Αr9 RNA
αr9 بیکٹیریل چھوٹے غیر کوڈنگ RNAs کا ایک خاندان ہے جس کے نمائندے α-پروٹوبیکٹیریا کے ایک وسیع گروپ میں ہائفو مائکروبیلز آرڈر سے ہیں۔ اس خاندان کا پہلا رکن (ایس ایم آر 9 سی) کروموسوم (سی) میں واقع سینورہیزوبیم میلیلوٹی 1021 لوکس میں پایا گیا تھا۔ مزید ہومیولوجی اور ساخت کے تحفظ کے تجزیے نے کئی نائٹروجن فکسنگ سمبائیوٹک ریزوبیا میں مکمل لمبائی والے ایس ایم آر 9 سی ہومیولوگس کی نشاندہی کی ہے۔ آر۔ لیگیومینوسارم bv.viciae، آر۔ لیگیومینوسارم bv۔ ٹرائیفولی، آر ایٹلی، اور کئی میسوریزوبیئم پرجاتیوں)، ایگروبیکٹیریم پرجاتیوں سے تعلق رکھنے والے پودوں کے پیتھوجینز میں (یعنی۔ اے۔ ٹیومیفیسینس، اے۔ وائٹس، اے۔ ریڈیوبیکٹر، اور ایگروبیکٹیریم ایچ 13) کے ساتھ ساتھ بروسیلا پرجاتیوں (بی۔ اوویس، بی۔ کینس، بی۔ ایبرٹس اور بی۔ مائکروٹس، اور بی۔ میلیٹینسیس کے کئی بائیوورز) کے وسیع میدان عمل میں۔ αr9C RNA انواع 144-158 nt لمبی ہیں (ٹیبل 1) اور سات محفوظ علاقوں پر مشتمل ایک اچھی طرح سے متعین مشترکہ ثانوی ڈھانچے کا اشتراک کرتی ہیں (شکل 1)۔ زیادہ تر αr9 نقل کو ٹرانس ایکٹنگ ایس آر این اے کے طور پر درج کیا جا سکتا ہے جس کا اظہار α-پروٹوبیکٹیریل جینومز (شکل 5) کے انٹرجینک علاقوں (آئی جی آر) کے اندر آزاد ٹرانسکرپشن یونٹوں کے اچھی طرح سے طے شدہ پروموٹر علاقوں سے کیا جاتا ہے۔ دریافت اور ساخت ایس ایم آر 9 سی ایس آر این اے کو ڈیل ویل اور دیگر نے بیان کیا تھا۔ حوالہ ایس میلیلوٹی 1021 تناؤ (http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi) کے بین جنیاتی علاقوں (آئی جی آر) میں۔ شمالی ہائبرڈائزیشن کے تجربات نے اس بات کی تصدیق کی کہ پیش گوئی شدہ ایس ایم آر 9 سی لوکس نے متوقع سائز کی ایک واحد نقل کا اظہار کیا، جو آزادانہ طور پر زندہ اور اینڈوسیمبیوٹک بیکٹیریا میں جمع ہوا۔ ٹی اے پی پر مبنی 5 '-آر اے سی ای تجربات نے مکمل لمبائی کے ایس ایم آر 9 سی ٹرانسکرپٹ کی ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ (ٹی ایس ایس) کو ایس میلیلوٹی 1021 جینوم (http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi) میں 1,398,425 این ٹی پوزیشن پر نقشہ بنایا جبکہ 3'-اینڈ کو 1,398,277 این ٹی پوزیشن پر واقع سمجھا گیا جو ایک حقیقی رو-آزاد ٹرمینیٹر (شکل 5) کے یو ایس کے مسلسل حصے کے آخری باقیات سے ملتا جلتا ہے۔ متوازی اور بعد کے مطالعات جن میں ایس ایم آر 9 سی ٹرانسکرپٹ کو Igr#3 یا ایس آر اے 32 کہا جاتا ہے، نے آزادانہ طور پر ایس میلیلوٹی اور اس کے قریب سے متعلق تناؤ 2011 میں اس ایس آر این اے کے اظہار کی تصدیق کی۔ ایس میلیلوٹی 2011 کے چھوٹے آر این اے فریکشن (50-350 این ٹی) کی حالیہ گہری ترتیب پر مبنی خصوصیت نے ایس ایم آر 9 سی (جسے یہاں اسمیل سی 289 کہا گیا ہے) کے اظہار کی مزید تصدیق کی، اور ایس میلیلوٹی 1021 جینوم میں بالترتیب پوزیشن 1,398,423 اور 1,398,279 پر مکمل لمبائی کے نقل کے 5 '-اور 3'-سروں کا نقشہ بنایا۔ ایس ایم آر 9 سی کی نیوکلیوٹائڈ ترتیب کو ابتدائی طور پر آرفیم ڈیٹا بیس (ورژن 10.0 ؛ http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam) کے خلاف تلاش کرنے کے لیے استفسار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ہومیولوجی کی اس تلاش نے اس ڈیٹا بیس میں معلوم بیکٹیریل ایس آر این اے سے کوئی میل نہیں کھایا۔ اس کے بعد ایس ایم آر 9 سی کو فی الحال دستیاب تمام بیکٹیریل جینومز (20 اپریل 2011 کو 1,615 ترتیبات ؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov) کے خلاف ڈیفالٹ پیرامیٹرز کے ساتھ بلاسٹ کیا گیا۔ استفسار کی ترتیب (78-89% مماثلت) میں اہم ہم آہنگی ظاہر کرنے والے علاقوں کو انفیرنل (version1.0) (شکل 2) کا استعمال کرتے ہوئے بیج کی صف بندی سے کوویرینس ماڈل (CM) بنانے کے لیے نکالا گیا تھا۔ اس سی ایم کو موجودہ بیکٹیریل جینومک ڈیٹا بیس میں αr9 خاندان کے نئے اراکین کی مزید تلاش میں استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج کا دستی طور پر معائنہ کیا گیا تاکہ خاندان کے لیے متفقہ ثانوی ڈھانچے کا اندازہ لگایا جا سکے (شکل 1 اور شکل 2)۔ اتفاق رائے کے ڈھانچے کی بھی آزادانہ طور پر اسی طرح کی پیش گوئیوں کے ساتھ لوکارنیٹ پروگرام کے ساتھ پیش گوئی کی گئی تھی۔ انفیرنل کا استعمال کرتے ہوئے سی ایم کے ساتھ پائے جانے والے ترتیبات کے دستی معائنے سے 26 حقیقی ہومولوگ ترتیبات تلاش کرنے کی اجازت ملی، یہ سب α-پروٹوبیکٹیریل جینومز میں واحد کروموسومل کاپیوں کے طور پر پیش ہوتے ہیں۔ ایس ایم آر 9 سی کے 12 قریبی ہومولوگس کو انکوڈنگ کرنے والی rhizobial انواع یہ تھیں: دو آر۔ لیگیومینوسارم ٹرائیفولی تناؤ (ڈبلیو ایس ایم 2304 اور ڈبلیو ایس ایم 1235)، دو آر۔ ایٹلی تناؤ سی ایف این 42 اور سی آئی اے ٹی 652، حوالہ آر۔ لیگیومینوسارم بی وی۔ ویشیا 3841 تناؤ، ریزوبیئم این جی آر 234، اور ایگروبیکٹیریم پرجاتیوں اے۔ وائٹس، اے۔ ٹیومیفیشینز، اے۔ ریڈیوبیکٹر اور اے۔ ایچ 13۔ ان تمام ترتیبات میں اہم انفیرنل ای ویلیوز (1.50e-39-14.02e-21) اور بٹ اسکور دکھائے گئے۔ ماڈل کے ساتھ پائے جانے والے باقی ترتیبات (3.40e-12 اور 2.62e-04) کے درمیان اعلی ای-ویلیوز دکھاتے ہیں لیکن کم بٹ اسکور دکھاتے ہیں اور بروسیلا پرجاتیوں (بی اوویس، بی کینس، بی ایبرٹس، بی مائکروٹس، اور بی میلیٹینسیس کے کئی بائیوبار)، بروسیلا اینتھروپی اور میسوریزوبم پرجاتیوں ایم لوٹی، ایم سیسری اور ایم بی این سی کے ذریعے انکوڈ کیے جاتے ہیں۔ اظہار کی معلومات متوازی مطالعات نے مختلف حیاتیاتی حالات کے تحت ایس میلیلوٹی 1021 میں ایس ایم آر 9 سی کے اظہار کا جائزہ لیا۔ ٹی وائی میں بیکٹیریا کی نشوونما، کم سے کم میڈیم (ایم ایم) اور لیوٹولین-ایم ایم شوربے اور اینڈو سمبائیوٹک بیکٹیریا (یعنی۔ پختہ سمبائیوٹک الفالفا نوڈلز) اور نمک کا زیادہ دباؤ، آکسیڈیٹیو تناؤ اور سرد اور گرم صدمے کا دباؤ۔ آزادانہ طور پر زندہ بیکٹیریا میں ایس ایم آر 9 سی کا اظہار نشوونما پر منحصر پایا گیا، جب بیکٹیریا مستحکم مرحلے میں داخل ہوئے تو جین کو مضبوطی سے کم کیا گیا، جبکہ اینڈوسیمبیوٹک بیکٹیریا میں کوئی اظہار نہیں پایا گیا۔ حالیہ گہری ترتیب کے اعداد و شمار نے نمک، تیزابیت، کولڈ شاک اور ہیٹ شاک کے دباؤ پر ایس ایم آر 9 سی کے اپ ریگولیشن کا مزید انکشاف کیا۔ حالیہ شریک امیونو بارش کے تجربات اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ ایس ایم آر 9 سی، موثر ٹارگٹ بائنڈنگ کے لیے بیکٹیریل پروٹین ایچ ایف کیو کو باندھتا ہے۔ پروموٹر تجزیہ αr9 خاندان کے اراکین کے تمام پروموٹر علاقوں کی اب تک جانچ پڑتال کی گئی ہے جو ایس آر این اے کے ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ کے اوپر کی طرف 80 بی پی تک پھیلی ہوئی ترتیب میں بہت محفوظ ہیں۔ تمام لوکیوں میں قابل شناخت σ70-انحصار پروموٹر ہوتے ہیں جو-35/- 10 اتفاق رائے کا نقشہ سی ٹی ٹی اے جی اے سی-این 17-سی ٹی اے ٹی اے ٹی دکھاتے ہیں، جو پہلے پروٹوبیکٹیریا کے α-ذیلی گروپ میں کئی دیگر نسلوں کے درمیان وسیع پیمانے پر محفوظ دکھایا گیا ہے۔ ٹرانسکرپشن کے دیگر معروف عوامل کے لیے بائنڈنگ سائٹس کی شناخت کے لیے ہم نے ریگ پریڈیکشن (http://regpredict.lbl.gov/regpredict/help.html) کے فراہم کردہ فاسٹا سیکوینسز کا استعمال کیا، اور ریگولون ڈی بی (http://regulondb.ccg.unam.mx) کے فراہم کردہ پوزیشن ویٹ میٹرکس (پی ایس ڈبلیو ایم) کا استعمال کیا۔ ہم نے اتفاق رائے/پیٹرسر پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے ریگ پیشن گوئی کے سلسلے سے ہر نقل کے عنصر کے لیے پی ایس ڈبلیو ایم بنایا، 14 اور 30 کے درمیان موٹف لمبائی کے لیے بہترین حتمی میٹرکس کا انتخاب کرتے ہوئے ہر میٹرکس کے لیے ایک حد اوسط ای-ویلیو <10E-10 قائم کیا گیا، (http://gps-tools2.its.yale.edu میں "تھریشولڈ اتفاق رائے" دیکھیں)۔ مزید برآں، ہم نے ایم ای ایم ای (http://meme.sdsc.edu/meme4_6_1/intro.html) کا استعمال کرتے ہوئے محفوظ شدہ نامعلوم نقشوں کی تلاش کی اور آرام دہ باقاعدہ تاثرات (یعنی۔ پیٹرن میچنگ) تمام ایس ایم آر 9 سی ہومیولوگس پروموٹروں پر۔ اس مطالعے سے پتہ چلا کہ 30 بی پی لمبے علاقے کی موجودگی پوزیشن-40 اور-75 کے درمیان بہت محفوظ ہے، محفوظ ایم ای ایم ای موٹف، (شکل 5)۔ یہ ترتیب پائے جانے والے ایس ایم آر سی 9 ہومولوگس میں سے ایک کے علاوہ سب میں موجود تھی، لیکن معروف ٹرانسکرپشن فیکٹر بائنڈنگ سائٹس میٹرکس سے کوئی خاص مماثلت قائم نہیں کی جا سکی۔ جینومک سیاق و سباق αr9 خاندان کے زیادہ تر اراکین کروموسومل آئی جی آر میں آزاد پروموٹروں سے نقل شدہ ٹرانس انکوڈڈ ایس آر این اے ہیں۔ مستثنیات اے۔ ٹیومیفیشینز اور بی۔ مائکروٹی کے سی آئی ایس-انکوڈڈ اینٹی سینس ایس ایم آر 9 سی ہومولوگس ہیں، جو جزوی طور پر اوور لیپنگ او آر ایفز، اینوٹیٹڈ جینز کے مخالف اسٹرینڈ میں واقع ہیں۔ بیج کی صف بندی کے اراکین کے زیادہ تر پڑوسی جینوں کی تشریح نہیں کی گئی تھی اور اس طرح انہیں مزید دستی طور پر تیار کیا گیا تھا۔ ان اوور لیپنگ او آر ایف کی پیش گوئی شدہ پروٹین مصنوعات کو امینو ایسڈ سیکوینس ہومیولوجی کی بنیاد پر کسی بھی فعال زمرے میں تفویض نہیں کیا جا سکا۔ تاہم، تقریبا تمام αr9 sRNAs کے جینومک علاقوں نے بڑے پیمانے پر تحفظ کی نمائش کی جس میں sRNA-کوڈنگ سیکوینس اور اپ اسٹریم اور ڈاؤن اسٹریم جینز شامل ہیں جن کی پیش گوئی بالترتیب پرولیل-tRNA سنٹیتھیس (پرو ایس) اور ٹرانس میمبرین پروٹین کے لیے کی گئی ہے۔ αr9 جینومک علاقوں کی جزوی مطابقت کا مشاہدہ کچھ معاملات میں کیا گیا جیسے، ایس میڈیکی جہاں ایک پرو ایس جین کے بجائے ایک ایف اے ڈی پر منحصر پیریڈائن نیوکلیوٹائڈ-ڈائیسلفائڈ آکسیڈوریڈیکٹس انکوڈنگ جین αr9 لوکس کے اوپر کی طرف پایا گیا، اور میسوریزوبیئم لوٹی جہاں کوئی ٹرانس میمبرین کوڈنگ جین ایس آر این اے جین کے نیچے کی طرف قابل شناخت نہیں تھا۔ ایک خاص معاملہ بروسیلا گروپ ہے، جہاں ان کے جینوموں پر بنیادی خودکار تشریح نے 30 اے اے سے چھوٹے او آر ایف کی نشاندہی کی جو اسی اسٹرینڈ میں پیش گوئی شدہ αr9 ایس آر این اے کے ساتھ اوور لیپنگ کرتے ہیں۔ یہ پیش گوئی شدہ او آر ایف، جب فیملی اور موٹف ڈیٹا بیس جیسے انٹرپرو، پی ایف اے ایم یا اسمارٹ کے خلاف تلاشی لی جاتی ہے تو نہ تو ڈیٹا بیس کے اندراجات کے ساتھ کوئی مماثلت ظاہر کرتے ہیں اور نہ ہی کوئی موٹف یا دستخط، اور اس طرح، یہاں جینومک سیاق و سباق کے گراف میں رجسٹرڈ غلط نوٹیشن کے طور پر سمجھے جاتے ہیں۔ حوالہ جات آر این اے