سکتا ہے۔ درحقیقت، ہم آہنگی کی لمبائی جس سے آگے سگنل کی تبدیلی کم ہوتی ہے: آگے کے لیے، لیکن پیچھے کے لیے اس طرح کہ>>۔ لہذا، موٹے ڈھانچے ترجیحی طور پر آگے کی طرف اور پتلے پیچھے کی طرف نظر آئیں گے: چونکہ ایس ایچ جی کی تبدیلی غیر لکیری کنورٹرز کی تعداد کے مربع پر پہلے تخمینے پر منحصر ہے، اگر موٹے ڈھانچوں سے خارج ہوتا ہے تو سگنل زیادہ ہوگا، اس طرح آگے کی سمت میں سگنل پیچھے کی طرف سے زیادہ ہوگا۔ تاہم، ٹشو پیدا شدہ روشنی کو منتشر کر سکتا ہے، اور آگے میں ایس ایچ جی کے ایک حصے کو پچھلی سمت میں ریٹرو عکاسی کی جا سکتی ہے۔ پھر، فارورڈ-اوور-بیکورڈ تناسب F/B کا حساب لگایا جا سکتا ہے، اور یہ ایس ایچ جی کنورٹرز (عام طور پر کولیجن فائبرلز) کے عالمی سائز اور ترتیب کا ایک میٹرک ہے۔ یہ بھی دکھایا جا سکتا ہے کہ بکھرے ہوئے کا طیارہ سے باہر کا زاویہ جتنا زیادہ ہوگا، اس کا F/B تناسب اتنا ہی زیادہ ہوگا (فگر دیکھیں۔ 2. 14 کا)۔ پولرائزیشن سے حل شدہ ایس ایچ جی پولرمیٹری کے فوائد کو اسٹولر اور دیگر نے 2002 میں ایس ایچ جی سے جوڑا تھا۔ پولاریمیٹری سالماتی سطح پر واقفیت اور ترتیب کی پیمائش کر سکتی ہے، اور ایس ایچ جی کے ساتھ مل کر یہ کولیجن جیسے کچھ ڈھانچوں کی خاصیت کے ساتھ ایسا کر سکتی ہے: پولرائزیشن سے حل شدہ ایس ایچ جی خوردبین (پی-ایس ایچ جی) اس طرح ایس ایچ جی خوردبین کی توسیع ہے۔ پی-ایس ایچ جی ایک اور انیسوٹروپی پیرامیٹر کی وضاحت کرتا ہے، جیسا کہ: جو کہ، آر کی طرح، امیج کیے جانے والے ڈھانچے کی اصل واقفیت اور خرابی کی پیمائش ہے۔ چونکہ یہ اکثر لمبے سلنڈریکل تنوں (جیسے کولیجن) میں انجام دیا جاتا ہے، اس لیے یہ انیسوٹروپی اکثر اس کے برابر ہوتی ہے، جہاں غیر لکیری حساسیت ٹینسر اور X تنت کی سمت (یا ساخت کی مرکزی سمت) ہے، Y آرتھوگنل سے X اور Z محرک روشنی کا پھیلاؤ ہے۔ تصویر کے طیارہ XY میں تنوں کی واقفیت φ کو ایف ایف ٹی تجزیہ کے ذریعے پی-ایس ایچ جی سے بھی نکالا جا سکتا ہے، اور نقشے میں رکھا جا سکتا ہے۔ فائبروسس کوانٹائزیشن کولیجن (خاص معاملہ، لیکن ایس ایچ جی خوردبین میں وسیع پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے)، مختلف شکلوں میں موجود ہو سکتا ہے: 28 مختلف اقسام، جن میں سے 5 فائبرلر ہیں۔ چیلنج میں سے ایک ٹشو میں فائبرلر کولیجن کی مقدار کا تعین اور مقدار طے کرنا ہے، تاکہ اس کے ارتقاء اور دیگر غیر کولیجینس مواد کے ساتھ تعلقات کو دیکھا جا سکے۔ اس مقصد کے لیے، ایس ایچ جی مائکروسکوپی امیج کو درست کرنا پڑتا ہے تاکہ ایس ایچ جی طول موج پر موجود بقیہ فلوروسینس یا شور کی تھوڑی مقدار کو دور کیا جا سکے۔ اس کے بعد، تصویر کے اندر کولیجن کی مقدار کے لیے ماسک لگایا جا سکتا ہے۔ کوانٹائزیشن کی دیگر تکنیکوں میں، یہ کافی پیچیدہ ہونے کے باوجود شاید سب سے زیادہ مخصوصیت، تولیدی صلاحیت اور قابل اطلاق ہے۔ دیگر یہ ثابت کرنے کے لیے بھی استعمال کیا گیا ہے کہ بیک پروپیگیٹنگ ایکشن پوٹینشلز وولٹیج کی تخفیف کے بغیر ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی پر حملہ کرتے ہیں، اور طویل مدتی پوٹینشیشن پر مستقبل کے کام کے لیے ایک ٹھوس بنیاد قائم کرتے ہیں۔ یہاں اس کا استعمال یہ تھا کہ اس نے چھوٹے ڈنڈریٹک ریڑھ کی ہڈی میں وولٹیج کی درست پیمائش کرنے کا ایک طریقہ فراہم کیا جس کی درستگی معیاری دو فوٹون خوردبین کے ساتھ ناقابل حصول تھی۔ دریں اثنا، ایس ایچ جی مؤثر طریقے سے قریب اورکت روشنی کو مرئی روشنی میں تبدیل کر سکتا ہے تاکہ امیجنگ گائیڈڈ فوٹو ڈائنامک تھراپی کو فعال کیا جا سکے، اور دخول کی گہرائی کی حدود پر قابو پایا جا سکے۔ ایسے مواد جن کی امیج ایس ایچ جی خوردبین اور اس کے پھیلاؤ کو مختلف بافتوں کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے: کچھ مثالوں کی تصاویر نیچے دی گئی شکل میں دی گئی ہیں: ایکسٹرا سیلولر میٹرکس کے اندر کولیجن بنیادی ایپلی کیشن بنی ہوئی ہے۔ یہ ٹینڈن، جلد، ہڈی، کارنیا، آورٹا، فاشیا، کارٹلیج، مینسکس، انٹرورٹبرل ڈسک میں پایا جا سکتا ہے۔ میوسن کو کنکال کے پٹھوں یا کارڈیک پٹھوں میں بھی دیکھا جا سکتا ہے۔ ٹی ایچ جی مائکروسکوپی تھرڈ ہارمونک جنریشن (ٹی ایچ جی) مائکروسکوپی کے ساتھ جوڑنا ایس ایچ جی مائکروسکوپی کے لیے تکمیلی ہو سکتا ہے، کیونکہ یہ ٹرانسورس انٹرفیس کے لیے حساس ہے، اور تھرڈ آرڈر نان لائنر حساسیت ایپلی کیشنز کینسر کی ترقی، ٹیومر کی خصوصیت میموگرافک کثافت کولیجن کثافت سے وابستہ ہے، اس طرح ایس ایچ جی کو چھاتی کے کینسر کی شناخت کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ایس ایچ جی کو عام طور پر دیگر غیر لکیری تکنیکوں سے جوڑا جاتا ہے جیسے کہ مربوط اینٹی اسٹاک رمن بکھرنا یا ٹو فوٹون ایکسائٹیشن مائکروسکوپی، ملٹی فوٹون مائکروسکوپی (یا ٹومگرافی) نامی معمول کے حصے کے طور پر جو بائیوپسیز کی ویو ہسٹولوجی میں غیر ناگوار اور تیز رفتار فراہم کرتا ہے جو کینسر ہو سکتا ہے۔ چھاتی کا کینسر آگے اور پیچھے کی ایس ایچ جی تصاویر کا موازنہ کولیجن کی مائیکرو اسٹرکچر کے بارے میں بصیرت فراہم کرتا ہے، جو خود ٹیومر کے گریڈ اور مرحلے سے متعلق ہے، اور چھاتی میں اس کی ترقی۔ ایس ایچ جی اور 2 پی ای ایف کا موازنہ ٹیومر میں کولیجن کی واقفیت میں تبدیلی کو بھی ظاہر کر سکتا ہے۔ یہاں تک کہ اگر ایس ایچ جی خوردبین نے چھاتی کے کینسر کی تحقیق میں بہت اہم کردار ادا کیا ہے، تو یہ ابھی تک ہسپتالوں میں ایک قابل اعتماد تکنیک کے طور پر، یا عام طور پر اس بیماری کی تشخیص کے لیے قائم نہیں ہوا ہے۔ اعضاء کا کینسر صحت مند اعضاء ایس ایچ جی میں ایک یکساں ایپیٹیلیل پرت اور ان کے اسٹروما میں منظم کولیجن موجود ہوتے ہیں، جبکہ غیر معمولی اعضاء بڑے خلیوں اور تبدیل شدہ کولیجن ڈھانچے کے ساتھ ایک ایپیٹیلیم ظاہر کرتے ہیں۔ آر تناسب کا استعمال یہ ظاہر کرنے کے لیے بھی کیا جاتا ہے کہ کینسر کے لیے فائبرلز کی صف بندی عام بافتوں کے مقابلے میں قدرے زیادہ ہوتی ہے۔ جلد کا کینسر ایس ایچ جی، ایک بار پھر، 2 پی ای ایف کے ساتھ مل کر تناسب کا حساب لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے: جہاں ایس ایچ جی (ریسپ۔ ٹی پی ای ایف) ایس ایچ جی (ریسپ) میں حد بند پکسلز کی تعداد ہے۔ 2 پی ای ایف) تصویر، ایک اعلی ایم ایف ایس آئی جس کا مطلب ہے خالص ایس ایچ جی تصویر (جس میں کوئی فلوروسینس نہیں ہے)۔ سب سے زیادہ ایم ایف ایس آئی کینسر کے بافتوں میں پایا جاتا ہے، جو عام بافتوں سے فرق کرنے کے لیے ایک برعکس موڈ فراہم کرتا ہے۔ ایس ایچ جی کو تھرڈ ہارمونک جنریشن (ٹی ایچ جی) کے ساتھ بھی جوڑا گیا تاکہ یہ ظاہر کیا جا سکے کہ بیکورڈ ٹی ایچ جی ٹیومر میں زیادہ ہے۔ پینکریٹک کینسر پینکریٹک کینسر میں کولیجن الٹرا اسٹرکچر میں ہونے والی تبدیلیوں کی تحقیقات ملٹی فوٹون فلوروسینس اور پولرائزیشن سے حل شدہ ایس ایچ آئی ایم کے ذریعے کی جا سکتی ہیں۔ پھیپھڑوں، کولونک، غذائی نالی اسٹروما اور سروائیکل کینسر کے مطالعہ کے لیے دیگر کینسر ایس ایچ جی خوردبین کی اطلاع دی گئی تھی۔ پیتھولوجیز کا پتہ لگانا تنظیم میں تبدیلیاں یا کولیجن فائبرلز کی قطعیت پیتھولوجی کی علامات ہو سکتی ہیں۔ خاص طور پر، کولیجن ریشوں کی انیسوٹروپک صف بندی نے جلد میں پیتھولوجیکل داغوں سے صحت مند ڈرمس کے امتیازی سلوک کی اجازت دی۔ نیز، کارٹلیج میں پیتھولوجیز جیسے آسٹیو آرتھرائٹس کی پولرائزیشن سے حل شدہ ایس ایچ جی مائکروسکوپی کے ذریعے جانچ کی جا سکتی ہے۔ SHIM کو بعد میں فائبر کارٹلیج (مینیسس) تک بڑھا دیا گیا۔ ٹشو انجینئرنگ ایس ایچ جی کی مخصوص مالیکیولز کی تصویر لینے کی صلاحیت خوردبین کا استعمال کرتے ہوئے ایک مخصوص ٹشو کی ساخت کو ایک وقت میں ایک مواد اور مختلف پیمانوں پر (میکرو سے مائیکرو تک) ظاہر کر سکتی ہے۔ مثال کے طور پر، کولیجن (ٹائپ I) کو خاص طور پر خلیوں کے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ای سی ایم) سے لیا جاتا ہے، یا جب یہ بافتوں میں سکافولڈ یا کنجنکٹو مواد کے طور پر کام کرتا ہے۔ ایس ایچ جی ریشم میں فائبرائن، پٹھوں میں مایوسین اور بائیو سنتھائٹائزڈ سیلولوز کو بھی ظاہر کرتا ہے۔ اس امیجنگ کی تمام صلاحیت کو ٹشو کے مخصوص نکات کو نشانہ بنا کر مصنوعی ٹشوز کو ڈیزائن کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے: ایس ایچ جی درحقیقت کچھ سمتوں، اور مادی مقدار اور ترتیب کی مقداری پیمائش کر سکتا ہے۔ نیز، ایس ایچ جی دیگر ملٹی فوٹون تکنیکوں کے ساتھ مل کر انجینئرڈ ٹشوز کی نشوونما کی نگرانی کے لیے کام کر سکتا ہے، جب نمونہ نسبتا پتلا ہوتا ہے۔ یقینا، انہیں آخر کار من گھڑت بافتوں کے کوالٹی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ آنکھ کی سطح پر آنکھ کے کارنیا کی ساخت کو کافی گھنے کولیجن کی خود تنظیم کی خصوصیات کی وجہ سے کولیجن کی پلائیووڈ جیسی ساخت سے بنا ہوا سمجھا جاتا ہے۔ پھر بھی، اس ٹشو میں لیمیل میں کولیجینس واقفیت اب بھی زیر بحث ہے۔ کولیجن کی مورفولوجیکل تبدیلیوں کو ظاہر کرنے کے لیے ایس ایچ جی کے ذریعے کیراٹوکونس کارنیا کی تصویر بھی لی جا سکتی ہے۔ تھرڈ ہارمونک جنریشن (ٹی ایچ جی) مائکروسکوپی کو کارنیا کی تصویر لینے کے لیے بھی استعمال کیا جاتا ہے، جو ایس ایچ جی سگنل کی تکمیل کرتا ہے کیونکہ اس ٹشو میں ٹی ایچ جی اور ایس ایچ جی میکسیما اکثر مختلف جگہوں پر ہوتے ہیں۔ دوسری ہارمونک نسل غیر لکیری آپٹکس دو فوٹون ایکسائٹیشن مائکروسکوپی ذرائع حوالہ جات مائکروسکوپی سیل امیجنگ لیبارٹری کا سامان آپٹیکل مائکروسکوپی بھی دیکھیں۔