Αr14 RNA
αr14 بیکٹیریل چھوٹے غیر کوڈنگ آر این اے کا ایک خاندان ہے جس کے نمائندے α-پروٹوبیکٹیریا کے ایک وسیع گروپ میں ہیں۔ اس خاندان کا پہلا رکن (ایس ایم آر 14 سی 2) کروموسوم (سی) میں واقع سینورہیزوبیم میلیلوٹی 1021 لوکس میں پایا گیا تھا۔ بعد میں اس کا نام بدل کر این ایف ای آر 1 (نوڈیول فارمیشن ایفیشنسی آر این اے) رکھ دیا گیا اور نمک کے دباؤ اور پھلیوں کی جڑوں پر سمبائیوٹک تعامل کے دوران اس کا بہت زیادہ اظہار دکھایا گیا۔ مزید ہومیولوجی اور ساخت کے تحفظ کے تجزیے نے 2 دیگر کروموسومل کاپیوں اور 3 پلاسمڈک کاپیوں کی نشاندہی کی۔ مزید برآں، مکمل لمبائی والے ایس ایم آر 14 سی ہومولوگس کی شناخت کئی نائٹروجن فکسنگ سمبائیوٹک ریزوبیا (یعنی۔ آر۔ لیگیومینوسارم bv.viciae، آر۔ لیگیومینوسارم bv۔ ٹرائیفولی، آر ایٹلی، اور کئی میسوریزوبیئم پرجاتیوں)، ایگروبیکٹیریم پرجاتیوں سے تعلق رکھنے والے پودوں کے پیتھوجینز میں (یعنی۔ اے۔ ٹیومیفیسینس، اے۔ وائٹس، اے۔ ریڈیوبیکٹر، اور ایگروبیکٹیریم ایچ 13) کے ساتھ ساتھ بروسیلا پرجاتیوں (بی۔ اوویس، بی۔ کینس، بی۔ ایبرٹس اور بی۔ مائکروٹس، اور بی۔ میلیٹینسیس کے کئی بائیوورز) کے وسیع میدان عمل میں۔ αr14C RNA انواع 115-125 nt لمبی ہیں (ٹیبل 1) اور ایک اچھی طرح سے بیان کردہ عام ثانوی ڈھانچے کا اشتراک کرتی ہیں (شکل 1)۔ زیادہ تر αr14 نقل کو ٹرانس ایکٹنگ ایس آر این اے کے طور پر درج کیا جا سکتا ہے جس کا اظہار α-پروٹوبیکٹیریل جینومز (شکل 5) کے انٹرجینک علاقوں (آئی جی آر) کے اندر آزاد ٹرانسکرپشن یونٹوں کے اچھی طرح سے طے شدہ پروموٹر علاقوں سے کیا گیا ہے۔ دریافت اور ساخت ایس ایم آر 14 سی 2 ایس آر این اے کو ڈیل ویل اور دیگر نے ایک کمپیوٹیشنل تقابلی جینومک نقطہ نظر کے نتیجے میں بیان کیا تھا جو تکمیلی حکمت عملیوں کے انضمام پر مشتمل ہے، جو حوالہ ایس میلیلوٹی 1021 تناؤ (http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi) کے بین جنیاتی علاقوں (آئی جی آر) میں نئے ایس آر این اے-انکوڈنگ جینوں کی تلاش کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ شمالی ہائبرڈائزیشن کے تجربات نے اس بات کی تصدیق کی کہ پیش گوئی شدہ ایس ایم آر 14 سی 2 لوکس نے متوقع سائز کی ایک واحد نقل کا اظہار کیا، جو آزادانہ طور پر زندہ اور اینڈوسیمبیوٹک بیکٹیریا میں جمع ہوا۔ ٹی اے پی پر مبنی 5 '-آر اے سی ای تجربات نے مکمل لمبائی کے ایس ایم آر 14 سی ٹرانسکرپٹ کی ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ (ٹی ایس ایس) کو ایس میلیلوٹی 1021 جینوم (http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi) میں 1,667,613 این ٹی پوزیشن پر نقشہ بنایا جبکہ 3'-اینڈ کو 1,667,491 این ٹی پوزیشن پر واقع سمجھا گیا جو ایک حقیقی رو-آزاد ٹرمینیٹر (شکل 5) کے یو ایس کے مسلسل حصے کے آخری باقیات سے ملتا جلتا ہے۔ متوازی اور بعد کے مطالعات جن میں ایس ایم آر 14 سی 2 نقل کو ایس آر اے 38 یا ایس ایم 7 کہا جاتا ہے، نے آزادانہ طور پر ایس میللوٹی اور اس کے قریب سے متعلق تناؤ 2011 میں اس ایس آر این اے کے اظہار کی تصدیق کی۔ ایس میلیلوٹی 2011 کے چھوٹے آر این اے فریکشن (50-350 این ٹی) کی حالیہ گہری ترتیب پر مبنی خصوصیت نے ایس ایم آر 14 سی 2 (جسے یہاں اسمیل سی 397 کہا گیا ہے) کے اظہار کی مزید تصدیق کی، اور ایس میلیلوٹی 1021 جینوم میں اسی پوزیشن پر مکمل لمبائی کے نقل کے 5 '-اور 3'-سروں کا نقشہ بنایا۔ ایس ایم آر 14 سی 2 کی نیوکلیوٹائڈ ترتیب کو ابتدائی طور پر آر فیم ڈیٹا بیس (ورژن 10.0 ؛ http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam) کے خلاف تلاش کرنے کے لیے استفسار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ہومیولوجی کی اس تلاش نے اس ڈیٹا بیس میں معلوم بیکٹیریل ایس آر این اے سے کوئی میل نہیں کھایا۔ اس کے بعد ایس ایم آر 14 سی 2 کو اس وقت دستیاب تمام بیکٹیریل جینومز (20 اپریل 2011 کو 1,615 ترتیبات ؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ؛) کے خلاف ڈیفالٹ پیرامیٹرز کے ساتھ بلاسٹ کیا گیا۔ استفسار کی ترتیب (78-89% مماثلت) میں اہم ہم آہنگی ظاہر کرنے والے علاقوں کو انفیرنل (version1.0) (شکل 2) کا استعمال کرتے ہوئے بیج کی صف بندی سے کوویرینس ماڈل (CM) بنانے کے لیے نکالا گیا تھا۔ اس سی ایم کو موجودہ بیکٹیریل جینومک ڈیٹا بیس میں αr9 خاندان کے نئے اراکین کی مزید تلاش میں استعمال کیا گیا اور مندرجہ ذیل ٹیبل 2 میں دوبارہ شروع کیا گیا: نتائج کا دستی طور پر معائنہ کیا گیا تاکہ خاندان کے لیے متفقہ ثانوی ڈھانچے کا پتہ لگایا جا سکے (شکل 1 اور شکل 2)۔ اتفاق رائے کے ڈھانچے کی بھی آزادانہ طور پر اسی طرح کی پیش گوئیوں کے ساتھ لوکارنیٹ پروگرام کے ساتھ پیش گوئی کی گئی تھی۔ انفیرنل کا استعمال کرتے ہوئے سی ایم کے ساتھ پائے جانے والے ترتیبات کے دستی معائنے سے 101 ہومولوگ ترتیبات تلاش کرنے میں مدد ملی۔ ایس ایم آر 14 سی 2 کے 36 قریبی ہومولوگس کو انکوڈنگ کرنے والی rhizobial انواع یہ تھیں: ایس میڈیکی اور ایس فریڈی، دو آر لیگیومینوسارم ٹرائیفولی تناؤ (ڈبلیو ایس ایم 2304 اور ڈبلیو ایس ایم 1325)، دو آر ایٹلی تناؤ سی ایف این 42 اور سی آئی اے ٹی 652، حوالہ آر لیگیومینوسارم بی وی۔ ویسیا 3841 تناؤ، اور ایگروبیکٹیریم پرجاتیوں اے۔ وائٹس، اے۔ ٹیومیفیشینز، اے۔ ریڈیوبیکٹر اور اے۔ ایچ 13۔ ان تمام ترتیبات میں اہم انفیرنل ای ویلیوز (5.63E-29-8.16E-18) اور بٹ اسکور دکھائے گئے۔ ماڈل کے ساتھ پائے جانے والے باقی سلسلے (1.33E-17 اور 8.79E-03) کے درمیان اعلی E-ویلیوز دکھاتے ہیں لیکن کم بٹ اسکور دکھاتے ہیں اور بروسیلا پرجاتیوں (B. ovis، B. canis، B. abortus، B. microtis، اور B. melitensis کے کئی بائیوبار)، بروسیلا اینتھروپی اور میسوریزوبم پرجاتیوں لوٹی، M. cicery اور M. BNC کے ذریعے انکوڈ کیے جاتے ہیں۔ ماڈل نے ایس میلیلوٹی جینوم میں پانچ اضافی کاپیوں کی نشاندہی کی، ان میں سے دو کو ایک ہی آئی جی آر (ایس ایم آر 14 سی 2، ایس ایم آر 14 سی 3) میں مل کر تلاش کیا۔ ایس میڈیکی (ایسمیڈر 14 سی 1، ایسمیڈر 14 سی 2)، ایس فریڈی (ایس ایف آر 14 سی 1، ایس ایف آر 14 سی 2)، ایم لوٹی (ایم ایل آر 14 سی 1، ایم ایل آر 14 سی 2) اور ایم سیسری (ایم سی آر 14 سی 1، ایم سی آر 14 سی 2) کے لیے بھی یہی نتائج حاصل کیے گئے۔ ایس میلیلوٹی جینوم میں پائی جانے والی اضافی کاپیوں کے حوالے سے، حالیہ مطالعات میں پانچ میں سے چار کاپیوں کے اظہار کی آزادانہ طور پر تصدیق کی گئی ہے: ایس ایم آر 14 سی 3 جس کا حوالہ: ایس آر اے 38، ایس ایم 7 یا ایس ایم سی 398 ایس ایم آر 14 اے 1 جس کا حوالہ: ایس ایم اے 8 یا ایس ایم ای 075 ایس ایم آر 14 اے 2 جس کا حوالہ: ایس ایم ای ایل اے 099 ایس ایم آر 14 بی جس کا حوالہ: ایس ایم ای ایل بی 161 پیش گوئی شدہ کاپی ایس ایم آر 14 سی 1 کے لیے اب تک کوئی تجرباتی ثبوت نہیں ہیں۔ اظہار کی معلومات متوازی مطالعات نے مختلف حیاتیاتی حالات کے تحت ایس میلیلوٹی 1021 میں ایس ایم آر 14 سی کے اظہار کا جائزہ لیا۔ ٹی وائی میں بیکٹیریا کی نشوونما، کم سے کم میڈیم (ایم ایم) اور لیوٹولین-ایم ایم شوربے اور اینڈو سمبائیوٹک بیکٹیریا (یعنی۔ پختہ سمبائیوٹک الفالفا نوڈلز) اور نمک کا زیادہ دباؤ، آکسیڈیٹیو تناؤ اور سرد اور گرم صدمے کا دباؤ۔ آزاد زندگی گزارنے والے بیکٹیریا میں ایس ایم آر 14 سی 2 کا اظہار نشوونما پر منحصر پایا گیا، جب بیکٹیریا مستحکم مرحلے میں داخل ہوئے تو جین کو مضبوطی سے کم کیا گیا۔ آزاد زندگی گزارنے والے بیکٹیریا (لاگ فیز ٹی وائی یا ایم ایم کلچرز) کے مقابلے میں ایس ایم آر 14 سی 2 کا اظہار نوڈلز میں 5 گنا بڑھ گیا، جو بیکٹیریل انفیکشن اور/یا بیکٹیریوڈ تفریق کے دوران ان ایس آر این ایز کو شامل کرنے کی تجویز کرتا ہے۔ حالیہ گہری ترتیب کے اعداد و شمار میں پلاسمک کاپیوں کا تفریق اظہار پایا گیا۔ ایس ایم آر 14 اے 1 نے تفریقی اظہار کے حالات دکھائے، پیچیدہ میڈیم میں بہت کم اظہار کی سطح کے ساتھ اور اسی میڈیم میں کم درجہ حرارت پر۔ تاہم، گرمی کے جھٹکے کے دباؤ کی وجہ سے اس پر سختی سے قابو پایا گیا۔ ایس ایم آر 14 بی نے اس کے اظہار میں مستحکم مرحلے میں 8 گنا سے زیادہ اضافہ دکھایا۔ مزید برآں، تیزابیت، بنیادی اور آکسیڈیٹیو اسٹریس پروموٹر تجزیہ پر ایک ہفتہ کا اپ ریگولیشن (<8 گنا) بھی دکھایا گیا۔ αr14 خاندان کے تمام پروموٹر علاقوں کی اب تک جانچ پڑتال کی گئی ہے جو ایس آر این اے کے ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ کے اوپر کی طرف 120 بی پی تک پھیلی ہوئی ترتیب میں بہت محفوظ ہیں۔ تمام قریب ترین ہومولوگ لوکیوں میں قابل شناخت σ70-منحصر پروموٹر ہوتے ہیں جو-35/- 10 اتفاق رائے کا نقشہ سی ٹی ٹی اے جی اے سی-این 17-سی ٹی اے ٹی اے ٹی دکھاتے ہیں، جو پہلے پروٹوبیکٹیریا کے α-ذیلی گروپ میں کئی دیگر نسلوں کے درمیان وسیع پیمانے پر محفوظ دکھایا گیا ہے۔ ٹرانسکرپشن کے دیگر معروف عوامل کے لیے بائنڈنگ سائٹس کی شناخت کے لیے ہم نے ریگ پریڈیکشن (http://regpredict.lbl.gov/regpredict/help.html) کے فراہم کردہ فاسٹا سیکوینسز کا استعمال کیا، اور ریگولون ڈی بی (http://regulondb.ccg.unam.mx) کے فراہم کردہ پوزیشن ویٹ میٹرکس (پی ایس ڈبلیو ایم) کا استعمال کیا۔ ہم نے اتفاق رائے/پیٹرسر پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے ریگ پیشن گوئی کے سلسلے سے ہر نقل کے عنصر کے لیے پی ایس ڈبلیو ایم بنایا، 14 اور 30 کے درمیان موٹف لمبائی کے لیے بہترین حتمی میٹرکس کا انتخاب کرتے ہوئے ہر میٹرکس کے لیے ایک حد اوسط ای-ویلیو <10E-10 قائم کیا گیا، (http://gps-tools2.its.yale.edu میں "تھریشولڈ اتفاق رائے" دیکھیں)۔ مزید برآں، ہم نے ایم ای ایم ای (http://meme.sdsc.edu/meme4_6_1/intro.html) کا استعمال کرتے ہوئے محفوظ شدہ نامعلوم نقشوں کی تلاش کی اور آرام دہ باقاعدہ تاثرات (یعنی۔ پیٹرن میچنگ) تمام ایس ایم آر 14 سی 2 ہومولوگس پروموٹرز پر۔ اس مطالعے سے لوکی کے دو اچھی طرح سے متعین گروپوں کا انکشاف ہوا، جن میں سے پہلا قریب ترین ہومولوگس (شکل 5) کی نمائندگی کرتا ہے جس نے 26 بی پی لمبا خطہ پیش کیا جو پوزیشن-40 اور-75 کے درمیان بہت محفوظ ہے، جسے (شکل 5) میں محفوظ ایم ای ایم ای موٹف کے طور پر نشان زد کیا گیا ہے، لیکن معروف ٹرانسکرپشن فیکٹر بائنڈنگ سائٹس میٹرکس سے کوئی خاص مماثلت قائم نہیں کی جا سکی۔ αr14 خاندان کے اتنے قریب سے متعلق ممبروں کا ایک گروپ محفوظ پروموٹروں کا دوسرا گروپ تشکیل دیا (شکل 6)۔ انہوں نے ایک مختلف پروموٹر ریجن پیش کیا، جو تمام اراکین میں بہت اچھی طرح سے محفوظ تھا اور ایک اضافی نامعلوم 20 بی پی موٹف۔ جینومک سیاق و سباق αr14 خاندان کے زیادہ تر اراکین کروموسومل آئی جی آر میں آزاد پروموٹروں سے نقل شدہ ٹرانس انکوڈڈ ایس آر این اے ہیں۔ بیج کی صف بندی کے اراکین کے بہت سے پڑوسی جینوں کی تشریح نہیں کی گئی تھی اور اس طرح انہیں مزید دستی طور پر تیار کیا گیا تھا۔ سینورہیزوبیم گروپ کے جینومز (ایس ایم آر 14 سی 2، ایس ایم آر 14 سی 3، ایس ایم ڈی آر 14 سی 1، ایس ایم ڈی آر 14 سی 2، ایس ایف آر 14 سی 1، ایس ایف آر 14 سی 2) میں ٹینڈم کاپیوں نے ایک محفوظ جینومک سیاق و سباق پیش کیا۔ جین کو اوپر کی طرف ڈومین DUF1127 پر مشتمل ایک نامعلوم پروٹین کے لیے کوڈ کیا گیا اور جین کو نیچے کی طرف ایک محرک عنصر کے لیے کوڈ کیا گیا۔ جزوی طور پر محفوظ جینومک سیاق و سباق، DUF1127 پروٹین اپ اسٹریم اور 5-keto-4-deoxyuronate isomerase ڈاون اسٹریم، Rhizobium گروپ Rlt1325r14p02، Rlvr14p11، Rlt2304r14p02، اور ReCIATr14A کی پلازمیڈک کاپیوں کے لیے پایا گیا۔ جزوی جینومک تحفظ کا ایک ایسا ہی معاملہ، DUF1127 پروٹین اپ اسٹریم اور tRNA (یوراسل-5-)-میتھائل ٹرانسفرس ڈاون اسٹریم، میسوریزوبیم پرجاتیوں کے معاملے میں پایا گیا، جس نے ایم لوٹی (Mlr14C1، Mlr14C2) اور M. سیسری (Mcr14C1، Mcr14C2) کی ٹینڈم کاپیاں بھی پیش کیں۔ بروسیلا اینتھروپی (اوار 14 سی آئی آئی 2) کے کروموسوم II میں دوسری کاپی اور بروسیلا گروپ میں کروموسوم I میں دوسری کاپی (بور 14 سی آئی 2، بی سی آر 14 سی آئی 2، بی ایم آر 14 سی آئی 2، بی ایس 1330 آر 14 سی آئی 2، بی ایم 16 ایم آر 14 سی آئی 1، بی اے ایس 19 آر 14 سی آئی 2، بی ایم 23457 آر 14 سی آئی 1، بی ایم ای اے _ اے 0934، برو اے بی 1 _ 0906، بی اے 19941 آر 14 سی آئی 2) کے لیے بھی یہی سیاق و سباق پایا گیا۔ ان تمام معاملات میں ایس آر این اے اپنے آئی جی آر میں ایک نقل کے طور پر ظاہر ہوئے۔ بی ایس 23445 آر 14 سی آئی 2، بی ایم آر 14 سی آئی 2، اور آر ایل وی آر 14 سی 2 نے نیچے کی طرف ٹی آر این اے (یوراسل-5-)-میتھائل ٹرانسفرس کے لیے جین کوڈنگ کا اشتراک کیا، لیکن اوپر کی طرف جین کوڈنگ کا اشتراک نہیں کیا۔ نتائج نے دو دیگر اچھی طرح سے محفوظ جینومک سیاق و سباق کو ظاہر کیا۔ ایک نیکوٹینک ایسڈ مونو نیوکلیوٹائڈ اڈینیلل ٹرانسفرس اپ اسٹریم کے لیے جین کوڈنگ کے ساتھ اور ایک مولیبڈینم اے بی سی ٹرانسپورٹر ڈاؤن اسٹریم کے لیے جین کوڈنگ کے ساتھ، جو اے ریڈیوبیکٹر جینوم (آر آر 14 سی آئی 3) میں اے آر 14 فیملی کی تیسری کاپی اور ریزوبیم گروپ جینومز (ری سی ایف این آر 14 سی 3، آر ایل ٹی 1325 آر 14 سی 3، آر ایل وی آر 14 سی 3، آر ایل ٹی 2304 آر 14 سی 3) میں مشترک ہے۔ دوسرا گروپ بروسیلس جینومز میں کروموسوم I میں پہلی کاپی سے تشکیل پاتا ہے جو ایل آر جی بی جھلی پروٹین کے لیے جین اپ اسٹریم کوڈنگ کا اشتراک کرتا ہے اور جین نیچے کی طرف الفا/بیٹا ہائیڈرولیز کے لیے کوڈنگ کا اشتراک کرتا ہے۔ اضافی فائلیں: اضافی فائل 1 اضافی فائل 2 اضافی فائل 3 اضافی فائل 4 اضافی فائل 5 اضافی فائل 6 اضافی فائل 7 اضافی فائل 8 اضافی فائل 9 اضافی فائل 10 اضافی فائل 11 حوالہ جات آر این اے