Αr35 RNA
αr35 بیکٹیریل چھوٹے غیر کوڈنگ آر این اے کا ایک خاندان ہے جس میں ہائفو مائکروبیلز آرڈر سے الفاپروٹوبیکٹیریا کے کم گروپ میں نمائندے ہیں۔ اس خاندان کا پہلا رکن (ایس ایم آر 35 بی) سنورہیزوبیم میلیلوٹی 1021 لوکس میں پایا گیا جو سمبائیوٹک پلازمیڈ بی (پی ایس آئی ایم بی) میں واقع ہے۔ مزید ہومیولوجی اور ڈھانچے کے تحفظ کے تجزیے نے دیگر پھلیوں کی علامتوں میں مکمل لمبائی والے ایس ایم آر بی 35 ہومیولوگس کی نشاندہی کی ہے (یعنی۔ Rhizobium leguminosarum bv.viciae، R. leguminosarum bv۔ ٹرائیفولی اور آر ایٹلی) کے ساتھ ساتھ بالترتیب انسانی اور پودوں کے پیتھوجینز بروسیلا اینتھروپی اور ایگروبیکٹیریم ٹیومیفیشینز میں۔ αr35 RNA انواع 139-142 nt لمبی ہیں (ٹیبل 1) اور ایک مشترکہ ثانوی ڈھانچہ کا اشتراک کرتی ہیں جس میں دو اسٹیم لوپس اور ایک اچھی طرح سے محفوظ rho آزاد ٹرمینیٹر (شکل 1، 2، 3) شامل ہیں۔ زیادہ تر αr35 نقل کو ٹرانس ایکٹنگ ایس آر این اے کے طور پر درج کیا جا سکتا ہے جس کا اظہار الفاپروٹوبیکٹیریل جینومز (شکل 5) کے بین جنیاتی علاقوں کے اندر آزاد ٹرانسکرپشن یونٹوں کے اچھی طرح سے طے شدہ پروموٹر علاقوں سے کیا گیا ہے۔ دریافت اور ساخت ایس ایم آر 35 بی ایس آر این اے کو سب سے پہلے ڈیل ویل اور دیگر نے حوالہ ایس میلیلوٹی 1021 تناؤ کے انٹرجینک علاقوں (آئی جی آر) میں کمپیوٹیشنل تقابلی جینومک نقطہ نظر کے نتیجے میں بیان کیا تھا۔ شمالی ہائبرڈائزیشن کے تجربات نے اس بات کی تصدیق کی کہ پیش گوئی شدہ ایس ایم آر 35 بی لوکس نے متوقع سائز کی ایک واحد نقل کا اظہار کیا، جو آزادانہ طور پر زندہ اور اینڈوسیمبیوٹک بیکٹیریا میں جمع ہوا۔ ٹی اے پی پر مبنی 5 '-آر اے سی ای تجربات نے ایس میلیلوٹی 1021 جینوم (http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi) میں 577,730 این ٹی پوزیشن پر مکمل لمبائی ایس ایم آر 35 بی ٹرانسکرپٹ کے ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ (ٹی ایس ایس) کی نقشہ سازی کی جبکہ 3'-اینڈ کو 577,868 این ٹی پوزیشن پر واقع سمجھا گیا جو ایک حقیقی رو-آزاد ٹرمینیٹر (شکل 5) کے یو ایس کے مسلسل حصے کے آخری باقیات سے ملتا جلتا ہے۔ ایس میلیلوٹی کے چھوٹے آر این اے فریکشن (50-350 این ٹی) کی حالیہ گہری ترتیب پر مبنی خصوصیت نے ایس ایم آر 35 بی (جسے یہاں ایس ایم ای ایل بی 053 کہا گیا ہے) کے اظہار کی مزید تصدیق کی، اور انو کے 5 '-اور 3'-سروں کو پہلے تجویز کردہ پوزیشنوں پر نقشہ بنایا۔ ایس ایم آر 35 بی کی نیوکلیوٹائڈ ترتیب کو ابتدائی طور پر آرفیم ڈیٹا بیس کے خلاف تلاش کرنے کے لیے استفسار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ہومیولوجی کی اس تلاش نے اس ڈیٹا بیس میں معلوم بیکٹیریل ایس آر این اے سے کوئی میل نہیں کھایا۔ اس کے بعد ایس ایم آر 35 بی کو اس وقت دستیاب تمام بیکٹیریل جینومز (20 اپریل 2011 کو 1,615 ترتیبات ؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ؛) کے خلاف ڈیفالٹ پیرامیٹرز کے ساتھ بلاسٹ کیا گیا۔ استفسار کی ترتیب (78-89% مماثلت) میں اہم ہم آہنگی ظاہر کرنے والے علاقوں کو انفیرنل (version1.0) (شکل 2) کا استعمال کرتے ہوئے بیج کی صف بندی سے کوویرینس ماڈل (CM) بنانے کے لیے نکالا گیا تھا۔ اس سی ایم کو موجودہ بیکٹیریل جینومک ڈیٹا بیس میں αr35 خاندان کے نئے اراکین کی مزید تلاش میں استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج کا دستی طور پر معائنہ کیا گیا تاکہ خاندان کے لیے متفقہ ثانوی ڈھانچے کا اندازہ لگایا جا سکے (شکل 1 اور شکل 2)۔ اتفاق رائے کے ڈھانچے کی بھی آزادانہ طور پر اسی طرح کی پیش گوئیوں کے ساتھ لوکارنیٹ پروگرام کے ساتھ پیش گوئی کی گئی تھی۔ انفیرنل کا استعمال کرتے ہوئے سی ایم کے ساتھ پائے جانے والے 84 ترتیبات کے دستی معائنے سے سات حقیقی ہومولوگ ترتیبات تلاش کرنے میں مدد ملی: ریزوبیم لیگیومینوسارم بی وی میں دو کاپیاں۔ ویکیہ (کروموسوم اور پلازمیڈ پی آر ایل 11)، ریزوبیم لیگیومینوسارمبیو میں دو کاپیاں۔ ٹرائیفولی ڈبلیو ایس ایم 1325 (پلاسمڈ پی آر 132504 اور پلاسمڈ پی آر 132502)، ریزوبیم ایٹلی سی ایف این 42 پلاسمڈ پی 42 ایف میں اور ایگروبیکٹیریم ٹیومیفیشینز اور بروسیلا اینتھروپی کے کروموسوم میں۔ ان تمام ترتیبات میں اہم انفیرنل ای ویلیوز (1.38e-33-1.05e-11) اور بٹ اسکور دکھائے گئے۔ ایس میلیلوٹی کے معاملے میں سمبائیوٹک پلاسمڈ پی سم بی (574630-574766) میں ایک دوسری کاپی کی نشاندہی ایک اہم ای-ویلیو (3.73e-07) کے ساتھ کی گئی تھی لیکن کسی بھی جانچ شدہ حالات (غیر شائع شدہ ڈیٹا) کے تحت کوئی اظہار نہیں پایا گیا ہے۔ ماڈل کے ساتھ پائے جانے والے باقی ترتیبات (8.76e-12 اور 1.e-3) کے درمیان اعلی ای-ویلیوز دکھاتے ہیں لیکن بہت کم بٹ اسکور، جو عام طور پر ریموٹ ہومولوگ کی علامت ہے۔ تاہم، ان معاملات کے دستی معائنے سے پتہ چلتا ہے کہ rho آزاد ٹرمینیٹر اور دوسرا اسٹیم واحد محفوظ علاقے تھے، جو پہلے اسٹیم میں ناکام رہے۔ اس دو تنے کی تعمیر کو بڑے پیمانے پر تمام الفاپروٹوبیکٹیریا میں بڑھایا گیا تھا، جسے خاص طور پر بروسیلا پرجاتیوں میں محفوظ کیا گیا تھا۔ اظہار کی معلومات ایس ایم آر 35 بی اظہار کا اندازہ سب سے پہلے ڈیل ویل اور دیگر نے کیا تھا۔ ایس میلیلوتی 1021 میں مختلف حیاتیاتی حالات کے تحت ؛ یعنی ٹی وائی میں بیکٹیریا کی نشوونما، کم سے کم میڈیم (ایم ایم) اور لیوٹولین-ایم ایم شوربے اور اینڈو سمبائیوٹک بیکٹیریا (یعنی۔ بالغ سمبائیوٹک الفالفا نوڈلز)۔ آزاد زندگی گزارنے والے بیکٹیریا میں ایس ایم آر 35 بی کا اظہار نشوونما پر منحصر پایا گیا، جب بیکٹیریا مستحکم مرحلے میں داخل ہوتے ہیں تو جین کو کم منظم کیا جاتا ہے۔ لیوٹولین کے ساتھ ایم ایم کی تکمیل، پلانٹ فلاون جو خاص طور پر ایس میلیلوٹی نوڈولیشن جینز کی نقل کو جنم دیتا ہے، نے ایس ایم آر 35 بی کے اظہار کو ~ 4 گنا تک متحرک کیا۔ اس کے برعکس، بالغ نوڈل ٹشوز میں ایس ایم آر 35 بی ٹرانسکرپٹ کا پتہ نہیں چلا۔ شلوٹر اور دیگر۔ اوسموٹک اپ شفٹ پر ایس ایم آر 35 بی کے اپ ریگولیشن کو مزید بیان کیا گیا۔ پروموٹر تجزیہ تمام αr35 لوکی میں قابل شناخت σ70 پر منحصر پروموٹر ہوتے ہیں جو-35/- 10 اتفاق رائے کا نقشہ سی ٹی ٹی اے جی اے سی-این 17-سی ٹی اے ٹی اے ٹی کو ظاہر کرتے ہیں جو پہلے الفاپروٹوبیکٹیریا میں کئی دیگر نسلوں کے درمیان وسیع پیمانے پر محفوظ دکھایا گیا تھا۔ ٹرانسکرپشن کے دیگر معروف عوامل کے لیے بائنڈنگ سائٹس کی شناخت کے لیے ہم نے ریگ پریڈیکشن (http://regpredict.lbl.gov/regpredict/help.html) کے فراہم کردہ فاسٹا سیکوینسز کا استعمال کیا، اور ریگولون ڈی بی (http://regulondb.ccg.unam.mx) کے فراہم کردہ پوزیشن ویٹ میٹرکس (پی ایس ڈبلیو ایم) کا استعمال کیا۔ ہم نے اتفاق رائے/پیٹرسر پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے ریگ پیشن گوئی کے سلسلے سے ہر نقل کے عنصر کے لیے پی ایس ڈبلیو ایم بنایا، 14 اور 30 کے درمیان موٹف لمبائی کے لیے بہترین حتمی میٹرکس کا انتخاب کرتے ہوئے اگر متعلقہ لمبائی پہلے بیان نہیں کی گئی تھی (ہر میٹرکس کے لیے "اتفاق رائے میٹرکس" کی حد (اوسط ای-ویلیو <10E-10) دیکھیں (http://gps-tools2.its.yale.edu میں "تھریشولڈ اتفاق رائے" دیکھیں)۔ مزید برآں، ہم نے ایم ای ایم ای (http://meme.sdsc.edu/meme4_6_1/intro.html) کا استعمال کرتے ہوئے محفوظ شدہ نامعلوم نقشوں کی تلاش کی اور آرام دہ باقاعدہ تاثرات (یعنی۔ پیٹرن میچنگ) تمام ایس ایم آر 35 بی ہومولوگس پروموٹرز پر۔ ٹی-این 11-اے موٹف کے ارد گرد بنایا گیا صرف ایک الٹا دہرایا ہوا ڈھانچہ ایس میلیلوٹی میں ایس ایم آر بی 35 کے ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹ کے اوپر کی طرف 55 این ٹی پایا گیا جو کہ معروف محفوظ نوڈ باکسز (شکل 4) کا ایک انحطاط شدہ موٹف ہے۔ اس خصوصیت کی ترتیب کو ایل آئی ایس آر قسم کے پروٹین کے لیے مخصوص بائنڈنگ سائٹ کے طور پر تجویز کیا گیا ہے۔ بیج ایس ایم آر بی 35 ہومولوگس کے تمام پروموٹر علاقوں نے بھی موٹف پیش کیا۔ جینومک سیاق و سباق αr35 خاندان کے زیادہ تر ممبران ٹرانس انکوڈڈ ایس آر این اے ہیں جو ریزبیئل میگاپلاسمڈز کے آئی جی آر میں آزاد پروموٹروں سے نقل کیے گئے ہیں۔ مستثنیات آر۔ لیگیومینوسارم بی وی کے ایس ایم آر بی 35 ہومیولوگس ہیں۔ ویکیہ (آر ایل وی آر 35 سی)، اور آر ایٹلی سی ایف این 42 پلاسمڈ پی 42 ایف (آر ای سی ایف این آر 35 ایف)، جو جزوی طور پر اوور لیپنگ او آر ایفز، اینوٹیٹڈ جینز کے مخالف اسٹرینڈ میں انکوڈ ہوتے ہیں۔ ان اوور لیپنگ او آر ایف کی پیش گوئی شدہ پروٹین مصنوعات کو امینو ایسڈ سیکوینس ہومیولوجی کی بنیاد پر کسی بھی فعال زمرے میں تفویض نہیں کیا جا سکا۔ اس طرح، یہ αr35 ممبران تخیلاتی سی آئی ایس-انکوڈڈ اینٹی سینس ایس آر این اے ہیں۔ ٹرانس-انکوڈڈ αr35 sRNAs کے جینومک علاقے جزوی تحفظ کی نمائش کرتے ہیں جو بنیادی طور پر sRNA-کوڈنگ ترتیب اور ایک فلینکنگ جین تک محدود ہے۔ αr35 لوکی کے زیادہ تر فلینکنگ جین ٹرانسکرپشن کے عوامل اور نائٹروجن اور گلوٹامین میٹابولزم سے متعلق پروٹین کو انکوڈ کرتے ہیں۔ حوالہ جات آر این اے