Αr45 RNA
αr45 بیکٹیریل چھوٹے غیر کوڈنگ RNAs کا ایک خاندان ہے جس کے نمائندے α-پروٹوبیکٹیریا کے ایک وسیع گروپ میں ہیں جو ہائفو مائکروبیلز آرڈر سے ہیں۔ اس خاندان کا پہلا رکن (ایس ایم آر 45 سی) کروموسوم (سی) میں واقع سینورہیزوبیم میلیلوٹی 1021 لوکس میں پایا گیا تھا۔ مزید ہومیولوجی اور ساخت کے تحفظ کے تجزیے نے کئی نائٹروجن فکسنگ سمبائیوٹک ریزوبیا میں ہومولوگس کی نشاندہی کی (یعنی۔ ایس میڈیکی، ایس فریڈی، ریزوبیم لیگیومینوسارم bv.viciae، آر لیگیومینوسارم بی وی۔ ٹرائیفولی، آر ایٹلی، اور کئی میسوریزوبیئم پرجاتیوں)، ایگروبیکٹیریم پرجاتیوں سے تعلق رکھنے والے پودوں کے پیتھوجینز میں (یعنی۔ اے۔ ٹیومیفیسینس، اے۔ وائٹس، اے۔ ریڈیوبیکٹر، اور ایگروبیکٹیریم ایچ 13) کے ساتھ ساتھ بروسیلا پرجاتیوں (بی۔ اوویس، بی۔ کینس، بی۔ ایبرٹس اور بی۔ مائکروٹس، اور بی۔ میلیٹینسیس کے کئی بائیوورز) کے وسیع میدان عمل میں، بارٹونیلا پرجاتیوں (یعنی۔ بی۔ ہینسیلی، بی۔ کلیریجیا، بی۔ ٹرائبوکورم، بی۔ کوئنٹانا، بی۔ بیسیلفارمس، بی۔ گرہیمی)، زینتھوبیکٹیریشیا خاندان کے کئی اراکین میں (یعنی۔ ازورہیزوبیم کالینوڈانس، سٹارکی ناول، زینٹوبیکٹر آٹوٹروفکس)، اور بیجینکیسی خاندان کے کچھ نمائندوں میں (یعنی۔ میتھیلوسیلا سلویسٹرس، بیجینکیا انڈیکا سب ایس پی۔ انڈیکا)۔ αr45C RNA انواع 147-153 nt لمبی ہیں (ٹیبل 1) اور ایک اچھی طرح سے بیان کردہ عام ثانوی ڈھانچے کا اشتراک کرتی ہیں (شکل 1)۔ تمام αr45 نقل کو ٹرانس ایکٹنگ ایس آر این اے کے طور پر درج کیا جا سکتا ہے جس کا اظہار α-پروٹوبیکٹیریل جینومز (شکل 5) کے انٹرجینک علاقوں (آئی جی آر) کے اندر آزاد ٹرانسکرپشن یونٹوں کے اچھی طرح سے طے شدہ پروموٹر علاقوں سے کیا گیا ہے۔ دریافت اور ساخت ایس ایم آر 45 سی ایس آر این اے کو ڈیل ویل اور دیگر نے حوالہ ایس میلیلوٹی 1021 تناؤ (http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi) کے انٹرجینک علاقوں (آئی جی آر) میں کمپیوٹیشنل تقابلی جینومک نقطہ نظر کے نتیجے میں بیان کیا تھا۔ شمالی ہائبرڈائزیشن کے تجربات نے اس بات کی تصدیق کی کہ پیش گوئی شدہ ایس ایم آر 45 سی لوکس نے 130-179 این ٹی لمبائی کی ایک واحد نقل کا اظہار کیا، جو آزادانہ طور پر زندہ اور اینڈوسیمبیوٹک بیکٹیریا میں جمع ہوا۔ ٹی اے پی پر مبنی 5 '-آر اے سی ای تجربات نے مکمل لمبائی کے ایس ایم آر 45 سی ٹرانسکرپٹ کے ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ (ٹی ایس ایس) کو ایس میلیلوٹی 1021 جینوم (http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi) میں 3,105,445 این ٹی پوزیشن پر نقشہ بنایا جبکہ 3'-اینڈ کو ابتدائی طور پر 3,105,265 این ٹی پوزیشن پر واقع سمجھا گیا تھا جو ایک تخیلاتی، لیکن کم درجہ بندی والے، رو-آزاد ٹرمینیٹر کے یو ایس (شکل 2) کے مختصر حصے کے آخری باقیات سے ملتا جلتا ہے۔ ایس میلیلوٹی 2011 کے چھوٹے آر این اے فریکشن (50-350 این ٹی) کی حالیہ گہری ترتیب پر مبنی خصوصیت نے ایس ایم آر 45 سی (جسے یہاں ایس ایم ایل سی 706 کہا گیا ہے) کے اظہار کی مزید تصدیق کی، اور مکمل لمبائی کی نقل کو اسی 5 'سرے اور 3' سرے کی پوزیشن 3,105,298 پر نقشہ بنایا۔ ایس ایم آر 45 سی کی نیوکلیوٹائڈ ترتیب کو ابتدائی طور پر آرفیم ڈیٹا بیس (ورژن 10.0 ؛ http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam) کے خلاف تلاش کرنے کے لیے استفسار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ہومیولوجی کی اس تلاش نے اس ڈیٹا بیس میں معلوم بیکٹیریل ایس آر این اے سے کوئی میل نہیں کھایا۔ اس کے بعد ایس ایم آر 45 سی کو اس وقت دستیاب تمام بیکٹیریل جینومز (20 اپریل 2011 کو 1,615 ترتیبات ؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov) کے خلاف ڈیفالٹ پیرامیٹرز کے ساتھ بلاسٹ کیا گیا۔ استفسار کی ترتیب (78-89% مماثلت) میں اہم ہم آہنگی ظاہر کرنے والے علاقوں کو انفیرنل (version1.0) (شکل 2) کا استعمال کرتے ہوئے بیج کی صف بندی سے کوویرینس ماڈل (CM) بنانے کے لیے نکالا گیا تھا۔ اس سی ایم کو موجودہ بیکٹیریل جینومک ڈیٹا بیس میں αr45 خاندان کے نئے اراکین کی مزید تلاش میں استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج کا دستی طور پر معائنہ کیا گیا تاکہ خاندان کے لیے متفقہ ثانوی ڈھانچے کا اندازہ لگایا جا سکے (شکل 1 اور شکل 2)۔ اتفاق رائے کے ڈھانچے کی بھی آزادانہ طور پر اسی طرح کی پیش گوئیوں کے ساتھ لوکارنیٹ پروگرام کے ساتھ پیش گوئی کی گئی تھی۔ انفیرنل کا استعمال کرتے ہوئے سی ایم کے ساتھ پائے جانے والے ترتیبات کے دستی معائنے سے 39 قریبی ہومولوگ ترتیبات تلاش کرنے میں مدد ملی، یہ سب α-پروٹوبیکٹیریل جینومز میں واحد کروموسومل کاپیوں کے طور پر پیش ہوتے ہیں۔ ایس ایم آر 45 سی میں ان ہومولوگس کو انکوڈنگ کرنے والی rhizobial انواع یہ تھیں: ایس میڈیکی اور ایس فریڈی، دو آر لیگیومینوسارم ٹرائیفولی تناؤ (ڈبلیو ایس ایم 304 اور ڈبلیو ایس ایم 35)، دو آر ایٹلی تناؤ سی ایف این 42 اور سی آئی اے ٹی 652، حوالہ آر لیگیومینوسارم بی وی۔ ویسیا 3841 تناؤ، اور ایگروبیکٹیریم پرجاتیوں اے۔ وائٹس، اے۔ ٹیومیفیسینس، اے ریڈیوبیکٹر اور اے ایچ 13، بروسیلا پرجاتیوں (بی اوویس، بی کینس، بی ایبرٹس، بی مائکروٹس، اور بی میلیٹینسیس کے کئی بائیوبار)، بروسیلا اینتھروپی، میسوریزوبیم پرجاتیوں لوٹی، ایم سیسری اور ایم۔ بی این سی، بارٹونیلا پرجاتیوں (یعنی۔ بی۔ ہینسیلی، بی۔ کلیریجیا، بی۔ ٹرائبوکورم، بی۔ کوئنٹانا، بی۔ بیسیلفارمس، بی۔ گرہیمی)۔ ان تمام ترتیبات میں اہم انفیرنل ای ویلیوز (8.93E-40-6.12E-36) اور بٹ اسکور دکھائے گئے۔ ماڈل کے ساتھ پائے جانے والے باقی ترتیبات (3.28E-06 اور 4.56E-04) کے درمیان اعلی E-ویلیوز دکھاتے ہیں لیکن کم بٹ اسکور دکھاتے ہیں اور Xanthobactereacea خاندان کے کئی اراکین (یعنی. اے۔ کالینوڈانس، سا۔ نوولا، ایکس۔ آٹوٹروفکس)، میں۔ سلویسٹرس، اور Be. انڈیکا سب ایس پی۔ انڈیکا۔ اظہار کی معلومات ایس میلیلوٹی 1021 میں ایس ایم آر 45 سی کے اظہار کا اندازہ مختلف حیاتیاتی حالات کے تحت کیا گیا تھا۔ ٹی وائی میں بیکٹیریا کی نشوونما، کم سے کم میڈیم (ایم ایم) اور لیوٹولین-ایم ایم شوربے اور اینڈو سمبائیوٹک بیکٹیریا (یعنی۔ بالغ سمبائیوٹک الفالفا نوڈلز)۔ آزاد زندگی گزارنے والے بیکٹیریا میں ایس ایم آر 45 سی کا اظہار نشوونما پر منحصر پایا گیا، جب بیکٹیریا مستحکم مرحلے میں داخل ہوتے ہیں تو جین کو مضبوطی سے کم کیا جاتا ہے۔ تاہم، لیوٹولین نے معتدل طور پر ایس ایم آر 45 سی (2 گنا) کے اظہار کو متحرک کیا لیکن اینڈوسیمبیوٹک بیکٹیریا میں جین کا پتہ نہیں چل سکا۔ حالیہ شریک امیونو بارش کے تجربات اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ ایس ایم آر 45 سی، موثر ٹارگٹ بائنڈنگ کے لیے بیکٹیریل پروٹین ایچ ایف کیو کو باندھتا ہے۔ پروموٹر تجزیہ αr45 خاندان کے افراد کے تمام پروموٹر علاقوں کی اب تک جانچ پڑتال کی گئی ہے جو ایس آر این اے کے ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ کے اوپر کی طرف 80 بی پی تک پھیلی ہوئی ترتیب میں بہت محفوظ ہیں۔ تمام قریب ترین ہومولوگ لوکیوں میں قابل شناخت σ70-منحصر پروموٹر ہوتے ہیں جو-35/- 10 اتفاق رائے کا نقشہ سی ٹی ٹی اے جی اے سی-این 17-سی ٹی اے ٹی اے ٹی دکھاتے ہیں، جو پہلے پروٹوبیکٹیریا کے α-ذیلی گروپ میں کئی دیگر نسلوں کے درمیان وسیع پیمانے پر محفوظ دکھایا گیا ہے۔ ٹرانسکرپشن کے دیگر معروف عوامل کے لیے بائنڈنگ سائٹس کی شناخت کے لیے ہم نے ریگ پریڈیکشن (http://regpredict.lbl.gov/regpredict/help.html) کے فراہم کردہ فاسٹا سیکوینسز کا استعمال کیا، اور ریگولون ڈی بی (http://regulondb.ccg.unam.mx) کے فراہم کردہ پوزیشن ویٹ میٹرکس (پی ایس ڈبلیو ایم) کا استعمال کیا۔ ہم نے اتفاق رائے/پیٹرسر پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے ریگ پیشن گوئی کے سلسلے سے ہر نقل کے عنصر کے لیے پی ایس ڈبلیو ایم بنایا، 14 اور 30 کے درمیان موٹف لمبائی کے لیے بہترین حتمی میٹرکس کا انتخاب کرتے ہوئے ہر میٹرکس کے لیے ایک حد اوسط ای-ویلیو <10E-10 قائم کیا گیا، (http://gps-tools2.its.yale.edu میں "تھریشولڈ اتفاق رائے" دیکھیں)۔ مزید برآں، ہم نے ایم ای ایم ای (http://meme.sdsc.edu/meme4_6_1/intro.html) کا استعمال کرتے ہوئے محفوظ شدہ نامعلوم نقشوں کی تلاش کی اور آرام دہ باقاعدہ تاثرات (یعنی۔ پیٹرن میچنگ) تمام ایس ایم آر 45 سی ہومولوگس پروموٹرز پر۔ یہ مطالعہ مختلف α-پروٹوبیکٹیریل پرجاتیوں میں αr45 نمائندوں کے اظہار کے ضابطے میں اختلافات کی پیش گوئی کرتا ہے۔ سینورہیزوبیم، ریزوبیم، اور ایگروبیکٹیریم گروپوں نے ایک بہت اچھی طرح سے محفوظ شدہ موٹف پیش کیا جو مالٹوز ریپریسر مال کے ذریعہ تسلیم شدہ متفقہ ترتیب سے میل کھاتا ہے۔ مزید برآں، کے αr45 اراکین کے پروموٹرز۔ مزید برآں، سینورہیزوبیم گروپ کے αr45 اراکین کے پروموٹروں نے پوزیشن-60 اور-85 کے درمیان ایک اضافی محفوظ علاقہ پیش کیا (شکل 4 میں نارنجی رنگ میں باکس کیا گیا ہے)، جس میں میٹرکس ایس ایم بی 21598 _ ریزوبیلیس سے نمایاں مماثلت ہے۔ یہ بائنڈنگ سائٹ LacI خاندان کے ٹرانسکرپشنل ریگولیٹر سے مطابقت رکھتی ہے۔ ریزبیئم گروپ نے بھی اس خطے میں ایک اچھی طرح سے محفوظ نقش پیش کیا جس کے لیے کوئی خاص مماثلت نہیں مل سکی (شکل 4 میں سبز رنگ میں نشان زد)۔ اس تجزیے سے بروسیلا اور بارٹونیلا αr45 sRNA لوکی کے پروموٹروں کے درمیان ایک توسیعی محفوظ ترتیب کے پھیلاؤ کا بھی انکشاف ہوا، لیکن ان نقشوں میں کوئی معروف ٹرانسکرپشن فیکٹر بائنڈنگ سائٹس قابل شناخت نہیں تھے۔ جینومک سیاق و سباق αr45 خاندان کے تمام اراکین کروموسومل آئی جی آر میں آزاد پروموٹروں سے نقل شدہ ٹرانس انکوڈڈ ایس آر این اے ہیں۔ بیج کی صف بندی کے اراکین کے زیادہ تر پڑوسی جینوں کی تشریح نہیں کی گئی تھی اور اس طرح انہیں مزید دستی طور پر تیار کیا گیا تھا۔ سینورہیزوبیم، ریزوبیم، اے وائٹس اور اے ریڈیوبیکٹر سے αr45 sRNAs کے جینومک علاقوں نے بہت زیادہ تحفظ کا مظاہرہ کیا جس میں اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم جینز شامل ہیں جن کی پیش گوئی بالترتیب LysR فیملی ٹرانسکرپشنل ریگولیٹر اور آرنیتھائن ڈیسکاربکسیلس کے لیے کوڈ کرنے کے لیے کی گئی ہے (سولو کومو ایکلاسیئن، اپ اسٹریم اور ڈاؤن اسٹریم سی ریفیرن ال سینڈیڈو ڈی ٹرانسکرپسین)۔ میسوریزوبیم اور بروسیلا پرجاتیوں میں αr45 جینومک علاقوں کی جزوی مطابقت کا مشاہدہ کیا گیا جہاں aLySR فیملی ٹرانسکرپشنل ریگولیٹر 'جین کے بجائے ایک امیڈیز کوڈنگ جین پایا گیا۔ بارٹونیلا پرجاتیوں میں αr45 اپ اسٹریم جین ہمیشہ ایک پروٹین کے لیے کوڈ کرنے کے لیے پایا جاتا تھا جس میں روڈانیز ڈومین ہوتا ہے۔ αr45 ہومیولوگس کے جینومک علاقوں میں زیادہ دور سے متعلق α-پروٹوبیکٹیریا (مثال کے طور پر۔ سٹارکیہ، میتھیلوسیلا یا زینتھوبیکٹر پرجاتیوں) کی مطابقت پذیری نیچے کی طرف آرنیتھائن ڈیسکاربکسائیلیز جین تک محدود تھی۔ حوالہ جات آر این اے