De novo transcriptome assembly
ڈی نووو ٹرانسکرپٹوم اسمبلی حوالہ جینوم کی مدد کے بغیر ٹرانسکرپٹوم بنانے کا ڈی نووو سیکوینس اسمبلی کا طریقہ ہے۔ تعارف نئی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کی ترقی کے نتیجے میں، 2008 اور 2012 کے درمیان کے سالوں میں سیکوینسنگ کی لاگت میں بڑی کمی دیکھی گئی۔ فی میگا بیس اور جینوم، قیمت بالترتیب قیمت کے 1/100,000 th اور 1/10,000 th تک گر گئی۔ اس سے پہلے، صرف ایسے حیاتیات کے ٹرانسکرپٹومز کی ترتیب دی گئی تھی جو سائنسی تحقیق کے لیے وسیع دلچسپی اور افادیت کے حامل تھے۔ تاہم، یہ 2010 کی دہائی میں تیار کردہ ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ (جسے نیکسٹ جنریشن سیکوینسنگ بھی کہا جاتا ہے) ٹیکنالوجیز لاگت اور محنت دونوں سے موثر ہیں، اور ان طریقوں کے ذریعے مطالعہ کیے جانے والے حیاتیات کی حد بڑھ رہی ہے۔ بعد میں چنے، پلانریئنز، پارہیال ہوائیینسس کے ساتھ ساتھ نیل مگرمچھ، مکئی کے سانپ، داڑھی والا ڈریگن، اور سرخ کان والے سلائیڈر کے دماغ کے لیے ٹرانسکرپٹومز بنائے گئے ہیں، جن میں سے صرف چند ہی نام ہیں۔ غیر ماڈل حیاتیات کا معائنہ "دلچسپ مورفولوجیکل اختراعات کے تنوع" کے بنیادی طریقہ کار کے بارے میں نئی بصیرت فراہم کر سکتا ہے جس نے سیارے زمین پر زندگی کی کثرت کو قابل بنایا ہے۔ جانوروں اور پودوں میں، "اختراعات" جن کی عام ماڈل حیاتیات میں جانچ نہیں کی جا سکتی ہے ان میں نقالی، باہمی، پرجیوی اور غیر جنسی تولید شامل ہیں۔ ڈی نووو ٹرانسکرپٹوم اسمبلی اکثر غیر ماڈل حیاتیات کا مطالعہ کرنے کا ترجیحی طریقہ ہے، کیونکہ یہ جینوم بنانے سے سستا اور آسان ہے، اور حوالہ پر مبنی طریقے موجودہ جینوم کے بغیر ممکن نہیں ہیں۔ ان حیاتیات کے ٹرانسکرپٹوم اس طرح نئے پروٹین اور ان کی آئسوفارم کو ظاہر کر سکتے ہیں جو اس طرح کے منفرد حیاتیاتی مظاہر میں ملوث ہیں۔ ڈی نووو بمقابلہ حوالہ پر مبنی اسمبلی جمع شدہ نقل کا ایک مجموعہ ابتدائی جین کے اظہار کے مطالعے کی اجازت دیتا ہے۔ ٹرانسکرپٹوم اسمبلی کمپیوٹر پروگراموں کی ترقی سے پہلے، ٹرانسکرپٹوم ڈیٹا کا تجزیہ بنیادی طور پر ایک حوالہ جینوم کی نقشہ سازی کے ذریعے کیا جاتا تھا۔ اگرچہ جینوم کی صف بندی نقل کے ترتیبات کی خصوصیت کا ایک مضبوط طریقہ ہے، لیکن یہ طریقہ ایم آر این اے نقل کی ساختی تبدیلیوں کے واقعات، جیسے متبادل اسپلیسنگ کا حساب دینے میں ناکامی کی وجہ سے نقصان دہ ہے۔ چونکہ جینوم میں تمام انٹرن اور ایکسون کا مجموعہ ہوتا ہے جو ایک نقل میں موجود ہو سکتے ہیں، اس لیے جڑے ہوئے متغیرات جو جینوم کے ساتھ مسلسل صف بندی نہیں کرتے ہیں انہیں اصل پروٹین آئسوفارم کے طور پر چھوٹ دی جا سکتی ہے۔ یہاں تک کہ اگر ایک حوالہ جینوم دستیاب ہے، ڈی نووو اسمبلی انجام دی جانی چاہیے، کیونکہ یہ ان نقل کو بازیافت کر سکتا ہے جو جینوم کے ان حصوں سے نقل کیے گئے ہیں جو حوالہ جینوم اسمبلی سے غائب ہیں۔ ٹرانسکرپٹوم بمقابلہ جینوم اسمبلی جینوم سیکوینس کوریج کی سطحوں کے برعکس-جو ڈی این اے کے غیر کوڈنگ انٹرن علاقوں میں دہرائے جانے والے مواد کے نتیجے میں تصادفی طور پر مختلف ہو سکتی ہے-ٹرانسکرپٹوم سیکوینس کوریج کی سطح جین کے اظہار کی سطح کی براہ راست نشاندہی کر سکتی ہے۔ یہ بار بار ترتیبات جینوم اسمبلی میں کونٹیگز کی تشکیل میں بھی ابہام پیدا کرتے ہیں، جبکہ ٹرانسکرپٹوم اسمبلی کونٹیگز میں ابہام عام طور پر اسپلیسڈ آئسوفارم، یا جین فیملی کے ممبروں کے درمیان معمولی تغیرات سے مطابقت رکھتے ہیں۔ جینوم اسمبلر کو کئی وجوہات کی بنا پر ٹرانسکرپٹوم اسمبلی میں براہ راست استعمال نہیں کیا جا سکتا۔ سب سے پہلے، جینوم کی ترتیب کی گہرائی عام طور پر جینوم میں یکساں ہوتی ہے، لیکن نقل کی گہرائی مختلف ہو سکتی ہے۔ دوسرا، دونوں تاروں کو ہمیشہ جینوم کی ترتیب میں ترتیب دیا جاتا ہے، لیکن آر این اے-سی کیو تار کے لیے مخصوص ہو سکتا ہے۔ تیسرا، ٹرانسکرپٹوم اسمبلی زیادہ مشکل ہے کیونکہ ایک ہی جین سے ٹرانسکرپٹ متغیرات ایکسون کا اشتراک کر سکتے ہیں اور غیر واضح طور پر حل کرنا مشکل ہے۔ طریقہ آر این اے-سی کیو ایک بار جب خلیوں سے آر این اے نکالا اور صاف کیا جاتا ہے، تو اسے ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کی سہولت کے لیے بھیجا جاتا ہے، جہاں اسے سی ڈی این اے لائبریری بنانے کے لیے پہلے ریورس ٹرانسکرائب کیا جاتا ہے۔ اس سی ڈی این اے کو پھر ترتیب کے لیے استعمال ہونے والے پلیٹ فارم کے لحاظ سے مختلف لمبائی میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔ مندرجہ ذیل پلیٹ فارمز میں سے ہر ایک لاکھوں مختصر ریڈز کو ترتیب دینے کے لیے ایک مختلف قسم کی ٹیکنالوجی کا استعمال کرتا ہے: 454 سیکوینسنگ، الومینا، اور سولڈ۔ اسمبلی الگورتھم سی ڈی این اے سیکوینس ریڈز کو ایک مختصر ریڈ ٹرانسکرپٹ اسمبلی پروگرام کے ذریعے نقل میں جمع کیا جاتا ہے۔ زیادہ تر امکان ہے کہ نقل کے درمیان کچھ امینو ایسڈ کے تغیرات جو بصورت دیگر ایک جیسے ہوتے ہیں مختلف پروٹین آئسوفارم کی عکاسی کرتے ہیں۔ یہ بھی ممکن ہے کہ وہ ایک ہی جین خاندان کے اندر مختلف جینوں کی نمائندگی کریں، یا یہاں تک کہ ایسے جین جو تغیر کی ڈگری کے لحاظ سے صرف ایک محفوظ ڈومین کا اشتراک کرتے ہیں۔ اسمبلی کے متعدد پروگرام دستیاب ہیں (اسمبلی دیکھیں)۔ اگرچہ یہ پروگرام عام طور پر جینوم کو جمع کرنے میں کامیاب رہے ہیں، لیکن ٹرانسکرپٹوم اسمبلی کچھ منفرد چیلنجز پیش کرتی ہے۔ جبکہ جینوم کے لیے اعلی ترتیب کا احاطہ تکراری ترتیبات کی موجودگی کی نشاندہی کر سکتا ہے (اور اس طرح نقاب پوش کیا جا سکتا ہے)، ایک ٹرانسکرپٹوم کے لیے، وہ کثرت کی نشاندہی کر سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، جینوم سیکوینسنگ کے برعکس، ٹرانسکرپٹوم سیکوینسنگ اسٹرینڈ مخصوص ہو سکتی ہے، جس کی وجہ احساس اور اینٹی سینس ٹرانسکرپٹ دونوں کے امکان ہیں۔ آخر میں، تمام اسپلائنگ آئسوفارم کو دوبارہ تعمیر کرنا اور الگ کرنا مشکل ہو سکتا ہے۔ شارٹ ریڈ اسمبلرز عام طور پر دو بنیادی الگورتھم میں سے ایک کا استعمال کرتے ہیں: اوورلیپ گراف اور ڈی بروجن گراف۔ اوورلیپ گراف کا استعمال زیادہ تر اسمبلرز کے لیے کیا جاتا ہے جو سینگر ترتیب شدہ ریڈز کے لیے بنائے گئے ہیں۔ ریڈز کے ہر جوڑے کے درمیان اوورلیپس کا حساب لگایا جاتا ہے اور ایک گراف میں مرتب کیا جاتا ہے، جس میں ہر نوڈ ایک واحد ترتیب کی نمائندگی کرتا ہے۔ یہ الگورتھم ڈی بروجن گراف کے مقابلے میں کمپیوٹیشنل طور پر زیادہ گہرا ہے، اور اعلی درجے کے اوورلیپ کے ساتھ کم ریڈز کو جمع کرنے میں سب سے زیادہ موثر ہے۔ ڈی بروجن گرافز کونٹگس بنانے کے لیے کے-1 ترتیب کے تحفظ کی بنیاد پر کے-مرز (عام طور پر 25-50 بی پی) کو صف بندی کرتے ہیں۔ کے-مرز پڑھنے کی لمبائی سے چھوٹے ہوتے ہیں جو تیز ہیشنگ کی اجازت دیتے ہیں لہذا ڈی بروجن گراف میں کارروائیاں عام طور پر کم کمپیوٹیشنل طور پر گہری ہوتی ہیں۔ فنکشنل اینوٹیشن جمع شدہ نقل کی فنکشنل اینوٹیشن مخصوص سالماتی افعال، سیلولر اجزاء، اور حیاتیاتی عمل میں بصیرت کی اجازت دیتی ہے جس میں پوٹیٹو پروٹین شامل ہوتے ہیں۔ بلاسٹ 2 جی او (بی 2 جی) جین آنٹولوجی پر مبنی ڈیٹا مائننگ کو ترتیب کے ڈیٹا کی تشریح کرنے کے قابل بناتا ہے جس کے لیے ابھی تک کوئی جی او اینوٹیشن دستیاب نہیں ہے۔ یہ ایک تحقیقی ٹول ہے جو اکثر غیر ماڈل پرجاتیوں پر فنکشنل جینومکس ریسرچ میں استعمال ہوتا ہے۔ یہ غیر ضرورت پروٹین ڈیٹا بیس (این سی بی آئی میں) کے خلاف جمع شدہ کونٹیگس کو دھماکے سے اڑا کر کام کرتا ہے، پھر ترتیب کی مماثلت کی بنیاد پر ان کی تشریح کرتا ہے۔ گوانا ایک اور جی او اینوٹیشن پروگرام ہے جو جانوروں اور زرعی پودوں کی جین مصنوعات کے لیے مخصوص ہے جو اسی طرح کام کرتا ہے۔ یہ جی او اینوٹیشن اور تجزیہ کے لیے کمپیوٹیشنل ٹولز کے کیوریٹڈ، عوامی طور پر قابل رسائی سوٹ کے ایگ بیس ڈیٹا بیس کا حصہ ہے۔ تشریح کے بعد، کے ای جی جی (کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینومز) ٹرانسکرپٹوم میں پکڑے گئے میٹابولک راستوں اور مالیکیولر انٹرایکشن نیٹ ورکس کے تصور کو قابل بناتا ہے۔ جی او کی شرائط کے لیے تشریح کیے جانے کے علاوہ، ان نقل سے حاصل ہونے والے پروٹین کی امینو ایسڈ کی ترتیب کی پیش گوئی کرنے کے لیے کونٹیگس کو اوپن ریڈنگ فریم (او آر ایف) کے لیے بھی اسکرین کیا جا سکتا ہے۔ ایک اور طریقہ یہ ہے کہ پروٹین ڈومینز کی تشریح کی جائے اور مخصوص جینوں کے بجائے جین خاندانوں کی موجودگی کا تعین کیا جائے۔ تصدیق اور کوالٹی کنٹرول چونکہ ایک اچھی طرح سے حل شدہ حوالہ جینوم شاذ و نادر ہی دستیاب ہوتا ہے، اس لیے کمپیوٹر سے جمع شدہ کونٹگس کے معیار کی تصدیق یا تو جمع شدہ ترتیبات کا موازنہ ان کو تیار کرنے کے لیے استعمال ہونے والے ریڈز (حوالہ سے پاک) سے کرکے، یا ایم آر این اے ٹرانسکرپٹ میں پائے جانے والے محفوظ جین ڈومینز کے ترتیبات کو ٹرانسکرپٹومز یا قریب سے متعلق پرجاتیوں (حوالہ پر مبنی) کے جینومز سے ہم آہنگ کرکے کی جا سکتی ہے۔ ٹرانسٹریٹ اور ڈیٹونیٹ جیسے ٹولز ان طریقوں سے اسمبلی کے معیار کے شماریاتی تجزیے کی اجازت دیتے ہیں۔ ایک اور طریقہ پیش گوئی شدہ نقل کے لیے پی سی آر پرائمر ڈیزائن کرنا ہے، پھر انہیں سی ڈی این اے لائبریری سے بڑھانے کی کوشش کریں۔ اکثر، غیر معمولی مختصر ریڈز کو فلٹر کیا جاتا ہے۔ مختصر ترتیبات (<40 امینو ایسڈ) کے فعال پروٹین کی نمائندگی کرنے کا امکان نہیں ہے، کیونکہ وہ آزادانہ طور پر فولڈ کرنے اور ہائیڈروفوبک کور بنانے سے قاصر ہیں۔ ان میٹرکس کی تکمیل، جین کے مواد کی مقداری تشخیص اسمبلی کے معیار کے بارے میں اضافی بصیرت فراہم کر سکتی ہے۔ اس مرحلے کو انجام دینے کے لیے، ایسے اوزار استعمال کیے جا سکتے ہیں جو محفوظ جینوں پر مبنی متوقع جین کی جگہ کا نمونہ بناتے ہیں، جیسے کہ بسکو۔ یوکرائٹس کے لیے، سی ای جی ایم اے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے، حالانکہ اسے 2015 سے باضابطہ طور پر سپورٹ نہیں کیا گیا ہے۔ اسمبلرز درج ذیل اسمبلی سافٹ ویئر کا ایک جزوی مجموعہ ہے جو ٹرانسکرپٹومز تیار کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے، اور سائنسی ادب میں بھی اس کا حوالہ دیا گیا ہے۔ سیکومین این جی این ایس او اے پی ڈینوو-ٹرانس ایس او اے پی ڈینوو-ٹرانس ایک ڈی نووو ٹرانسکرپٹوم اسمبلر ہے جو ایس او اے پی ڈینوو 2 فریم ورک سے وراثت میں ملا ہے، جسے متبادل اسپلیسنگ اور مختلف اظہار کی سطح کے ساتھ ٹرانسکرپٹوم کو جمع کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ اسمبلر ایس او اے پی ڈینووو 2 کے مقابلے میں مکمل لمبائی کے نقل سیٹ کی تعمیر کا ایک زیادہ جامع طریقہ فراہم کرتا ہے۔ مخمل/اوسیس مخمل الگورتھم نقل کو جمع کرنے کے لیے ڈی بروجن گراف کا استعمال کرتا ہے۔ تخروپن میں، مخمل پروکیریوٹک ڈیٹا اور ممالیہ بیکٹیریل مصنوعی کروموسوم (بی اے سی) میں 3-کے بی این 50 کا استعمال کرتے ہوئے 50-کے بی این 50 لمبائی تک کانٹیگ تیار کر سکتا ہے۔ یہ ابتدائی نقل اوسیس میں منتقل کیے جاتے ہیں، جو نقل آئسوفارم بنانے کے لیے جوڑی بند اینڈ ریڈ اور لانگ ریڈ معلومات کا استعمال کرتے ہیں۔ ٹرانس-اے بی وائی ایس ایس اے بی وائی ایس ایس ایک متوازی، جوڑی دار اختتامی ترتیب اسمبلر ہے۔ ٹرانس-اے بی وائی ایس ایس (اسمبلی بائی شارٹ سیکوینسز) ایک سافٹ ویئر پائپ لائن ہے جو پائیتھن اور پرل میں لکھی گئی ہے تاکہ اے بی وائی ایس ایس سے جڑے ٹرانسکرپٹوم کونٹیگس کا تجزیہ کیا جا سکے۔ اس پائپ لائن کا اطلاق k اقدار کی ایک وسیع رینج میں پیدا ہونے والی اسمبلیوں پر کیا جا سکتا ہے۔ یہ سب سے پہلے ڈیٹا سیٹ کو نان ریڈینڈینٹ کونٹیگز کے چھوٹے سیٹوں میں کم کر دیتا ہے، اور اسپلیسنگ ایونٹس کی نشاندہی کرتا ہے جن میں ایکسن سکپنگ، نوول ایکسن، برقرار رکھے ہوئے انٹرن، نوول انٹرن، اور متبادل اسپلیسنگ شامل ہیں۔ ٹرانس-اے بی وائی ایس ایس الگورتھم جین کے اظہار کی سطح کا اندازہ لگانے، ممکنہ پولیڈینایلیشن سائٹس کے ساتھ ساتھ امیدوار جین فیوژن کے واقعات کی نشاندہی کرنے کے قابل بھی ہیں۔ تثلیث تثلیث سب سے پہلے ترتیب کے اعداد و شمار کو متعدد ڈی بروجن گرافوں میں تقسیم کرتا ہے، جن میں سے ہر ایک ایک جین یا لوکس پر نقل کی مختلف حالتوں کی نمائندگی کرتا ہے۔ اس کے بعد یہ مکمل لمبائی کے اسپلیسنگ آئسوفارم کو نکالتا ہے اور ہر گراف سے متوازی جینوں سے حاصل کردہ نقل کو الگ کرتا ہے۔ تثلیث تین آزاد سافٹ ویئر ماڈیولز پر مشتمل ہے، جو نقل تیار کرنے کے لیے ترتیب وار استعمال ہوتے ہیں: انچ ورم آر این اے-سیق ڈیٹا کو نقل کے ترتیب میں جمع کرتا ہے، اکثر ایک غالب آئسوفارم کے لیے مکمل لمبائی کی نقل تیار کرتا ہے، لیکن پھر متبادل طور پر اسپلیسڈ نقل کے صرف منفرد حصوں کی اطلاع دیتا ہے۔ کرائسلس انچ ورم کونٹیگس کو کلسٹر کرتا ہے اور ہر کلسٹر کے لیے مکمل ڈی بروجن گراف بناتا ہے۔ ہر کلسٹر کسی دیئے گئے جین کے لیے مکمل نقل کی پیچیدگی کی نمائندگی کرتا ہے (یا ایک خاندان یا جینوں کا مجموعہ جو ایک محفوظ ترتیب کا اشتراک کرتا ہے)۔ کرائسلس پھر ان الگ الگ گرافوں کے درمیان مکمل ریڈ سیٹ کو تقسیم کرتا ہے۔ تتلی پھر انفرادی گرافوں کو متوازی طور پر پروسیس کرتی ہے، گراف کے اندر پڑھنے کے راستوں کا سراغ لگاتی ہے، بالآخر متبادل طور پر اسپلیسڈ آئسوفارم کے لیے مکمل لمبائی کی نقل کی اطلاع دیتی ہے، اور نقل کو الگ کرتی ہے جو متوازی جینوں سے مطابقت رکھتی ہے۔ یہ بھی دیکھیں کہ ٹرانسکرپٹوم ٹرانسکرپٹومیکس ہیومن-ٹرانسکرپٹوم ڈیٹا بیس برائے متبادل اسپلیسنگ (ایچ-ڈی بی اے ایس) یونی جین فل-پیراسائٹس ایکسوم سیکوینسنگ حوالہ جات بائیو انفارمیٹکس سسٹمز بائیولوجی کمپیوٹیشنل بائیولوجی اومیکس