Biosynthesis of doxorubicin
ڈاکسوروبیسن (ڈی ایکس آر) ڈاؤنوروبیسن کا ایک 14-ہائیڈروکسلیٹیڈ ورژن ہے، جو اس کے بائیوسینتھیٹک راستے میں ڈی ایکس آر کا فوری پیش خیمہ ہے۔ ڈونوروبیسن ایک قدرتی مصنوعات کے طور پر زیادہ کثرت سے پایا جاتا ہے کیونکہ یہ سٹریپٹومیسیس کے مختلف جنگلی قسم کے تناؤ سے تیار ہوتا ہے۔ اس کے برعکس، صرف ایک معروف غیر جنگلی قسم کی نوع، سٹریپٹومیسیس پیوسیٹیئس ذیلی نسل سیسیس اے ٹی سی سی 27952، ابتدائی طور پر زیادہ وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والی ڈاکسوروبیسن تیار کرنے کے قابل پائی گئی۔ یہ تناؤ آرکیمون اور دیگر نے بنایا تھا۔ 1969 میں ڈونوروبیسن پیدا کرنے والے تناؤ کو تبدیل کرکے، لیکن ڈی ایکس آر کو نہیں، کم از کم قابل شناخت مقدار میں۔ اس کے بعد، ہچنسن کے گروپ نے دکھایا کہ خصوصی ماحولیاتی حالات میں، یا جینیاتی تبدیلیوں کے تعارف سے، سٹریپٹومیسیس کے دیگر تناؤ ڈاکسوروبیسن پیدا کر سکتے ہیں۔ ان کے گروپ نے ڈی ایکس آر کی پیداوار کے لیے درکار بہت سے جینوں کی کلوننگ بھی کی ہے، حالانکہ ان سب کی مکمل خصوصیت نہیں کی گئی ہے۔ 1996 میں، اسٹرول کے گروپ نے ڈوکس اے کو دریافت، الگ تھلگ اور خصوصیت دی، یہ جین انزائم کو انکوڈنگ کرتا ہے جو ڈونوروبیسن کو ڈی ایکس آر میں تبدیل کرتا ہے۔ 1999 تک، انہوں نے ریکومبیننٹ ڈاکس اے، ایک سائٹوکروم پی 450 آکسیڈیز تیار کیا، اور پتہ چلا کہ یہ ڈی ایکس آر بائیو سنتھیسز میں متعدد مراحل کو متحرک کرتا ہے، بشمول ڈونوروبیسن کی طرف جانے والے مراحل۔ یہ اہم تھا کیونکہ یہ واضح ہو گیا کہ ڈونوروبیسن پیدا کرنے والے تمام تناؤ میں ڈی ایکس آر پیدا کرنے کے لیے ضروری جین ہوتے ہیں، جو دونوں میں سے علاج کے لحاظ سے بہت زیادہ اہم ہیں۔ ہچنسن کے گروپ نے ڈی ایکس آر کی پیداوار کو بہتر بنانے کے طریقے تیار کیے، اس کی تجارتی پیداوار میں استعمال ہونے والے خمیر کے عمل سے، نہ صرف ڈاکس اے انکوڈنگ پلازمیڈز کو متعارف کروا کر، بلکہ انزائموں کو غیر فعال کرنے کے لیے تغیرات متعارف کروا کر جو ڈی ایکس آر کے پیشروؤں کو کم مفید مصنوعات میں تبدیل کرتے ہیں، مثال کے طور پر باؤمیسن جیسے گلائکوسائڈز۔ کچھ ٹرپل میوٹینٹس، جنہوں نے ڈاکس اے کو بھی زیادہ ظاہر کیا، ڈی ایکس آر کی پیداوار کو دوگنا کرنے میں کامیاب رہے۔ یہ تعلیمی دلچسپی سے زیادہ ہے کیونکہ اس وقت ڈی ایکس آر کی لاگت تقریبا 13 لاکھ 70 ہزار ڈالر فی کلوگرام تھی اور 1999 میں موجودہ پیداوار 225 کلوگرام سالانہ تھی۔ زیادہ موثر پیداواری تکنیکوں نے غیر لیپوسومل فارمولیشن کی قیمت کو 11 لاکھ ڈالر فی کلو تک کم کر دیا ہے۔ اگرچہ ڈی ایکس آر کو ڈونوروبیسن سے نیم مصنوعی طور پر تیار کیا جا سکتا ہے، اس عمل میں الیکٹروفیلک برومینیشن اور متعدد مراحل شامل ہوتے ہیں اور پیداوار کم ہوتی ہے۔ چونکہ ڈونوروبیسن خمیر کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے، اس لیے یہ مثالی ہوگا اگر بیکٹیریا ڈی ایکس آر کی ترکیب کو زیادہ مؤثر طریقے سے مکمل کر سکے۔ جائزہ ڈاکسوروبیسن (ڈی ایکس آر) کا اینتھراسائکلائن کنکال سٹریپٹومیسیس پیوسیٹیئس میں ٹائپ II پولیکیٹائڈ سنتھس (پی کے ایس) کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے۔ سب سے پہلے، ایک 21-کاربن ڈیکاکیٹائڈ سلسلہ (شکل 1۔ (1)) پروپیونیل-سی او اے سے ایک واحد 3-کاربن پروپیونیل گروپ سے ترکیب کیا جاتا ہے، اور 9 2-کاربن یونٹس میلونیل-سی او اے کے 9 ترتیب وار (تکرار) ڈیکاربکسیلٹیو کنڈینسیشن سے اخذ کیے جاتے ہیں۔ ہر میلونیل-سی او اے یونٹ بڑھتی ہوئی پولی کیٹائڈ زنجیر میں 2-کاربن کیٹائڈ یونٹ کا تعاون کرتا ہے۔ ہر اضافے کو "کم سے کم پی کے ایس" کے ذریعے اتپریرک کیا جاتا ہے جس میں ایک ایسائل کیریئر پروٹین (اے سی پی)، ایک کیٹوسنتھیس (کے ایس)/چین لینتھ فیکٹر (سی ایل ایف) ہیٹروڈائمر اور ایک میلونیل-کوا: اے سی پی ایسائل ٹرانسفرس (ایم اے ٹی) شامل ہوتے ہیں۔ (شکل 10 کے اوپری حصے کا حوالہ دیں۔ یہ عمل فیٹی ایسڈ کی ترکیب، فیٹی ایسڈ سنتھسیس اور ٹائپ I پولی کیٹائڈ کی ترکیب سے بہت ملتا جلتا ہے۔ لیکن، فیٹی ایسڈ کی ترکیب کے برعکس، بڑھتی ہوئی پولی کیٹائڈ زنجیر کے کیٹو گروپوں کو زنجیر کی لمبائی کے دوران تبدیل نہیں کیا جاتا ہے اور وہ عام طور پر مکمل طور پر کم نہیں ہوتے ہیں۔ ٹائپ I پی کے ایس سسٹمز کے برعکس، مصنوعی انزائم (کے ایس، سی ایل ایف، اے سی پی اور اے ٹی) ایک دوسرے سے ہم آہنگی سے منسلک نہیں ہوتے ہیں، اور شاید پولی کیٹائڈ چین کی ترکیب کے ہر مرحلے کے دوران بھی منسلک نہیں رہ سکتے ہیں۔ ڈی ایکس آر کی 21-کاربن ڈیکاکیٹائڈ زنجیر مکمل ہونے کے بعد، بالآخر ایک ٹیٹراسائکلک اینتھراسائکلائن ایگلیکون (گلائکوسائڈ کے بغیر منسلک) تیار کرنے کے لیے مسلسل تبدیلیاں کی جاتی ہیں۔ تھامین ڈائیفاسفیٹ (ٹی ڈی پی) کے اضافے سے متحرک ہونے والی ڈونوسامین امینو شوگر، رد عمل کے ایک اور سلسلے میں پیدا ہوتی ہے۔ اسے اینتھراسائکلائن ایگلیکون سے جوڑا جاتا ہے اور پہلے ڈونوروبیسن اور پھر ڈی ایکس آر تیار کرنے کے لیے مزید تبدیلیاں کی جاتی ہیں۔ ڈی ایکس آر بائیو سنتھیسز کے لیے کم از کم 3 جین کلسٹرز اہم ہیں: ڈی پی ایس جینز جو لکیری پولیکیٹائڈ چین کی ترکیب اور اس کی پہلی سائیکلائزیشن کے لیے درکار انزائمز کی وضاحت کرتے ہیں، ڈی این آر کلسٹر اینتھراسائکلائن ڈھانچے کی بقیہ تبدیلیوں اور امینو شوگر، ڈونوسامین، ترکیب میں شامل ڈی این ایم جینز کے لیے ذمہ دار ہے۔ مزید برآں، پیدا کرنے والے جاندار پر اینتھراسائکلائن کے زہریلے اثرات کو کم کرنے کے لیے "سیلف ریزسٹنس" جینز کا ایک مجموعہ موجود ہے۔ ایک طریقہ کار ایک جھلی پمپ ہے جو خلیے (ڈی آر آر لوکی) سے ڈی ایکس آر کے اخراج کا سبب بنتا ہے۔ چونکہ یہ پیچیدہ مالیکیول صرف مخصوص حالات میں فائدہ مند ہوتے ہیں، اور پیدا کرنے کے لیے بہت زیادہ توانائی کی ضرورت ہوتی ہے، اس لیے ان کی ترکیب کو سختی سے منظم کیا جاتا ہے۔ پولی کیٹائڈ چین کی ترکیب ڈاکسوروبیسن کو ایک خصوصی پولی کیٹائڈ سنتھس کے ذریعے ترکیب کیا جاتا ہے۔ ڈی ایکس آر کی ترکیب میں ابتدائی واقعہ پروپیونیل-سی او اے اسٹارٹر یونٹ کا انتخاب اور دو کاربن کیٹائڈ یونٹ میں اس کا ڈیکاربوکسیلیٹو اضافہ ہے، جو پانچ کاربن بی-کیٹوولیریل اے سی پی تیار کرنے کے لیے میلونیل-سی او اے سے حاصل کیا گیا ہے۔ پانچ کاربن ڈائیکٹائڈ کو اے سی پی کے ذریعے تھیوسٹر ایکسچینج کے ذریعے کے ایس فعال مقام پر سسٹین سلف ہائیڈریل گروپ تک پہنچایا جاتا ہے، اور اے سی پی کو زنجیر سے خارج کیا جاتا ہے۔ مفت اے سی پی سی او اے کے اجرا کے ساتھ میلونیل-سی او اے سے ایک اور میلونیٹ گروپ کو چنتا ہے، جو تھیوسٹر ایکسچینج کے ذریعے بھی ہوتا ہے۔ اے سی پی نئے میلونیٹ کو کے ایس کے فعال مقام پر لاتا ہے جہاں اسے ڈیکاربکسلیٹ کیا جاتا ہے، ممکنہ طور پر سی ایل ایف سب یونٹ کی مدد سے، اور 7 کاربن ٹرائیکیٹائڈ تیار کرنے کے لیے شامل کیا جاتا ہے، جو اب اے سی پی پر لنگر انداز ہوتا ہے (شکل 1 کا اوپری حصہ دیکھیں)۔ ایک بار پھر اے سی پی زنجیر کو کے ایس سب یونٹ کے حوالے کرتا ہے اور ڈیکاکیٹائڈ مکمل ہونے تک اس عمل کو بار بار دہرایا جاتا ہے۔ زیادہ تر ٹائپ II نظاموں میں ابتدائی واقعہ ایک ایسیٹیٹ یونٹ کے اے سی پی کے ذریعہ، جو ایسیٹیل-سی او اے سے ماخوذ ہے، کے ایس/سی ایل ایف ہیٹروڈائمر کے کیٹوسنتھیس (کے ایس) ذیلی یونٹ کے فعال مقام پر پہنچانا ہے۔ ٹائپ II پی کے ایس سسٹمز کے لیے ڈیفالٹ موڈ ایسیٹیٹ کو پرائمر یونٹ کے طور پر شامل کرنا ہے، اور یہ ڈی ایکس آر "کم سے کم پی کے ایس" کے لیے درست ہے۔ دوسرے لفظوں میں، اس نظام سے کے ایس/سی ایل ایف/اے سی پی (ڈی پی ایس اے، بی اور جی) کا عمل 21 کاربن ڈیکاکیٹائڈز پیدا نہیں کرے گا، بلکہ اس کے بجائے 20 کاربن ڈیکاکیٹائڈز پیدا کرے گا، کیونکہ ایسیٹیٹ "ترجیحی" اسٹارٹر ہے۔ پروپیونیٹ کی وضاحت کا عمل مکمل طور پر سمجھ میں نہیں آیا ہے، لیکن یہ واضح ہے کہ یہ ایک اضافی پروٹین، ڈی پی ایس سی پر منحصر ہے، جو پروپیونیل-سی او اے کے لیے کیٹوسنتھیس یا ایسائل ٹرانسفرس سلیکٹو کے طور پر کام کر سکتا ہے، اور ممکنہ طور پر ڈی پی ایس ڈی حصہ ڈالتا ہے۔ ان وٹرو حالات میں پولی کیٹائڈ کی پیداوار کے لیے ایک وقف شدہ ایم اے ٹی قابل تقسیم پایا گیا ہے۔ پی کے ایس ایم اے ٹی کو اپنے فیٹی ایسڈ سنتھس سے "ادھار" لے سکتا ہے اور یہ بنیادی طریقہ ہو سکتا ہے جس سے اے سی پی ڈی ایکس آر بائیو سنتھیسز میں اپنے میلونیٹ گروپ کو حاصل کرتا ہے۔ مزید برآں، اس بات کے بہترین ثبوت موجود ہیں کہ "سیلف میلونیلیشن" ٹائپ II اے سی پیز کی ایک موروثی خصوصیت ہے۔ خلاصہ یہ ہے کہ دی گئی قسم II پی کے ایس اپنا ایم اے ٹی فراہم کر سکتا ہے، وہ ایف اے ایس سے قرض لے سکتا ہے، یا اس کا اے سی پی "سیلف میلونیلیٹ" کر سکتا ہے۔ یہ معلوم نہیں ہے کہ آیا وہی کے ایس/سی ایل ایف/اے سی پی ٹرنیری کمپلیکس پورے اتپریرک چکر کے ذریعے ایک مکمل لمبائی والی پولی کیٹائڈ زنجیر کی نشوونما کو بڑھاتا ہے، یا آیا اے سی پی ہر سنکشیپن رد عمل کے بعد الگ ہوجاتا ہے۔ ایکٹینورہوڈن کے ایس/سی ایل ایف کا ایک 2.0-Å ریزولوشن ڈھانچہ، جو ڈی پی ایس کے ایس/سی ایل ایف سے بہت ملتا جلتا ہے، ظاہر کرتا ہے کہ کے ایس اور سی ایل ایف ذیلی اکائیوں کے انٹرفیس پر بنی ایمفیپیتھک سرنگ کے اندر پولی کیٹائڈز کو لمبا کیا جا رہا ہے۔ سرنگ تقریبا 17-Å لمبی ہے اور ایک طرف بہت سے چارج شدہ امینو ایسڈ کے باقیات ہیں جو سلسلہ کے کاربونل گروپوں کو مستحکم کرتے دکھائی دیتے ہیں، جبکہ دوسری طرف ہائیڈروفوبک ہے۔ یہ ڈھانچہ وضاحت کرتا ہے کہ زنجیر کی لمبائی کے لیے دونوں ذیلی اکائیاں کیوں ضروری ہیں اور کس طرح رد عمل سے بڑھتی ہوئی زنجیر کو بے ترتیب بے ساختہ رد عمل سے محفوظ رکھا جاتا ہے جب تک کہ یہ منظم سائیکلائزیشن کے لیے مناسب طریقے سے پوزیشن میں نہ ہو۔ یہ ڈھانچہ زنجیر کی لمبائی کے ضابطے کے لیے ایک طریقہ کار بھی تجویز کرتا ہے۔ امینو ایسڈ سائیڈ گروپ سرنگ میں پھیلتے ہیں اور "گیٹ" کے طور پر کام کرتے ہیں۔ خاص طور پر ایک دو بڑے باقیات زنجیر کے ذریعے ناقابل گزر ہو سکتے ہیں، جس کی وجہ سے ان کا خاتمہ ہو سکتا ہے۔ اس ڈھانچے کی بنیاد پر سرنگ کے باقیات میں تبدیلیاں حتمی پروڈکٹ کی زنجیر کی لمبائی کو تبدیل کرنے میں کامیاب ہوئیں۔ حتمی ارتکاز پولیکیٹائڈ چین کو "بکل" کرنے کا سبب بنتا ہے جس کی وجہ سے سی-12 میتھلین کاربنیئن کے ذریعہ انٹرا مالیکیولر حملہ ہوتا ہے، جو انزائم اتپریرک پروٹون ہٹانے سے پیدا ہوتا ہے اور سی-7 کاربونل پر سرنگ میں الیکٹروسٹیٹک تعاملات کے ذریعے مستحکم ہوتا ہے (شکل 1 میں 3 دیکھیں)۔ یہ سرنگ کی مدد سے انٹرا مالیکیولر الڈول کنڈینسیشن پہلا سائیکلائزیشن فراہم کرتا ہے جب سلسلہ سرنگ میں ہوتا ہے۔ اسی طرح کا سی-7/سی-12 حملہ ڈی ایکس آر کی حیاتیاتی ترکیب میں بھی اسی طرح ہوتا ہے۔ 12-ڈیوکسیالکلونک ایسڈ میں تبدیلی 21-کاربن ڈیکاکیٹائڈ کو 3 مراحل میں 12-ڈیوکسیالکلونک ایسڈ (5) میں تبدیل کیا جاتا ہے، جو ڈی ایکس آر بائیوسنتھیس میں پہلا آزاد آسانی سے الگ تھلگ انٹرمیڈیٹ ہے۔ یہ مراحل ڈی پی ایس جین کلسٹر میں آخری 3 انزائموں کے ذریعے اتپریرک ہوتے ہیں اور انہیں پولیکیٹائڈ سنتھس کا حصہ سمجھا جاتا ہے۔ جب کہ ڈیکاکیٹائڈ اب بھی کے ایس/سی ایل ایف ہیٹروڈائمر سے وابستہ ہے، 9-کاربونل گروپ کو ڈی پی ایس ای، 9-کیٹوریڈیکٹس کے ذریعے کم کیا جاتا ہے، جس میں این اے ڈی پی ایچ کو کم کرنے والے ایجنٹ/ہائیڈرائڈ ڈونر کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ ڈی پی ایس ایف، "فرسٹ رنگ سائکلیز"/ارومیٹیز، بہت مخصوص ہے اور سی-7/سی-12 سائکلیز کے خاندان میں ہے جس میں پہلے سی-9 کیٹو-کمی کی ضرورت ہوتی ہے۔ یہ دونوں تعاملات اس وقت محسوس کیے جاتے ہیں جب کہ پولی کیٹائڈ سلسلہ اب بھی جزوی طور پر کے ایس/سی ایل ایف سرنگ میں ہے اور یہ معلوم نہیں ہے کہ آخر اس سلسلے کو اس کے کوولینٹ لنک سے کے ایس یا اے سی پی سے کیا الگ کرتا ہے۔ اگر ڈی پی ایس ایف سائکلیز تغیرات یا جین کو حذف کرنے سے غیر فعال ہو جاتا ہے، تو سلسلہ بے ترتیب انداز میں بے ساختہ سائیکلائز ہو جائے گا۔ اس طرح، ڈی پی ایس ایف کے بارے میں خیال کیا جاتا ہے کہ وہ "چیپرون" ہے یا غیر بے ترتیب سائیکلائزیشن کو یقینی بنانے کے لیے پولی کیٹائڈ کو جوڑنے میں مدد کرتا ہے، ایک ایسا رد عمل جو توانائی کے لحاظ سے سازگار ہوتا ہے اور بعد میں پانی کی کمی اور اس کے نتیجے میں خوشبو کا باعث بنتا ہے۔ اگلا، ڈی پی ایس وائی ریگیو سلیکٹیو طور پر اگلے دو کاربن-کاربن بانڈز کی تشکیل کو فروغ دیتا ہے اور پھر پانی کی کمی کو متحرک کرتا ہے جس کے نتیجے میں ایک رنگ کی خوشبو پیدا ہوتی ہے (5)۔ ε-rhodomycinone میں تبدیلی اگلے رد عمل ڈی این آر جین کلسٹر سے پیدا ہونے والے انزائموں کے ذریعے اتپریرک ہوتے ہیں۔ ڈی این آر جی، ایک سی-12 آکسیجنز (نمبر کے لیے (5 دیکھیں)) سالماتی آکسیجن کا استعمال کرتے ہوئے ایک کیٹو گروپ متعارف کراتا ہے۔ یہ ایک "اینتھروون قسم کا آکسیجنیز" ہے، جسے کوئنون بنانے والا مونو آکسیجنیز بھی کہا جاتا ہے، جن میں سے بہت سے خوشبودار پولیکیٹائڈ اینٹی بائیوٹکس کی کئی اقسام کی حیاتیاتی ترکیب میں اہم "ٹیلرنگ انزائمز" ہیں۔ ان کے کوئی کوفیکٹر نہیں ہیں: کوئی فلاون، دھاتیں یا توانائی کے ذرائع نہیں ہیں۔ ان کا طریقہ کار ناقص طور پر سمجھا جاتا ہے لیکن اس میں "پروٹین ریڈیکل" شامل ہو سکتا ہے۔ الکالونک ایسڈ (6)، ایک کوئنون، پروڈکٹ ہے۔ ڈی این آر سی، الکلونک ایسڈ-او-میتھائل ٹرانسفرس ایس-اڈینوسیل میتھیونائن (ایس اے ایم) کو کوفیکٹر/میتھائل گروپ ڈونر کے طور پر استعمال کرتے ہوئے ایک ایسٹر بنانے والے مالیکیول کے کاربوکسلک ایسڈ کے سرے کو میتھیلیٹ کرتا ہے۔ پروڈکٹ الکلونک ایسڈ میتھائل ایسٹر (7) ہے۔ میتھائل گروپ کو بعد میں ہٹا دیا جاتا ہے، لیکن یہ ملحقہ میتھلین پل کو فعال کرنے کا کام کرتا ہے جس سے ٹرمینل کاربونل گروپ پر اس کے حملے میں آسانی ہوتی ہے، یہ رد عمل ڈی این آر ڈی کے ذریعہ اتپریرک ہوتا ہے۔ ڈی این آر ڈی، چوتھا رنگ سائکلیز (اے اے ایم ای سائکلیز)، ایک انٹرا مالیکیولر ایلڈول کے اضافے کے رد عمل کو متحرک کرتا ہے۔ کسی کوفیکٹر کی ضرورت نہیں ہے اور نہ ہی ارومیٹائزیشن ہوتی ہے اور نہ ہی پانی کی کمی ہوتی ہے۔ ایک سادہ بیس اتپریرک طریقہ کار تجویز کیا گیا ہے۔ پروڈکٹ اکلاوکیٹون (8) ہے۔ ڈی این آر ایچ، اکلاوکیٹون ریڈکٹیس، اکلاوینون (9) دینے کے لیے نئی چوتھی رنگ کے 17-کیٹو گروپ کو 17-او ایچ گروپ میں گھٹا دیتا ہے۔ یہ ایک نیا چیرل سینٹر متعارف کراتا ہے اور این اے ڈی پی ایچ ایک کوفیکٹر ہے۔ ڈی این آر ایف، اکلاوینون-11-ہائیڈروکسیلیز، ایک ایف اے ڈی مونو آکسیجنیز ہے جو بعد میں ہائیڈروکسیلیشن کے لیے مالیکیولر آکسیجن کو چالو کرنے کے لیے این اے ڈی پی ایچ کا استعمال کرتا ہے۔ ε-rhodomycinone (10) پروڈکٹ ہے۔ ڈاکسوروبیسن ڈی این آر ایس میں تبدیلی، ڈاؤنوسامین گلائکوسیل ٹرانسفرس روڈومیسن ڈی (شکل 2) دینے کے لیے ٹی ڈی پی ایکٹیویٹڈ گلائکوسائڈ، ایل-ڈاؤنوسامین-ٹی ڈی پی کو ε-روڈومیسنون میں شامل کرنے کو متحرک کرتا ہے۔ ٹی ڈی پی کی رہائی ردعمل کو آگے بڑھاتی ہے۔ انزائم کی ترتیب ٹائپ II پی کے ایس خوشبودار مصنوعات میں شامل دیگر "غیر معمولی شکر" کے گلائکوسیل ٹرانسفرسز سے مماثلت رکھتی ہے۔ ڈی این آر پی، روڈومیسن ڈی میتھائلسٹیرس، ڈی این آر سی کے ذریعے پہلے شامل کیے گئے میتھائل گروپ کو ہٹا دیتا ہے۔ اس نے ابتدائی طور پر ملحقہ میتھلین پل کو چالو کرنے کی خدمت کی، اور اس کے بعد اس نے اپنے کاربوکسیل گروپ کو سی-10 کاربن کو چھوڑنے سے روک دیا (شکل 2 دیکھیں)۔ اگر کاربوکسیل گروپ کو چوتھی رنگ سائیکلائزیشن سے پہلے ایسٹرفائی نہیں کیا جاتا، تو اس کی روانگی جیسا کہ سائیکلکلک خوشبودار نظام کی تشکیل سے پسند کی جاتی۔ سی-7 میں کمی اور گلائکوسیلیشن کے بعد، سی-8 میتھلین پل اب ڈیپروٹونیشن کے لیے فعال نہیں ہوتا، اس طرح ارومیٹائزیشن کا امکان کم ہو جاتا ہے۔ نوٹ کریں کہ نمبر کے ساتھ غیر الگ تھلگ انٹرمیڈیٹ، شکل 2 میں تیسرا مالیکیول ہے۔ نمبر کا نظام بہت عجیب ہے اور ابتدائی نام کا ایک نشان ہے۔ انٹرمیڈیٹ کا ڈیکاربکسایلیشن بے ساختہ ہوتا ہے، یا ڈی این آر پی کے اثر سے ہوتا ہے، جس سے 13-ڈی آکسی کارمینومیسن ملتا ہے۔ ایک کرسٹل ڈھانچہ، باؤنڈ پروڈکٹس کے ساتھ، ایکلاسینومیسن میتھائلسٹیرس کا، ایک [انزائم] 53 ٪ سیکوینس ہومیولوجی کے ساتھ ڈی این آر پی، سٹریپٹومیسیس پرپوراسینس سے، حل کیا گیا ہے۔ یہ ایک ہی رد عمل کو متحرک کرنے کے قابل ہے اور ایک کلاسک سر-ہس-ایس پی اتپریرک تثلیث کا استعمال کرتا ہے جس میں سیرائن نیوکلیوفائل اور گلائی میٹ کے طور پر کام کرتا ہے جو "آکسیانیون ہول" بنا کر منتقلی کی حالت کو مستحکم کرتا ہے۔ فعال سائٹ امینو ایسڈ تقریبا مکمل طور پر ڈی این آر پی جیسے ہی ہوتے ہیں، اور طریقہ کار تقریبا یقینی طور پر ایک جیسا ہوتا ہے۔ اگرچہ ڈاکس اے کو بائیو سنتھیٹک اسکیم (شکل 2) میں اگلا دکھایا گیا ہے، ڈی این آر کے، کارمینومیسن 4-او-میتھائل ٹرانسفرس شکل 2 میں کسی بھی گلائکوسائڈز کے 4-ہائیڈروکسیل گروپ کو او-میتھیلیٹ کرنے کے قابل ہے۔ باؤنڈ پروڈکٹس کے ساتھ انزائم کا 2.35 Å ریزولوشن کرسٹل ڈھانچہ حال ہی میں حل کیا گیا ہے۔ مصنوعات کی واقفیت میتھائل ٹرانسفر کے ایس این 2 میکانزم کے مطابق ہے۔ فعال سائٹ میں ممکنہ ایسڈ/بیس کے باقیات کی سائٹ پر مبنی میوٹیجینیسیس نے اتپریرک کو متاثر نہیں کیا جس سے یہ نتیجہ اخذ کیا گیا کہ Dnr K ممکنہ طور پر اس شرح میں اضافے میں ایک اینٹروپک انزائم کے طور پر کام کرتا ہے جو بنیادی طور پر واقفیت اور قربت کے اثرات کی وجہ سے ہے۔ یہ زیادہ تر دوسرے او-میتھائل ٹرانسفرسز کے برعکس ہے جہاں ایسڈ/بیس اتپریرک کو شرح میں اضافے میں ایک لازمی شراکت کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ ڈاکس اے سٹریپٹومیسیس پیوسیٹیوس میں لگاتار تین آکسیکرن کو متحرک کرتا ہے۔ ڈی ایکس آر کی کمی کی پیداوار بنیادی طور پر ڈاکس اے کی کم سطح یا خرابی کی وجہ سے نہیں ہے، بلکہ اس وجہ سے ہے کہ بہت سی مصنوعات شکل 2 میں دکھائے گئے راستے سے ہٹ گئی ہیں۔ ہر ایک گلائکوسائڈ شونٹ انزائم کا ایک ممکنہ ہدف ہے، جو دکھایا نہیں گیا ہے، جن میں سے کچھ ڈی این آر جین کلسٹر کی مصنوعات ہیں۔ ان انزائموں کی تغیرات سے ڈی ایکس آر کی پیداوار میں نمایاں اضافہ ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، سی-14 آکسیکرن (130/ایم) کے لیے ڈاکس اے کی قدر سی-13 آکسیکرن (کچھ سبسٹریٹس کے لیے 22,000/ایم تک) کے مقابلے میں بہت کم ہے۔ ڈوکس اے کو زیادہ اظہار کرنے کے لیے جینیاتی ہیرا پھیری نے بھی پیداوار میں اضافہ کیا ہے، خاص طور پر اگر شونٹ انزائم کے جین بیک وقت غیر فعال ہو جائیں۔ ڈاکس اے ایک سائٹوکروم پی-450 مونو آکسیجنیز ہے جس میں وسیع سبسٹریٹ کی خاصیت ہوتی ہے، جو سی-13 اور سی-14 (شکل 2) پر اینتھراسائکلائن ہائیڈروکسیلیشن کو متحرک کرتی ہے۔ انزائم میں مالیکیولر آکسیجن اور این اے ڈی پی ایچ کی مطلق ضرورت ہوتی ہے۔ ابتدائی طور پر، سی-13 پر دو یکے بعد دیگرے آکسیڈیشن کیے جاتے ہیں، اس کے بعد سی-14 کی ایک واحد آکسیڈیشن ہوتی ہے جو ڈاونوروبیسن کو ڈاکسوروبیسن میں تبدیل کرتی ہے۔ حوالہ جات ٹوپوآئسومیرس انفیکٹرز بائیوسنتھیس