GAL4/UAS system
جی اے ایل 4-یو اے ایس نظام ایک بائیو کیمیکل طریقہ ہے جو پھلوں کی مکھی جیسے حیاتیات میں جین کے اظہار اور افعال کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ یہ 1988 میں ہتوشی کاکیدانی اور مارک پٹاشنے، اور نکولس ویبسٹر اور پیئر چمبن کی اس دریافت پر مبنی ہے کہ یو اے ایس ترتیبات سے جڑے گیل 4 جین کے اظہار کو متحرک کرتا ہے۔ یہ طریقہ 1993 میں اینڈریا برانڈ اور نوربرٹ پیریمون نے مکھیوں میں متعارف کرایا تھا اور اسے جین کے اظہار کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک طاقتور تکنیک سمجھا جاتا ہے۔ اس نظام کے دو حصے ہیں: گیل 4 جین، جو خمیر ٹرانسکرپشن ایکٹیویٹر پروٹین گیل 4 کو انکوڈنگ کرتا ہے، اور یو اے ایس (اپ اسٹریم ایکٹیویشن سیکوینس)، ایک اضافہ کنندہ جس سے جی اے ایل 4 خاص طور پر جین ٹرانسکرپشن کو چالو کرنے کے لیے جڑا ہوتا ہے۔ جائزہ گال 4 نظام اس بات کی وضاحت کرنے کے مسائل کو الگ کرنے کی اجازت دیتا ہے کہ کون سے خلیے جین یا پروٹین کا اظہار کرتے ہیں اور تجربہ کار اس علم کے ساتھ کیا کرنا چاہتا ہے۔ جینیاتی ماہرین نے ماڈل حیاتیات (عام طور پر پھلوں کی مکھیوں) کی جینیاتی شکلیں پیدا کی ہیں، جنہیں جی اے ایل 4 لائنیں کہا جاتا ہے، جن میں سے ہر ایک جانور کے بافتوں کے کچھ ذیلی سیٹ میں جی اے ایل 4 کا اظہار کرتا ہے۔ مثال کے طور پر، کچھ لائنیں GAL4 کو صرف پٹھوں کے خلیوں میں، یا صرف اعصاب میں، یا صرف اینٹینا وغیرہ میں ظاہر کر سکتی ہیں۔ خاص طور پر پھلوں کی مکھیوں کے لیے، ایسی دسیوں ہزار لائنیں ہیں، جن میں سب سے زیادہ مفید GAL4 کا اظہار جانور کے صرف ایک بہت ہی مخصوص ذیلی سیٹ میں ہوتا ہے-شاید، مثال کے طور پر، صرف وہی نیوران جو مکھی کے دماغ کے دو مخصوص حصوں کو جوڑتے ہیں۔ خود ان خلیوں میں جی اے ایل 4 کی موجودگی کا بہت کم یا کوئی اثر نہیں ہوتا ہے، کیونکہ جی اے ایل 4 کا بنیادی اثر یو اے ایس کے علاقے سے جڑا ہوتا ہے، اور زیادہ تر خلیوں میں کوئی (یا بے ضرر) یو اے ایس کے علاقے نہیں ہوتے ہیں۔ چونکہ گیل 4 بذات خود نظر نہیں آتا، اور خلیوں پر اس کا بہت کم اثر پڑتا ہے، اس نظام کا دوسرا ضروری حصہ "رپورٹر لائنیں" ہیں۔ یہ مکھی کے تناؤ ہیں جن میں مطلوبہ جین کے ساتھ خصوصی یو اے ایس خطہ ہوتا ہے۔ یہ جینیاتی ہدایات جانور کے ہر خلیے میں پائی جاتی ہیں، لیکن زیادہ تر خلیوں میں کچھ نہیں ہوتا کیونکہ وہ خلیہ GAL4 پیدا نہیں کر رہا ہوتا ہے۔ جی اے ایل 4 پیدا کرنے والے خلیوں میں، تاہم، یو اے ایس چالو ہوتا ہے، اس کے ساتھ والا جین آن ہوتا ہے، اور یہ اپنے نتیجے میں پروٹین تیار کرنا شروع کر دیتا ہے۔ یہ تفتیش کار کو اطلاع دے سکتا ہے کہ کون سے خلیے GAL4 کا اظہار کر رہے ہیں، اس لیے اصطلاح "رپورٹر لائن" ہے، لیکن خلیوں کے رویے میں ہیرا پھیری کرنے کے لیے جین اکثر استعمال کیے جاتے ہیں۔ عام رپورٹر جینوں میں شامل ہیں: سبز (جی ایف پی) یا سرخ فلوروسینٹ پروٹین (آر ایف پی) جیسے فلوروسینٹ پروٹین، جو سائنس دانوں کو یہ دیکھنے کی اجازت دیتے ہیں کہ کون سے خلیات گال 4 چینلروڈوپسن کا اظہار کرتے ہیں، جو اعصابی خلیوں کے ہلکے حساس محرک کی اجازت دیتا ہے، جو اس کے برعکس روشنی کو نیوران شیبیر کی فائرنگ کو دبانے کی اجازت دیتا ہے، جو نیوران کو بند کر دیتا ہے، لیکن صرف زیادہ درجہ حرارت (30 ڈگری سیلسیس اور اس سے زیادہ) پر۔ اس جین والی مکھیوں کو اوپر اٹھایا جا سکتا ہے اور کم درجہ حرارت پر جانچ کی جا سکتی ہے جہاں ان کے نیوران عام طور پر برتاؤ کریں گے۔ پھر مکھیوں کے جسم کا درجہ حرارت بڑھایا جا سکتا ہے (چونکہ وہ سرد خون والے ہوتے ہیں)، اور یہ نیوران بند ہو جاتے ہیں۔ اگر مکھی کا طرز عمل بدل جاتا ہے، تو اس سے ایک مضبوط اشارہ ملتا ہے کہ وہ نیوران کیا کرتے ہیں۔ جی ای سی آئی (جینیاتی طور پر انکوڈ شدہ کیلشیم انڈیکیٹر)، اکثر پروٹین کے جی سی اے ایم پی خاندان کا رکن ہوتا ہے۔ یہ پروٹین کیلشیم کے سامنے آنے پر فلوروس ہوتے ہیں، جو زیادہ تر خلیوں میں اس وقت ہوتا ہے جب نیوران فائر ہوتا ہے۔ یہ سائنس دانوں کو تصاویر، یا فلمیں لینے کی اجازت دیتا ہے، جو اعصابی نظام کو کام کرتے ہوئے دکھاتے ہیں۔ مثال کے طور پر، سائنس دان سب سے پہلے جی اے ایل 4 لائن سے ایک مکھی کا انتخاب کرکے نیوران کی ایک کلاس کا تصور کر سکتے ہیں جو نیوران کے مطلوبہ سیٹ میں جی اے ایل 4 کا اظہار کرتی ہے، اور اسے ایک رپورٹر لائن کے ساتھ عبور کرتی ہے جو جی ایف پی کا اظہار کرتی ہے۔ اولاد میں، خلیوں کا مطلوبہ ذیلی مجموعہ جی اے ایل 4 بنائے گا، اور ان خلیوں میں جی اے ایل 4 یو اے ایس سے جڑے گا، اور جی ایف پی کی پیداوار کو فعال کرے گا۔ لہذا خلیوں کا مطلوبہ ذیلی سیٹ اب فلوروس سبز ہو جائے گا اور فلوروسینس خوردبین کے ساتھ اس کی پیروی کی جا سکتی ہے۔ اگلا، یہ معلوم کرنے کے لیے کہ یہ خلیے کیا کر سکتے ہیں، تجربہ کار چینل رہوڈوپسن رپورٹر لائن کے ساتھ ایک ہی GAL4 لائن کو عبور کر کے، ان خلیوں میں سے ہر ایک میں چینل رہوڈوپسن کا اظہار کر سکتا ہے۔ اولاد میں منتخب خلیات، اور صرف وہی خلیات، چینل رہوڈوپسن پر مشتمل ہوں گے اور روشن روشنی سے متحرک ہو سکتے ہیں۔ اب سائنسدان اپنی مرضی سے ان مخصوص خلیوں کو متحرک کر سکتا ہے، اور نتیجے میں ہونے والے رویے کی جانچ کر سکتا ہے کہ یہ خلیات کیا کر سکتے ہیں۔ آپریشن گیل 4 ایک ماڈیولر پروٹین ہے جو بڑے پیمانے پر ڈی این اے بائنڈنگ ڈومین اور ایک ایکٹیویشن ڈومین پر مشتمل ہے۔ جس یو اے ایس سے جی اے ایل 4 جڑا ہوتا ہے وہ سی جی جی-این 11-سی سی جی ہے، جہاں این کوئی بھی بیس ہو سکتا ہے۔ اگرچہ جی اے ایل 4 ایک خمیر پروٹین ہے جو عام طور پر دوسرے حیاتیات میں موجود نہیں ہوتا ہے لیکن اسے مختلف حیاتیات جیسے ڈروسفیلا اور انسانی خلیوں میں ٹرانسکرپشن ایکٹیویٹر کے طور پر کام کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے، اس بات کو اجاگر کرتے ہوئے کہ جین کے اظہار کے لیے وہی طریقہ کار ارتقاء کے دوران محفوظ رہے ہیں۔ ڈروسفیلا میں مطالعہ کے لیے، جی اے ایل 4 جین کو مقامی جین پروموٹر، یا ڈرائیور جین کے کنٹرول میں رکھا جاتا ہے، جبکہ یو اے ایس ہدف جین کے اظہار کو کنٹرول کرتا ہے۔ اس کے بعد GAL4 صرف ان خلیوں میں ظاہر ہوتا ہے جہاں ڈرائیور جین عام طور پر فعال ہوتا ہے۔ بدلے میں، جی اے ایل 4 کو صرف جین ٹرانسکرپشن کو چالو کرنا چاہیے جہاں یو اے ایس متعارف کرایا گیا ہو۔ مثال کے طور پر، جی ایف پی (گرین فلوروسینٹ پروٹین) جیسے مرئی مارکر کو انکوڈنگ کرنے والے جین کو فیوز کرکے ڈرائیور جین کے اظہار کے نمونے کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ جی اے ایل 4 اور یو اے ایس ڈروسفیلا میں جین کے اظہار کا مطالعہ کرنے کے لیے بہت مفید ہیں کیونکہ وہ عام طور پر موجود نہیں ہوتے ہیں اور ان کا اظہار خلیے کے دیگر عمل میں مداخلت نہیں کرتا ہے۔ مثال کے طور پر، ڈروسفیلا میں جی اے ایل 4/یو اے ایس-ریگولیٹڈ ٹرانسجینز کا استعمال گلیئل ایکسپریشن کو تبدیل کرنے کے لیے کیا گیا ہے تاکہ روغن منتشر کرنے والے عنصر (پی ڈی ایف) نامی ایک معروف تال سرکیڈین آؤٹ پٹ میں اریتھمک رویے کو پیدا کیا جا سکے۔ تاہم، کچھ تحقیق نے اشارہ کیا ہے کہ ڈروسفیلا میں جی اے ایل 4 کے زیادہ اظہار کے مضر اثرات ہو سکتے ہیں، جو شاید مدافعتی اور تناؤ کے ردعمل سے متعلق ہیں جو بنیادی طور پر ایک اجنبی پروٹین ہے۔ جی اے ایل 4-یو اے ایس نظام کو ڈروسفیلا کے علاوہ افریقی پنجے والے مینڈک زینوپس اور زیبرا فش جیسے حیاتیات میں جین کے اظہار کا مطالعہ کرنے کے لیے بھی استعمال کیا گیا ہے۔ جی اے ایل 4/یو اے ایس نظام کو دو ہائبرڈ اسکریننگ میں بھی استعمال کیا جاتا ہے، جو دو پروٹین یا ڈی این اے کے ساتھ پروٹین کے درمیان تعاملات کی شناخت کا ایک طریقہ ہے۔ ایکسٹینشنز گال 4 کے اظہار کو "انٹرسیکشنل حکمت عملیوں" کے ذریعے اور بھی زیادہ مخصوص بنایا جا سکتا ہے۔ یہ دو مختلف جی اے ایل 4 لائنوں کو یکجا کر سکتے ہیں-جیسے کہ اے اور بی-اس طرح کہ جی اے ایل 4 کا اظہار صرف ان خلیوں میں ہوتا ہے جو لائن اے میں ہوتے ہیں لیکن لائن بی میں نہیں، یا وہ جو لائن اے اور بی دونوں میں ہوتے ہیں۔ جب اندرونی طور پر غیر معمولی جی اے ایل 4 لائنوں کے ساتھ ملایا جاتا ہے، تو یہ بہت مخصوص انتخاب پیش کرتا ہے، جو اکثر ایک ہی خلیے کی قسم تک محدود ہوتا ہے۔ نقصان یہ ہے کہ کم از کم تین آزاد اندراج سائٹس کی ضرورت ہوتی ہے، لہذا لائنوں کو مختلف اور آزاد اندراج سائٹس کا استعمال کرنا چاہیے، اور مطلوبہ حتمی حیاتیات بنانے کے لیے ایک سے زیادہ کراس کی ضرورت ہوتی ہے۔ یہ تحقیق کا ایک بہت فعال شعبہ ہے، اور اس طرح کی بہت سی باہمی حکمت عملی ہیں، جن میں سے دو پر ذیل میں تبادلہ خیال کیا گیا ہے۔ ان خلیوں میں GAL4 اظہار پیدا کرنے کا ایک طریقہ جو لائن A میں ہیں لیکن لائن B میں نہیں ہیں، GAL4 کو ظاہر کرنے کے لیے لائن A کی ضرورت ہوتی ہے، اور GAL80 کو ظاہر کرنے کے لیے لائن B کی ضرورت ہوتی ہے، جو کہ GAL4 انفیکٹر ہے۔ لہذا، صرف وہ خلیے جو اے میں ہیں لیکن بی میں نہیں ہیں ان میں فعال جی اے ایل 4 ہوگا، جو اس کے بعد رپورٹر جین کو چلا سکتے ہیں۔ GAL4 کو صرف A اور B دونوں میں موجود خلیوں میں ظاہر کرنے کے لیے "اسپلٹ-GAL4" نامی تکنیک استعمال کی جا سکتی ہے۔ لائن اے کو جی اے ایل 4 پروٹین کے آدھے حصے کو ظاہر کرنے کے لیے بنایا گیا ہے، جو خود ہی غیر فعال ہے۔ اسی طرح، لائن B کو GAL4 کے دوسرے نصف حصے کو ظاہر کرنے کے لیے بنایا گیا ہے، جو خود بھی غیر فعال ہے۔ صرف وہ خلیے جو دونوں لائنوں میں ہوتے ہیں وہ دونوں حصے بناتے ہیں، جو لیوسین زپر کے ذریعے جی اے ایل 4 میں خود جمع ہوتے ہیں اور رپورٹر جین کو چالو کرتے ہیں۔ حوالہ جات جینیات