Vectors in gene therapy
جین تھراپی خلیوں میں ڈی این اے کی ترسیل کا استعمال کرتی ہے، جسے ذیل میں خلاصہ کردہ کئی طریقوں سے پورا کیا جا سکتا ہے۔ طریقوں کی دو بڑی کلاسیں وہ ہیں جو ریکومبیننٹ وائرس استعمال کرتے ہیں (بعض اوقات حیاتیاتی نینو پارٹیکلز یا وائرل ویکٹر بھی کہا جاتا ہے) اور وہ جو برہنہ ڈی این اے یا ڈی این اے کمپلیکس استعمال کرتے ہیں (غیر وائرل طریقے)۔ وائرس تمام وائرس اپنے میزبانوں سے جڑے ہوتے ہیں اور اپنے جینیاتی مواد کو میزبان خلیے میں اپنے نقل کے چکر کے حصے کے طور پر متعارف کراتے ہیں۔ یہ جینیاتی مواد بنیادی 'ہدایات' پر مشتمل ہے کہ ان وائرسوں کی مزید کاپیاں کیسے تیار کی جائیں، وائرس کی ضروریات کو پورا کرنے کے لیے جسم کی معمول کی پیداواری مشینری کو ہیک کرنا۔ میزبان خلیہ ان ہدایات پر عمل کرے گا اور وائرس کی اضافی کاپیاں تیار کرے گا، جس سے زیادہ سے زیادہ خلیات متاثر ہوں گے۔ کچھ قسم کے وائرس میزبان کے سائٹوپلازم میں اپنا جینوم داخل کرتے ہیں، لیکن حقیقت میں خلیے میں داخل نہیں ہوتے ہیں۔ دوسرے پروٹین کے مالیکیول کے بھیس میں سیل جھلی میں گھس جاتے ہیں اور سیل میں داخل ہوتے ہیں۔ وائرس کے انفیکشن کی دو اہم قسمیں ہیں: لائٹک اور لائسوجینک۔ اپنا ڈی این اے داخل کرنے کے فورا بعد، لائٹک سائیکل کے وائرس تیزی سے مزید وائرس پیدا کرتے ہیں، خلیے سے پھٹ جاتے ہیں اور مزید خلیوں کو متاثر کرتے ہیں۔ لائسوجینک وائرس اپنے ڈی این اے کو میزبان خلیے کے ڈی این اے میں ضم کرتے ہیں اور کسی محرک کا جواب دینے سے پہلے جسم میں کئی سالوں تک زندہ رہ سکتے ہیں۔ وائرس دوبارہ پیدا ہوتا ہے جیسا کہ خلیہ کرتا ہے اور جسمانی نقصان نہیں پہنچاتا جب تک کہ یہ متحرک نہ ہو جائے۔ محرک میزبان سے ڈی این اے خارج کرتا ہے اور اسے نئے وائرس بنانے کے لیے استعمال کرتا ہے۔ ریٹرو وائرس ریٹرو وائرس میں جینیاتی مواد آر این اے مالیکیولز کی شکل میں ہوتا ہے، جبکہ ان کے میزبانوں کا جینیاتی مواد ڈی این اے کی شکل میں ہوتا ہے۔ جب ایک ریٹرو وائرس کسی میزبان خلیے کو متاثر کرتا ہے، تو یہ اپنے آر این اے کو کچھ انزائموں، یعنی ریورس ٹرانسکرپٹیز اور انٹیگریز کے ساتھ مل کر خلیے میں داخل کرے گا۔ ریٹرو وائرس کے اس آر این اے مالیکیول کو میزبان خلیے کے جینیاتی مواد میں ضم ہونے سے پہلے اس کے آر این اے مالیکیول سے ڈی این اے کاپی تیار کرنا ضروری ہے۔ آر این اے مالیکیول سے ڈی این اے کاپی تیار کرنے کے عمل کو ریورس ٹرانسکرپشن کہا جاتا ہے۔ یہ وائرس میں موجود انزائموں میں سے ایک کے ذریعے انجام دیا جاتا ہے، جسے ریورس ٹرانسکرپٹیس کہا جاتا ہے۔ اس ڈی این اے کاپی کے پیدا ہونے اور میزبان خلیے کے مرکزے میں آزاد ہونے کے بعد، اسے میزبان خلیے کے جینوم میں شامل کیا جانا چاہیے۔ یعنی اسے خلیے (کروموسوم) کے بڑے ڈی این اے مالیکیولز میں ڈالنا ضروری ہے۔ یہ عمل وائرس میں موجود ایک اور انزائم کے ذریعے کیا جاتا ہے جسے انٹیگریز کہا جاتا ہے۔ اب جب کہ وائرس کا جینیاتی مواد داخل کر دیا گیا ہے، یہ کہا جا سکتا ہے کہ میزبان خلیے کو نئے جینوں پر مشتمل کرنے کے لیے تبدیل کر دیا گیا ہے۔ اگر یہ میزبان خلیہ بعد میں تقسیم ہوتا ہے، تو اس کی تمام نسلیں نئے جین پر مشتمل ہوں گی۔ بعض اوقات ریٹرو وائرس کے جین فوری طور پر اپنی معلومات کا اظہار نہیں کرتے۔ ریٹرو وائرس کا استعمال کرتے ہوئے جین تھراپی کے مسائل میں سے ایک یہ ہے کہ انٹیگریز انزائم میزبان کے جینوم میں کسی بھی صوابدیدی پوزیشن میں وائرس کے جینیاتی مواد کو داخل کر سکتا ہے۔ یہ تصادفی طور پر جینیاتی مواد کو کروموسوم میں داخل کرتا ہے۔ اگر جینیاتی مواد میزبان خلیے کے اصل جینوں میں سے کسی ایک کے بیچ میں ڈالا جاتا ہے، تو اس جین میں خلل پڑے گا (انسرشنل میوٹیجینیسیس)۔ اگر جین خلیوں کی تقسیم کو منظم کرنے والا ہوتا ہے، تو بے قابو خلیوں کی تقسیم (یعنی کینسر) ہو سکتی ہے۔ اس مسئلے کو حال ہی میں زنک فنگر نیوکلیز کا استعمال کرکے یا مخصوص کروموسومل سائٹس پر انضمام کی جگہ کو ہدایت کرنے کے لیے بیٹا گلوبن لوکس کنٹرول ریجن جیسے کچھ ترتیبات کو شامل کرکے حل کرنا شروع کیا گیا ہے۔ ایکس سے منسلک شدید مشترکہ امیونو ڈیفیشینسی (ایکس-ایس سی آئی ڈی) کے علاج کے لیے ریٹرو وائرل ویکٹرز کا استعمال کرتے ہوئے جین تھراپی ٹرائلز جین تھراپی کے اب تک کے سب سے کامیاب استعمال کی نمائندگی کرتے ہیں۔ فرانس اور برطانیہ میں بیس سے زیادہ مریضوں کا علاج کیا گیا ہے، جس میں مدافعتی نظام کی تشکیل نو کی اعلی شرح مشاہدہ کی گئی ہے۔ اسی طرح کے ٹرائلز کو امریکہ میں محدود یا روک دیا گیا تھا جب فرانسیسی ایکس-ایس سی آئی ڈی جین تھراپی ٹرائل میں زیر علاج مریضوں میں لیوکیمیا کی اطلاع ملی تھی۔ آج تک، فرانسیسی مقدمے کی سماعت میں چار بچوں اور برطانوی مقدمے کی سماعت میں ایک بچے میں ریٹرو وائرل ویکٹر کے ذریعے داخل شدہ میوٹیجینیسیس کے نتیجے میں لیوکیمیا پیدا ہوا ہے۔ ان میں سے ایک کے علاوہ تمام بچوں نے روایتی اینٹی لیوکیمیا علاج کا اچھا جواب دیا۔ ایڈینوسین ڈیمینیز (اے ڈی اے) انزائم (ایس سی آئی ڈی کی ایک شکل) کی کمی کی وجہ سے ایس سی آئی ڈی کے علاج کے لیے جین تھراپی ٹرائلز امریکہ، برطانیہ، آئرلینڈ، اٹلی اور جاپان میں نسبتا کامیابی کے ساتھ جاری ہیں۔ اڈینو وائرس وہ وائرس ہیں جو اپنے جینیاتی مواد کو ڈبل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کی شکل میں لے جاتے ہیں۔ وہ انسانوں میں سانس، آنتوں اور آنکھوں کے انفیکشن کا سبب بنتے ہیں (خاص طور پر عام زکام)۔ جب یہ وائرس میزبان خلیے کو متاثر کرتے ہیں، تو وہ اپنے ڈی این اے مالیکیول کو میزبان میں داخل کرتے ہیں۔ اڈینو وائرس کا جینیاتی مواد میزبان خلیے کے جینیاتی مواد میں شامل (عارضی) نہیں ہوتا ہے۔ ڈی این اے مالیکیول کو میزبان خلیے کے مرکزے میں آزاد چھوڑ دیا جاتا ہے، اور اس اضافی ڈی این اے مالیکیول کی ہدایات کسی بھی دوسرے جین کی طرح نقل کی جاتی ہیں۔ فرق صرف اتنا ہے کہ یہ اضافی جین اس وقت نقل نہیں ہوتے جب خلیے کی تقسیم ہونے والی ہوتی ہے لہذا اس خلیے کی اولاد میں اضافی جین نہیں ہوگا۔ نتیجے کے طور پر، اڈینو وائرس کے ساتھ علاج کے لیے سیل کی بڑھتی ہوئی آبادی میں دوبارہ انتظامیہ کی ضرورت ہوگی حالانکہ میزبان سیل کے جینوم میں انضمام کی عدم موجودگی سے ایس سی آئی ڈی ٹرائلز میں پائے جانے والے کینسر کی قسم کو روکا جانا چاہیے۔ اس ویکٹر سسٹم کو کینسر کے علاج کے لیے فروغ دیا گیا ہے اور درحقیقت کینسر کے علاج کے لیے لائسنس یافتہ پہلی جین تھراپی پروڈکٹ، جینڈیسین، ایک اڈینو وائرس ہے۔ جینڈیسین، ایک اڈینو وائرل پی 53 پر مبنی جین تھراپی کو 2003 میں چینی فوڈ اینڈ ڈرگ ریگولیٹرز نے سر اور گردن کے کینسر کے علاج کے لیے منظور کیا تھا۔ انٹروجن سے اسی طرح کے جین تھراپی کے نقطہ نظر ایڈویکسن کو 2008 میں یو ایس فوڈ اینڈ ڈرگ ایڈمنسٹریشن (ایف ڈی اے) نے مسترد کر دیا تھا۔ 1999 میں جین تھراپی ٹرائل میں حصہ لینے کے دوران جیسی جیلسنجر کی موت کے بعد اڈینو وائرس ویکٹرز کی حفاظت کے بارے میں خدشات اٹھائے گئے تھے۔ تب سے، اڈینو وائرس ویکٹروں کا استعمال کرتے ہوئے کام نے وائرس کے جینیاتی طور پر محدود ورژن پر توجہ مرکوز کی ہے۔ سائٹومیگالو وائرس (سی ایم وی) β-ہرپس وائرس ذیلی خاندان کا حصہ ہے جس میں گلابولو وائرس شامل ہیں۔ سی ایم وی انسانی سی ایم وی (ایچ سی ایم وی)، میورین سی ایم وی (ایم سی ایم وی) اور ریسس سی ایم وی (آر ایچ سی ایم وی) سمیت ممالیہ میزبانوں کی ایک قسم کے ساتھ مل کر تیار ہوا۔ سی ایم وی کی خصوصیت بڑے ڈی این اے جینوم ہوتے ہیں اور عام طور پر صحت مند میزبانوں میں غیر علامتی انفیکشن ہوتے ہیں۔ جین تھراپی ویکٹر کے طور پر سائٹومیگالو وائرس (سی ایم وی) کی پہلی تحقیقات 2000 میں شائع ہوئی تھی۔ ہیماٹوپوئیٹک پروجینیٹر خلیوں کے لیے سی ایم وی کے ٹراپزم اور اس کے بڑے جینوم (230 کے بی پی) نے ابتدائی طور پر محققین کو اپنی طرف متوجہ کیا۔ اس کے بعد سے سی ایم وی پر مبنی ویکسین ویکٹرز کو ٹی سیل ردعمل پیدا کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ حال ہی میں، ٹیلیومیرس اور فولیسٹیٹن پر مشتمل سی ایم وی کو صحت کی مدت کو بڑھانے کے ارادے سے ماؤس کے مطالعے میں نس کے ذریعے اور نس کے اندر پہنچایا گیا تھا۔ وائرل ویکٹرز کا لفافہ پروٹین سیڈو ٹائپنگ اوپر بیان کردہ وائرل ویکٹرز میں قدرتی میزبان خلیوں کی آبادی ہوتی ہے جسے وہ سب سے زیادہ مؤثر طریقے سے متاثر کرتے ہیں۔ ریٹرو وائرسوں میں قدرتی میزبان خلیوں کی حدود محدود ہوتی ہیں، اور اگرچہ اڈینو وائرس اور اڈینو سے وابستہ وائرس خلیوں کی نسبتا وسیع رینج کو مؤثر طریقے سے متاثر کرنے کے قابل ہوتے ہیں، لیکن کچھ خلیوں کی اقسام ان وائرسوں کے انفیکشن کے خلاف بھی مزاحم ہوتی ہیں۔ کسی حساس خلیے سے لگاؤ اور اس میں داخل ہونے کی ثالثی وائرس کی سطح پر موجود پروٹین لفافے کے ذریعے کی جاتی ہے۔ ریٹرو وائرس اور اڈینو سے وابستہ وائرس کی جھلی میں ایک ہی پروٹین کی کوٹنگ ہوتی ہے، جبکہ اڈینو وائرس ایک لفافے والے پروٹین اور ریشے دونوں کے ساتھ لیپت ہوتے ہیں جو وائرس کی سطح سے دور تک پھیلے ہوتے ہیں۔ ان میں سے ہر ایک وائرس پر موجود لفافے والے پروٹین سیل کی سطح کے مالیکیولز جیسے ہیپرین سلفیٹ سے جڑے ہوتے ہیں، جو انہیں ممکنہ میزبان کی سطح پر مقامی بناتا ہے، ساتھ ہی مخصوص پروٹین رسیپٹر کے ساتھ جو یا تو وائرل پروٹین میں داخلے کو فروغ دینے والی ساختی تبدیلیوں کو جنم دیتا ہے، یا وائرس کو اینڈوسومز میں مقامی بناتا ہے جس میں لومین کی تیزابیت وائرل کوٹ کے اس ری فولڈنگ کو جنم دیتی ہے۔ دونوں صورتوں میں، ممکنہ میزبان خلیوں میں داخلے کے لیے وائرس کی سطح پر موجود پروٹین اور خلیے کی سطح پر موجود پروٹین کے درمیان سازگار تعامل کی ضرورت ہوتی ہے۔ جین تھراپی کے مقاصد کے لیے، کوئی بھی جین تھراپی ویکٹر کے ذریعے ٹرانسڈکشن کے لیے حساس خلیوں کی حد کو محدود یا بڑھانا چاہتا ہے۔ اس مقصد کے لیے، بہت سے ویکٹر تیار کیے گئے ہیں جن میں اینڈوجینس وائرل لفافے کے پروٹین کو یا تو دوسرے وائرس کے لفافے کے پروٹین سے، یا چیمیرک پروٹین سے تبدیل کیا گیا ہے۔ اس طرح کے چیمیرا وائرل پروٹین کے ان حصوں پر مشتمل ہوتے ہیں جو وائریون میں شامل کرنے کے لیے ضروری ہوتے ہیں اور ساتھ ہی مخصوص میزبان سیل پروٹین کے ساتھ تعامل کرنے کے لیے ترتیبات پر مشتمل ہوتے ہیں۔ وہ وائرس جن میں لفافے کے پروٹین کی جگہ لے لی گئی ہے جیسا کہ بیان کیا گیا ہے انہیں فرضی قسم کے وائرس کہا جاتا ہے۔ مثال کے طور پر، جین تھراپی ٹرائلز میں استعمال کے لیے سب سے مشہور ریٹرو وائرل ویکٹر لینٹیوائرس سیمین امیونو ڈیفیشینسی وائرس رہا ہے جو ویسیکیولر اسٹومائٹس وائرس سے لفافے پروٹین، جی-پروٹین کے ساتھ لیپت ہوتا ہے۔ اس ویکٹر کو وی ایس وی جی-سیوڈو ٹائپڈ لینٹیوائرس کہا جاتا ہے، اور یہ خلیوں کے تقریبا عالمگیر سیٹ کو متاثر کرتا ہے۔ یہ ٹراپزم وی ایس وی جی پروٹین کی خصوصیت ہے جس کے ساتھ یہ ویکٹر لیپت ہوتا ہے۔ وائرل ویکٹروں کے ٹراپزم کو ایک یا چند میزبان خلیوں کی آبادی تک محدود کرنے کی بہت سی کوششیں کی گئی ہیں۔ یہ پیش رفت نسبتا کم مقدار میں ویکٹر کی نظامی انتظامیہ کی اجازت دے گی۔ آف ٹارگیٹ سیل ترمیم کی صلاحیت محدود ہوگی، اور طبی برادری کے بہت سے خدشات کو دور کیا جائے گا۔ ٹراپزم کو محدود کرنے کی زیادہ تر کوششوں میں اینٹی باڈی کے ٹکڑوں والے چیمیرک لفافے والے پروٹین کا استعمال کیا گیا ہے۔ یہ ویکٹر "میجک بلٹ" جین تھراپی کی ترقی کے لیے بہت بڑا وعدہ ظاہر کرتے ہیں۔ نقل کے قابل ویکٹر ایک نقل کے قابل ویکٹر جسے ONYX-015 کہا جاتا ہے ٹیومر کے خلیوں کی نقل میں استعمال ہوتا ہے۔ یہ پایا گیا کہ ای 1 بی-55 کے ڈی وائرل پروٹین کی عدم موجودگی میں، اڈینو وائرس متاثرہ، پی 53 (+) خلیوں کے بہت تیزی سے اپوپٹوسس کا سبب بنتا ہے، اور اس کے نتیجے میں وائرس کی نسل میں ڈرامائی طور پر کمی واقع ہوتی ہے اور اس کے بعد کوئی پھیلاؤ نہیں ہوتا ہے۔ اپوپٹوسس بنیادی طور پر ای آئی اے کی پی 300 کو غیر فعال کرنے کی صلاحیت کا نتیجہ تھا۔ پی 53 (-) خلیوں میں، ای 1 بی 55 کے ڈی کو حذف کرنے کا اپوپٹوسس کے لحاظ سے کوئی نتیجہ نہیں ہے، اور وائرل نقل جنگلی قسم کے وائرس سے ملتی جلتی ہے، جس کے نتیجے میں خلیوں کا بڑے پیمانے پر قتل ہوتا ہے۔ ایک نقل-عیب دار ویکٹر کچھ ضروری جینوں کو حذف کر دیتا ہے۔ یہ حذف شدہ جین اب بھی جسم میں ضروری ہیں لہذا ان کی جگہ یا تو مددگار وائرس یا ڈی این اے مالیکیول لے لیتے ہیں۔ سی آئی ایس اور ٹرانس ایکٹنگ عناصر نقل-عیب دار ویکٹر ہمیشہ "ٹرانسفر کنسٹرکٹ" پر مشتمل ہوتے ہیں۔ منتقلی کی تعمیر جین کو منتقل کرنے یا "ٹرانسجین" لے جاتی ہے۔ منتقلی کی تعمیر میں وہ ترتیبات بھی ہوتے ہیں جو وائرل جینوم کے عمومی کام کے لیے ضروری ہیں: پیکیجنگ ترتیب، نقل کے لیے دہرایا جاتا ہے اور ضرورت پڑنے پر، ریورس ٹرانسکرپشن کا پرائمنگ۔ یہ سی آئی ایس اداکاری کرنے والے عناصر ہیں، کیونکہ ان کا وائرل جینوم اور دلچسپی کے جین کے طور پر ڈی این اے کے ایک ہی ٹکڑے پر ہونا ضروری ہے۔ ٹرانس ایکٹنگ عناصر وائرل عناصر ہیں، جنہیں مختلف ڈی این اے مالیکیول پر انکوڈ کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، وائرل ساختی پروٹین کا اظہار وائرل جینوم سے مختلف جینیاتی عنصر سے کیا جا سکتا ہے۔ ہرپس سمپلیکس وائرس ہرپس سمپلیکس وائرس ایک انسانی نیوروٹروپک وائرس ہے۔ اس کی زیادہ تر جانچ اعصابی نظام میں جین کی منتقلی کے لیے کی جاتی ہے۔ جنگلی قسم کا ایچ ایس وی-1 وائرس نیوران کو متاثر کرنے اور میزبان مدافعتی ردعمل سے بچنے کے قابل ہے، لیکن پھر بھی دوبارہ فعال ہو سکتا ہے اور وائرل نقل کا لائٹک سائیکل پیدا کر سکتا ہے۔ لہذا، ایچ ایس وی-1 کے اتپریورتن تناؤ کا استعمال کرنا عام ہے جو نقل کرنے کی صلاحیت میں کمی رکھتے ہیں۔ اگرچہ پوشیدہ وائرس نقل شدہ طور پر ظاہر نہیں ہوتا ہے، لیکن اس میں نیوران کے مخصوص پروموٹر ہوتے ہیں جو عام طور پر کام کرتے رہ سکتے ہیں۔ ایچ ایس وی-1 کے اینٹی باڈیز انسانوں میں عام ہیں، تاہم ہرپس انفیکشن کی وجہ سے پیچیدگیاں کچھ کم ہی ہوتی ہیں۔ انسیفلائٹس کے غیر معمولی معاملات کے لیے احتیاط برتی جانی چاہیے اور یہ ایچ ایس وی-2 کو وائرل ویکٹر کے طور پر استعمال کرنے کے لیے کچھ جواز فراہم کرتا ہے کیونکہ اس میں عام طور پر جسم کے یوروجینٹل علاقے میں اعصابی خلیوں کے لیے ٹراپزم ہوتا ہے اور پھر دماغ میں شدید بیماری کے میزبان کو بچا سکتا ہے۔ غیر وائرل طریقے وائرل طریقوں کے مقابلے میں کچھ فوائد پیش کرتے ہیں، جس میں سادہ بڑے پیمانے پر پیداوار اور کم میزبان امیونوجینسیٹی صرف دو ہیں۔ اس سے پہلے، جین کی منتقلی اور اظہار کی کم سطحوں نے غیر وائرل طریقوں کو نقصان پہنچایا ؛ تاہم، ویکٹر ٹیکنالوجی میں حالیہ پیشرفتوں سے وائرس کی طرح منتقلی کی استعداد کے ساتھ مالیکیولز اور تکنیک حاصل ہوئی ہیں۔ برہنہ ڈی این اے کا انجکشن یہ غیر وائرل ٹرانسفیکشن کا سب سے آسان طریقہ ہے۔ ننگی ڈی این اے پلازمیڈ کے انٹرامسکلر انجیکشن سے کیے گئے کلینیکل ٹرائلز کچھ کامیابی کے ساتھ ہوئے ہیں ؛ تاہم، ٹرانسفیکشن کے دیگر طریقوں کے مقابلے میں اظہار بہت کم رہا ہے۔ پلازمیڈز کے ساتھ ٹرائلز کے علاوہ، برہنہ پی سی آر پروڈکٹ کے ساتھ بھی ٹرائلز ہوئے ہیں، جنہیں اسی طرح یا اس سے زیادہ کامیابی ملی ہے۔ ننگی ڈی این اے کا سیلولر اپٹیک عام طور پر غیر موثر ہوتا ہے۔ برہنہ ڈی این اے لینے کی کارکردگی کو بہتر بنانے پر توجہ مرکوز کرنے والی تحقیقی کوششوں سے کئی نئے طریقے برآمد ہوئے ہیں، جیسے الیکٹروپوریشن، سونوپوریشن، اور "جین گن" کا استعمال، جو ہائی پریشر گیس کا استعمال کرتے ہوئے ڈی این اے لیپت سونے کے ذرات کو خلیے میں چلاتا ہے۔ ترسیل کو بڑھانے کے جسمانی طریقے الیکٹرو کارپوریشن ایک ایسا طریقہ ہے جو سیل جھلی میں ڈی این اے کو لے جانے کے لیے ہائی وولٹیج کی مختصر دالوں کا استعمال کرتا ہے۔ خیال کیا جاتا ہے کہ یہ جھٹکا خلیے کی جھلی میں سوراخوں کی عارضی تشکیل کا سبب بنتا ہے، جس سے ڈی این اے کے مالیکیول گزرتے ہیں۔ الیکٹرو کارپوریشن عام طور پر موثر ہے اور خلیوں کی اقسام کی ایک وسیع رینج میں کام کرتا ہے۔ تاہم، الیکٹروپوریشن کے بعد سیل کی موت کی اعلی شرح نے اس کے استعمال کو محدود کر دیا ہے، بشمول طبی ایپلی کیشنز۔ حال ہی میں الیکٹروپوریشن کا ایک نیا طریقہ، جسے الیکٹران ایولانچ ٹرانسفیکشن کہا جاتا ہے، جین تھراپی کے تجربات میں استعمال کیا گیا ہے۔ ہائی وولٹیج پلازما ڈسچارج کا استعمال کرتے ہوئے، ڈی این اے کو بہت مختصر (مائیکرو سیکنڈ) دالوں کے بعد مؤثر طریقے سے پہنچایا گیا۔ الیکٹرو کارپوریشن کے مقابلے میں، اس تکنیک کے نتیجے میں کارکردگی میں بہت اضافہ ہوا اور سیلولر کو کم نقصان پہنچا۔ ذرہ بمباری، یا جین گن کا استعمال، ڈی این اے کی منتقلی کا ایک اور جسمانی طریقہ ہے۔ اس تکنیک میں، ڈی این اے کو سونے کے ذرات پر لیپت کیا جاتا ہے اور ایک ایسے آلے میں لوڈ کیا جاتا ہے جو خلیوں میں ڈی این اے کے دخول کو حاصل کرنے کے لیے ایک قوت پیدا کرتا ہے، اور سونے کو "اسٹاپنگ" ڈسک پر چھوڑ دیتا ہے۔ سونوپوریشن خلیوں میں ڈی این اے پہنچانے کے لیے الٹراسونک تعدد کا استعمال کرتا ہے۔ خیال کیا جاتا ہے کہ صوتی کھوکھلی کے عمل سے خلیے کی جھلی میں خلل پڑتا ہے اور ڈی این اے کو خلیوں میں منتقل ہونے کی اجازت ملتی ہے۔ میگنیٹوفیکشن نامی طریقہ کار میں، ڈی این اے مقناطیسی ذرات کے لیے پیچیدہ ہوتا ہے، اور ڈی این اے کمپلیکس کو سیل مونو لیئر کے ساتھ رابطے میں لانے کے لیے ٹشو کلچر ڈش کے نیچے ایک مقناطیس رکھا جاتا ہے۔ ہائیڈروڈائنامک ڈیلیوری میں محلول کی زیادہ مقدار کا تیز رفتار انجکشن شامل ہوتا ہے (جیسے کمتر وینا کیوا، پت کی نالی، یا دم کی رگ میں)۔ اس محلول میں ایسے مالیکیول ہوتے ہیں جنہیں خلیوں میں داخل کیا جانا ہے، جیسے ڈی این اے پلازمیڈز یا ایس آئی آر این اے، اور خلیوں میں ان مالیکیولز کی منتقلی میں انجکشن شدہ محلول کی زیادہ مقدار کی وجہ سے بلند ہائیڈروسٹیٹک دباؤ سے مدد ملتی ہے۔ ترسیل کو بڑھانے کے کیمیائی طریقے اولیگونیوکلیوٹائڈز جین تھراپی میں مصنوعی اولیگونیوکلیوٹائڈز کا استعمال بیماری کے عمل میں شامل جینوں کو غیر فعال کرنا ہے۔ کئی طریقے ہیں جن کے ذریعے یہ حاصل کیا جاتا ہے۔ ایک حکمت عملی ناقص جین کی نقل و حمل میں خلل ڈالنے کے لیے ہدف جین کے لیے مخصوص اینٹی سینس کا استعمال کرتی ہے۔ دوسرا آر این اے کے چھوٹے مالیکیولز کا استعمال کرتا ہے جسے ایس آئی آر این اے کہا جاتا ہے تاکہ خلیے کو ناقص جین کے ایم آر این اے ٹرانسکرپٹ میں مخصوص منفرد ترتیبات کو توڑنے کا اشارہ کیا جا سکے، جس سے ناقص ایم آر این اے کے ترجمہ میں خلل پڑتا ہے، اور اس وجہ سے جین کا اظہار ہوتا ہے۔ ایک مزید حکمت عملی ڈبل اسٹرینڈڈ اولیگوڈیوکسینوکلیوٹائڈز کو ٹرانسکرپشن عوامل کے لیے ڈیکائے کے طور پر استعمال کرتی ہے جو ٹارگٹ جین کی ٹرانسکرپشن کو چالو کرنے کے لیے درکار ہوتے ہیں۔ نقل کے عوامل ناقص جین کے پروموٹر کے بجائے ڈیکوئز سے جڑے ہوتے ہیں، جس سے ٹارگٹ جین کی نقل کم ہو جاتی ہے، جس سے اظہار کم ہوتا ہے۔ مزید برآں، سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے اولیگونیوکلیوٹائڈز کو میوٹینٹ جین کے اندر سنگل بیس تبدیلی کی ہدایت کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ اولیگونیوکلیوٹائڈ کو مرکزی بیس، ٹارگٹ بیس کے استثناء کے ساتھ ہدف جین کی تکمیل کے ساتھ اینیل کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے، جو مرمت کے لیے ٹیمپلیٹ بیس کے طور پر کام کرتا ہے۔ اس تکنیک کو اولیگونیوکلیوٹائڈ ثالثی جین کی مرمت، ٹارگٹڈ جین کی مرمت، یا ٹارگٹڈ نیوکلیوٹائڈ تبدیلی کہا جاتا ہے۔ لیپوپلیکس خلیے میں نئے ڈی این اے کی ترسیل کو بہتر بنانے کے لیے، ڈی این اے کو نقصان سے محفوظ اور مثبت طور پر چارج ہونا چاہیے۔ ابتدائی طور پر، مصنوعی ویکٹروں کے لیے لیپوپلیکس کی تعمیر کے لیے آئنک اور غیر جانبدار لپڈ استعمال کیے جاتے تھے۔ تاہم، ان حقائق کے باوجود کہ ان کے ساتھ بہت کم زہریلا تعلق ہے، کہ وہ جسمانی سیالوں کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں اور یہ کہ انہیں ٹشو مخصوص ہونے کے لیے ڈھالنے کا امکان تھا۔ وہ پیچیدہ ہیں اور پیدا کرنے میں وقت لگتا ہے لہذا توجہ کیٹیانک ورژن کی طرف موڑ دی گئی۔ کیٹیانک لپڈ، ان کے مثبت چارج کی وجہ سے، سب سے پہلے منفی طور پر چارج شدہ ڈی این اے مالیکیولز کو گاڑھا کرنے کے لیے استعمال کیے جاتے تھے تاکہ ڈی این اے کو لیپوسومز میں جکڑنے میں آسانی ہو۔ بعد میں یہ پایا گیا کہ کیٹیانک لپڈ کے استعمال سے لیپوپلیکس کے استحکام میں نمایاں اضافہ ہوا۔ نیز ان کے چارج کے نتیجے میں، کیٹیانک لیپوسومز سیل جھلی کے ساتھ تعامل کرتے ہیں، اینڈوسیٹوسس کو بڑے پیمانے پر اس بڑے راستے کے طور پر مانا جاتا تھا جس کے ذریعے خلیات لیپوپلیکس کو اٹھاتے ہیں۔ اینڈوسومز اینڈوسیٹوسس کے نتیجے کے طور پر تشکیل پاتے ہیں، تاہم، اگر اینڈوسوم کی جھلی کو توڑ کر جین کو سائٹوپلازم میں نہیں چھوڑا جا سکتا ہے، تو انہیں لائسوسومز میں بھیجا جائے گا جہاں تمام ڈی این اے اپنے افعال کو حاصل کرنے سے پہلے ہی تباہ ہو جائیں گے۔ یہ بھی پایا گیا کہ اگرچہ کیٹیانک لپڈ خود ڈی این اے کو لیپوسومز میں گاڑھا اور بند کر سکتے ہیں، لیکن "اینڈوسومل فرار" کے لحاظ سے صلاحیت کی کمی کی وجہ سے ٹرانسفیکشن کی کارکردگی بہت کم ہے۔ تاہم، جب مددگار لپڈ (عام طور پر الیکٹرونیوٹرل لپڈ، جیسے ڈی او پی ای) کو لیپوپلیکس بنانے کے لیے شامل کیا گیا تو ٹرانسفیکشن کی بہت زیادہ کارکردگی کا مشاہدہ کیا گیا۔ بعد میں، یہ دریافت کیا گیا کہ بعض لپڈ میں اینڈوسومل جھلی کو غیر مستحکم کرنے کی صلاحیت ہوتی ہے تاکہ اینڈوسوم سے ڈی این اے کے فرار کو آسان بنایا جا سکے، اس لیے ان لپڈ کو فیوزوجینک لپڈ کہا جاتا ہے۔ اگرچہ کیٹیانک لیپوسومز کو جین ڈیلیوری ویکٹرز کے متبادل کے طور پر بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے، لیکن کیٹیانک لپڈز کی خوراک پر منحصر زہریلا بھی مشاہدہ کیا گیا جو ان کے علاج کے استعمال کو محدود کر سکتا ہے۔ لیپوپلیکس کا سب سے عام استعمال کینسر کے خلیوں میں جین کی منتقلی میں ہوا ہے، جہاں فراہم کردہ جینوں نے سیل میں ٹیومر سپریسر کنٹرول جین کو چالو کیا ہے اور آنکوجینز کی سرگرمی کو کم کیا ہے۔ حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ لیپوپلیکس سانس کے ایپیٹیلیل خلیوں کو منتقل کرنے میں مفید ثابت ہوتے ہیں۔ پولیمرسومز لیپوسومز (لپڈ بائی لیئر والے ویسیکلز) کے مصنوعی ورژن ہیں، جو ایمفیفیلک بلاک کوپولیمرز سے بنے ہوتے ہیں۔ وہ یا تو ہائیڈروفیلک یا ہائیڈروفوبک مواد کو سمیٹ سکتے ہیں اور ڈی این اے، پروٹین، یا منشیات جیسے کارگو کو خلیوں تک پہنچانے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ لیپوسومز کے مقابلے میں پولیمرسومز کے فوائد میں زیادہ استحکام، میکانی طاقت، خون کی گردش کا وقت، اور ذخیرہ کرنے کی صلاحیت شامل ہیں۔ پولی پلیکس ڈی این اے والے پولیمر کے کمپلیکس کو پولی پلیکس کہتے ہیں۔ زیادہ تر پولیپلیکس کیشنک پولیمر پر مشتمل ہوتے ہیں اور ان کی بناوٹ آئنک تعاملات کے ذریعے سیلف اسمبلی پر مبنی ہوتی ہے۔ پولیپلیکس اور لیپوپلیکس کے عمل کے طریقوں کے درمیان ایک اہم فرق یہ ہے کہ پولیپلیکس اپنے ڈی این اے کے بوجھ کو براہ راست سائٹوپلازم میں نہیں چھوڑ سکتے۔ نتیجے کے طور پر، غیر فعال اڈینو وائرس جیسے اینڈوسوم-لیٹک ایجنٹوں کے ساتھ مشترکہ منتقلی کی ضرورت تھی تاکہ ذرہ جذب کے دوران بنے اینڈوسیٹک ویسیکل سے نینو پارٹیکل کے فرار کو آسان بنایا جا سکے۔ تاہم، ان میکانزم کی بہتر تفہیم جس کے ذریعے ڈی این اے اینڈولیسوسومل راستے سے بچ سکتا ہے، یعنی۔ پروٹون سپنج اثر نے پولیمر کی ترکیب کی نئی حکمت عملیوں کو متحرک کیا ہے جیسے کہ پولیمر ریڑھ کی ہڈی میں پروٹون ایبل باقیات کو شامل کرنا اور پولیکیشن پر مبنی نظاموں پر تحقیق کو زندہ کیا ہے۔ ان کی کم زہریلا پن، زیادہ لوڈنگ کی صلاحیت، اور من گھڑت بنانے میں آسانی کی وجہ سے، پولیکیشنک نینو کیریئرز اپنے حریفوں جیسے وائرل ویکٹرز کے مقابلے میں بہت اچھا مظاہرہ کرتے ہیں جو اعلی امیونوجینسیٹی اور ممکنہ کارسنوجینسیٹی ظاہر کرتے ہیں، اور لپڈ پر مبنی ویکٹر جو خوراک پر انحصار زہریلا ہونے کا سبب بنتے ہیں۔ پولی تھیلینیمائن اور چیٹوسن پولیمرک کیریئرز میں سے ہیں جن کا جین ڈیلیوری تھیراپیوٹکس کی ترقی کے لیے بڑے پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے۔ دیگر پولیکیشنک کیریئرز جیسے پولی (بیٹا امینو ایسٹر) اور پولی فاسفورامیڈیٹ کو ممکنہ جین کیریئرز کی لائبریری میں شامل کیا جا رہا ہے۔ پولیمرز اور کوپولیمرز کی مختلف اقسام کے علاوہ، ان پولیمرک نینو کیریئرز کے سائز، شکل، سطح کی کیمسٹری کو کنٹرول کرنے میں آسانی انہیں ہدف بنانے کی صلاحیت اور بہتر پارگمیتا اور برقرار رکھنے کے اثر سے فائدہ اٹھانے میں آسانی فراہم کرتی ہے۔ ڈینڈریمر ایک انتہائی شاخ دار میکرو مالیکیول ہے جس کی شکل گول ہوتی ہے۔ ذرہ کی سطح کو کئی طریقوں سے فعال کیا جا سکتا ہے اور اس کے نتیجے میں بننے والی ساخت کی بہت سی خصوصیات کا تعین اس کی سطح سے ہوتا ہے۔ خاص طور پر ایک کیٹیانک ڈینڈریمر کی تعمیر ممکن ہے، یعنی۔ ایک مثبت سطح چارج کے ساتھ۔ جب ڈی این اے یا آر این اے جیسے جینیاتی مواد کی موجودگی میں، چارج کی تکمیل نیوکلک ایسڈ کی کیٹیانک ڈینڈریمر کے ساتھ عارضی وابستگی کا باعث بنتی ہے۔ اپنی منزل تک پہنچنے پر ڈینڈریمر-نیوکلک ایسڈ کمپلیکس کو پھر اینڈوسیٹوسس کے ذریعے خلیے میں لے جایا جاتا ہے۔ حالیہ برسوں میں ٹرانسفیکشن ایجنٹوں کے لیے معیار کیشنک لپڈ رہا ہے۔ ان مسابقتی ریجینٹس کی حدود میں شامل ہونے کی اطلاع دی گئی ہے: کچھ خلیوں کی اقسام کو منتقل کرنے کی صلاحیت کی کمی، مضبوط فعال ہدف کی صلاحیتوں کی کمی، جانوروں کے نمونوں کے ساتھ مطابقت نہیں، اور زہریلا پن۔ ڈینڈریمر مضبوط کوولینٹ تعمیر اور مالیکیول ڈھانچے پر انتہائی کنٹرول پیش کرتے ہیں، اور اس وجہ سے سائز۔ یہ سب مل کر موجودہ طریقوں کے مقابلے میں زبردست فوائد فراہم کرتے ہیں۔ ڈینڈریمر تیار کرنا تاریخی طور پر ایک سست اور مہنگا عمل رہا ہے جس میں متعدد سست رد عمل شامل ہیں، ایک رکاوٹ جس نے ان کی تجارتی ترقی کو شدید طور پر روک دیا۔ مشی گن میں قائم کمپنی ڈینڈریٹک نینو ٹیکنالوجیز نے حرکی طور پر چلنے والی کیمسٹری کا استعمال کرتے ہوئے ڈینڈریمر تیار کرنے کا ایک طریقہ دریافت کیا، ایک ایسا عمل جس نے نہ صرف لاگت کو تین کی شدت سے کم کیا بلکہ رد عمل کے وقت کو بھی ایک ماہ سے کم کر کے کئی دن کر دیا۔ یہ نئے "پریوسٹار" ڈینڈریمرز خاص طور پر ڈی این اے یا آر این اے پے لوڈ لے جانے کے لیے بنائے جا سکتے ہیں جو خلیوں کو بہت کم یا بغیر کسی زہریلے کے اعلی کارکردگی سے منتقل کرتے ہیں۔ غیر نامیاتی نینو پارٹیکلز غیر نامیاتی نینو پارٹیکلز، جیسے سونا، سلیکا، آئرن آکسائیڈ (مثلا۔ میگنیٹوفیکشن) اور کیلشیم فاسفیٹس کو جین کی فراہمی کے قابل دکھایا گیا ہے۔ غیر نامیاتی ویکٹر کے کچھ فوائد ان کے ذخیرہ کرنے کے استحکام، کم مینوفیکچرنگ لاگت اور اکثر وقت، کم امیونوجینسیٹی، اور مائکروبیل حملے کے خلاف مزاحمت میں ہیں۔ 100 این ایم سے کم نینو سائز والے مواد کو ڈی این اے یا آر این اے کو مؤثر طریقے سے پھنسانے کے لیے دکھایا گیا ہے اور یہ اسے اینڈوسوم سے بغیر انحطاط کے فرار ہونے دیتا ہے۔ غیر نامیاتی کو بھی ان کی بڑھتی ہوئی کثافت اور کلچر ڈش کی بنیاد پر ترجیحی مقام کی وجہ سے منسلک سیل لائنوں کے لیے بہتر ان وٹرو ٹرانسفیکشن کی نمائش کے لیے دکھایا گیا ہے۔ کوانٹم ڈاٹس کا بھی کامیابی سے استعمال کیا گیا ہے اور یہ ایک مستحکم فلوروسینس مارکر کے ساتھ جین تھراپی کے جوڑے کی اجازت دیتا ہے۔ انجینیئرڈ نامیاتی نینو پارٹیکلز بھی تیار کیے جا رہے ہیں، جنہیں جینز اور علاج معالجین کی مشترکہ فراہمی کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ سیل میں گھسنے والے پیپٹائڈز سیل میں گھسنے والے پیپٹائڈز (سی پی پیز)، جنہیں پیپٹائڈ ٹرانسڈکشن ڈومینز (پی ٹی ڈیز) بھی کہا جاتا ہے، مختصر پیپٹائڈز (<40 امینو ایسڈ) ہیں جو خلیوں کی جھلیوں سے مؤثر طریقے سے گزرتے ہیں جبکہ مختلف مالیکیولز سے ہم آہنگی یا غیر ہم آہنگی سے جڑے ہوتے ہیں، اس طرح ان مالیکیولز کو خلیوں میں داخل ہونے میں سہولت فراہم ہوتی ہے۔ خلیوں کا داخلہ بنیادی طور پر اینڈوسیٹوسس کے ذریعے ہوتا ہے لیکن داخلے کے دیگر طریقہ کار بھی موجود ہیں۔ سی پی پیز کے کارگو مالیکیولز کی مثالوں میں نیوکلک ایسڈ، لیپوسوم، اور کم مالیکیولر وزن کی دوائیں شامل ہیں۔ سی پی پی کارگو کو سی پی پی ترتیبات میں لوکلائزیشن کے سلسلے کو شامل کرکے مخصوص سیل آرگنیلز میں بھیجا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، نیوکلیئر لوکلائزیشن کے سلسلے عام طور پر سی پی پی کارگو کو نیوکلئس میں رہنمائی کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ مائٹوکونڈریا میں رہنمائی کے لیے، ایک مائٹوکونڈریل ٹارگیٹنگ سیکوینس استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ طریقہ پروٹوفیکشن میں استعمال ہوتا ہے (ایک ایسی تکنیک جو غیر ملکی مائٹوکونڈریل ڈی این اے کو خلیوں کے مائٹوکونڈریا میں داخل کرنے کی اجازت دیتی ہے)۔ ہائبرڈ طریقے جین کی منتقلی کے ہر طریقہ کار میں خامیاں ہونے کی وجہ سے، کچھ ہائبرڈ طریقے تیار کیے گئے ہیں جو دو یا زیادہ تکنیکوں کو یکجا کرتے ہیں۔ وائروسومز ایک مثال ہیں ؛ وہ لیپوسومز کو ایک غیر فعال ایچ آئی وی یا انفلوئنزا وائرس کے ساتھ جوڑتے ہیں۔ یہ دکھایا گیا ہے کہ سانس کے ایپیٹیلیل خلیوں میں صرف وائرل یا لیپوسومل طریقوں سے زیادہ موثر جین کی منتقلی ہوتی ہے۔ دوسرے طریقوں میں دوسرے وائرل ویکٹروں کو کیٹیانک لپڈ یا ہائبرڈائزنگ وائرس کے ساتھ ملانا شامل ہے۔ جینیٹک انجینئرنگ ٹرانسفارمیشن ٹرانسفیکشن کی جینوسوم (لیپوپلیکس) تکنیک بھی دیکھیں حوالہ جات اطلاقی جینیات بائیو ایتھکس بائیوٹیکنالوجی میڈیکل جینیات مالیکیولر بائیولوجی جین ڈیلیوری ابھرتی ہوئی ٹیکنالوجیز