Reversed-phase chromatography
ریورسڈ فیز لیکویڈ کرومیٹوگرافی (آر پی-ایل سی) مائع کرومیٹوگرافی کا ایک طریقہ ہے جس میں غیر قطبی اسٹیشنری فیز اور قطبی متحرک فیز نامیاتی مرکب کو الگ کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ حالیہ برسوں میں ہائی پرفارمنس لیکویڈ کرومیٹوگرافی-ایچ پی ایل سی کا استعمال کرتے ہوئے علیحدگی اور تجزیہ کی اکثریت ریورسڈ فیز موڈ کا استعمال کرتے ہوئے کی جاتی ہے۔ ریورسڈ فیز موڈ میں، نمونے کے اجزاء کو نظام میں برقرار رکھا جاتا ہے، وہ جتنے زیادہ ہائیڈروفوبک ہوتے ہیں۔ ریورسڈ فیز کرومیٹوگرافک سسٹم میں سالیوٹس کے برقرار رکھنے اور علیحدگی کو متاثر کرنے والے عوامل مندرجہ ذیل ہیں: a. مستحکم مرحلے کی کیمیائی نوعیت، یعنی اس کی سطح پر بندھے ہوئے لگینڈس کے ساتھ ساتھ ان کے بندھن کی کثافت، یعنی ان کی کوریج کی حد۔ ب۔ موبائل مرحلے کی ساخت۔ بلک سالوینٹس کی قسم جن کے مرکب متحرک مرحلے کی قطعیت کو متاثر کرتے ہیں، اس لیے متحرک مرحلے کی قطعیت کو متاثر کرنے کے لیے سالوینٹ کے لیے نام تبدیل کرنے والا شامل کیا جاتا ہے۔ ج۔ اضافی اشیاء، جیسے بفر، متحرک مرحلے کے پی ایچ کو متاثر کرتے ہیں، جو سالیوٹس کی آئنائزیشن کی حالت اور ان کی قطعیت کو متاثر کرتے ہیں۔ مرکب میں نامیاتی اجزاء کو برقرار رکھنے کے لیے، کالموں کے اندر پیک کیے گئے مستحکم مراحل، ایک ہائیڈروفوبک سبسٹریٹس پر مشتمل ہوتے ہیں، جو مختلف جیومیٹریز (کروی، بے قاعدہ) میں سوراخ دار سلیکا جیل کے ذرات کی سطح سے جڑے ہوتے ہیں، مختلف قطر (ذیلی-2، 3، 5، 7، 10 ام) پر، مختلف سوراخ کے قطر (60، 100، 150، 300، اے) کے ساتھ۔ ذرہ کی سطح کیمیائی طور پر بندھے ہوئے ہائیڈرو کاربن سے ڈھکی ہوتی ہے، جیسے کہ C3، C4، C8، C18 اور بہت کچھ۔ اسٹیشنری مرحلے سے وابستہ ہائیڈرو کاربن جتنا لمبا ہوگا، نمونے کے اجزاء اتنے ہی لمبے عرصے تک برقرار رہیں گے۔ کچھ مستحکم مراحل ہائیڈروفوبک پولیمرک ذرات، یا ہائبرڈائزڈ سلیکا نامیاتی گروپوں کے ذرات سے بھی بنے ہوتے ہیں، جس طریقے کے لیے انتہائی پی ایچ پر متحرک مراحل استعمال کیے جاتے ہیں۔ بائیو میڈیکل مواد کو الگ کرنے کے زیادہ تر موجودہ طریقے سی-18 کالموں کا استعمال کرتے ہیں، جنہیں بعض اوقات تجارتی ناموں سے بھی پکارا جاتا ہے، جیسے کہ او ڈی ایس (آکٹاڈیسلسلین) یا آر پی-18۔ متحرک مراحل پانی اور قطبی نامیاتی سالوینٹس کے مرکب ہیں، جن میں سے اکثریت میتھانول اور ایسیٹونیٹرل ہیں۔ ان مرکب میں عام طور پر مختلف اضافی اشیاء جیسے بفر (ایسیٹیٹ، فاسفیٹ، سائٹریٹ)، اور/یا سرفیکٹینٹ (الکائل امینز یا الکائل سلفونٹس) اور/یا خصوصی اضافی اشیاء (ای ڈی ٹی اے) ہوتے ہیں۔ کسی نہ کسی قسم کے سپلیمنٹس کا استعمال کرنے کا مقصد کارکردگی اور/یا انتخاب کو بڑھانا، اور سالیوٹ برقرار رکھنے کو کنٹرول کرنا ہے۔ اسٹیشنری مراحل میجرز، ڈولن، کار اور سنائڈر کے ایک مضمون میں تفصیلات میں بیان کردہ ریورسڈ فیز اسٹیشنری مراحل کی تاریخ اور ارتقاء 1970 کی دہائی میں، زیادہ تر مائع کرومیٹوگرافی رن ٹھوس ذرات کو اسٹیشنری مراحل کے طور پر استعمال کرتے ہوئے انجام دی گئیں، جو غیر تبدیل شدہ سلیکا جیل یا ایلومینیم سے بنی تھیں۔ اس قسم کی تکنیک کو اب نارمل فیز کرومیٹوگرافی کہا جاتا ہے۔ چونکہ اس تکنیک میں مستحکم مرحلہ ہائیڈروفیلک ہے، اور متحرک مرحلہ ایک قطبی تھا، جو ہیکسین اور ہیپٹین جیسے غیر قطبی نامیاتی سالوینٹس پر مشتمل تھا، اس لیے نمونے میں ہائیڈروفیلک خصوصیات والے حیاتیاتی سالمات کا مستحکم مرحلے سے زیادہ تعلق تھا، اس لیے وہ اسے مضبوطی سے جذب کرتے ہیں۔ مزید برآں، وہ متحرک مرحلے کے سالوینٹس میں آسانی سے تحلیل نہیں ہوئے تھے۔ ایک ہی وقت میں ہائیڈروفوبک مالیکیول قطبی اسٹیشنری مرحلے سے کم وابستگی کا تجربہ کرتے ہیں، اور کافی برقرار نہ رہنے کے ساتھ اس کے ذریعے جلدی نکل جاتے ہیں۔ یہی وجوہات تھیں کہ 1970 کی دہائی کے دوران سلیکا پر مبنی ذرات کو ہائیڈرو کاربن کے ساتھ علاج کیا گیا، ان کی سطح پر متحرک یا بند کیا گیا، اور متحرک مراحل کو حیاتیاتی طبی مادوں کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے آبی اور قطبی نوعیت میں تبدیل کر دیا گیا۔ ہائیڈروفوبک اسٹیشنری فیز اور پولر موبائل فیز کا استعمال بنیادی طور پر عام فیز کرومیٹوگرافی کے برعکس ہے، کیونکہ موبائل اور اسٹیشنری فیز کی قطعیت الٹ گئی ہے-اس لیے اصطلاح الٹا فیز کرومیٹوگرافی ہے۔ نتیجے کے طور پر، قطبی متحرک مرحلے میں ہائیڈروفوبک مالیکیول ہائیڈروفوبک اسٹیشنری مرحلے میں جذب ہوتے ہیں، اور نمونے میں ہائیڈروفیلک مالیکیول کالم سے گزرتے ہیں اور پہلے خارج ہوتے ہیں۔ نامیاتی (غیر قطبی) سالوینٹ کا استعمال کرتے ہوئے متحرک مرحلے کی قطعیت کو کم کرکے ہائیڈروفوبک مالیکیولز کو کالم سے نکالا جا سکتا ہے، جو ہائیڈروفوبک تعاملات کو کم کرتا ہے۔ مالیکیول جتنا زیادہ ہائیڈروفوبک ہوگا، اتنا ہی زیادہ مضبوطی سے یہ اسٹیشنری مرحلے سے جڑا رہے گا، اور نامیاتی سالوینٹ کا ارتکاز اتنا ہی زیادہ ہوگا جو مالیکیول کو نکالنے کے لیے درکار ہوگا۔ کرومیٹوگرافی کے نظریہ کے بہت سے ریاضیاتی پیرامیٹرز اور دیگر کرومیٹوگرافک طریقوں میں استعمال ہونے والے تجرباتی تحفظات آر پی-ایل سی پر بھی لاگو ہوتے ہیں (مثال کے طور پر، سلیکٹیوٹی فیکٹر، کرومیٹوگرافک ریزولوشن، پلیٹ کاؤنٹ وغیرہ)۔ اسے مختلف قسم کے مالیکیولز کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ عام طور پر پروٹین کو الگ کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے، کیونکہ نارمل فیز کرومیٹوگرافی میں استعمال ہونے والے نامیاتی سالوینٹس بہت سے پروٹین کو خراب کر سکتے ہیں۔ آج، آر پی-ایل سی ایک اکثر استعمال ہونے والی تجزیاتی تکنیک ہے۔ آر پی-ایل سی میں استعمال کے لیے اسٹیشنری مراحل کی بہت بڑی اقسام دستیاب ہیں، جو علیحدگی کے طریقوں کی ترقی میں بہت زیادہ لچک کی اجازت دیتی ہیں۔ سلیکا پر مبنی اسٹیشنری مراحل سلیکا جیل کے ذرات عام طور پر ہائی پرفارمنس لیکویڈ کرومیٹوگرافی (ایچ پی ایل سی) میں کئی وجوہات کی بناء پر ایک اسٹیشنری مرحلے کے طور پر استعمال ہوتے ہیں، جن میں شامل ہیں: ہائی سرفیس ایریا: سلیکا جیل کے ذرات کا سطح کا رقبہ زیادہ ہوتا ہے، جو سالیوٹس کے ساتھ براہ راست تعامل کی اجازت دیتا ہے یا نمونے کے مالیکیولز کے ساتھ ورسٹائل تعاملات کے لیے مختلف قسم کے لگینڈز کے بندھن کے بعد، بہتر علیحدگی کا باعث بنتا ہے۔ کیمیائی اور تھرمل استحکام اور جمود: سلیکا جیل کیمیائی طور پر مستحکم ہے، کیونکہ یہ عام طور پر نہ تو متحرک مرحلے کے سالوینٹس کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے اور نہ ہی مرکبات کو الگ کرتا ہے، جس کے نتیجے میں درست، بار بار اور قابل اعتماد تجزیہ ہوتا ہے۔ وسیع اطلاق: سلیکا جیل ورسٹائل ہے اور اسے مختلف فنکشنل گروپوں کے ساتھ تبدیل کیا جا سکتا ہے، جس سے یہ تجزیہ کاروں اور ایپلی کیشنز کی وسیع رینج کے لیے موزوں ہوتا ہے۔ موثر علیحدگی: سلیکا جیل کے ذرات کی منفرد خصوصیات، ان کے اعلی سطح کے رقبے اور کنٹرول شدہ اوسط ذرہ قطر کے سوراخ کے سائز کے ساتھ مل کر، ایچ پی ایل سی میں مرکبات کی موثر اور درست علیحدگی میں سہولت فراہم کرتی ہیں۔ تولیدی صلاحیت: سلیکا جیل کے ذرات اعلی بیچ سے بیچ تولیدی صلاحیت پیش کر سکتے ہیں، جو دہائیوں کے دوران مستقل اور قابل اعتماد ایچ پی ایل سی تجزیہ کے لیے اہم ہے۔ ذرہ قطر اور سوراخ کے سائز کا کنٹرول: سلیکا جیل کو مخصوص سوراخ کے سائز کے لیے تیار کیا جا سکتا ہے، جو سالماتی سائز کی بنیاد پر علیحدگی پر درست کنٹرول کو قابل بناتا ہے۔ لاگت سے موثر: سلیکا زمین پر سب سے زیادہ وافر مقدار میں موجود عنصر ہے، اس لیے اس کا جیل ایچ پی ایل سی ایپلی کیشنز کے لیے ایک لاگت سے موثر انتخاب ہے، جس کی وجہ سے اسے لیبارٹریوں میں بڑے پیمانے پر اپنایا جاتا ہے۔ یونائیٹڈ سٹیٹس فارماکوپیا (یو ایس پی) نے ایچ پی ایل سی کالموں کو ایل #اقسام کے لحاظ سے درجہ بند کیا ہے۔ اس درجہ بندی میں سب سے زیادہ مقبول کالم ایک آکٹاڈیسل کاربن چین (C18)-بانڈڈ سلیکا (USP درجہ بندی L1) ہے۔ اس کے بعد سی 8 بانڈڈ سلیکا (ایل 7)، خالص سلیکا (ایل 3)، سائانو بانڈڈ سلیکا (سی این) (ایل 10) اور فینائل بانڈڈ سلیکا (ایل 11) آتے ہیں۔ نوٹ کریں کہ C18، C8 اور فینائل وقف شدہ الٹے مرحلے کے اسٹیشنری مراحل ہیں، جبکہ CN کالموں کو تجزیہ اور موبائل مرحلے کے حالات کے لحاظ سے الٹے مرحلے کے موڈ میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔ تمام C18 کالموں میں برقرار رکھنے کی خصوصیات ایک جیسی نہیں ہوتی ہیں۔ سلیکا کی سرفیس فنکشنلائزیشن ایک مونومیرک یا پولیمرک رد عمل میں مختلف شارٹ چین آرگنسیلینز کے ساتھ کی جا سکتی ہے جو دوسرے مرحلے میں بقیہ سلانول گروپس (اینڈ کیپنگ) کا احاطہ کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ اگرچہ مجموعی طور پر برقرار رکھنے کا طریقہ کار یکساں رہتا ہے، لیکن مختلف مستحکم مراحل کی سطح کی کیمسٹریوں میں ٹھیک ٹھیک فرق انتخاب میں تبدیلیوں کا باعث بنے گا۔ جدید کالموں میں مختلف قطبیت ہوتی ہے جو کہ مستحکم مرحلے سے منسلک لگینڈ پر منحصر ہوتی ہے۔ پی ایف پی پینٹافلوورفینائل ہے۔ سی این سیانو ہے۔ NH2 امینو ہے۔ او ڈی ایس آکٹاڈیسل یا سی 18 ہے۔ او ڈی سی این ایک مخلوط موڈ کالم ہے جو سی 18 اور نائٹریل پر مشتمل ہے۔ مائع کرومیٹوگرافی (ایل سی) کے لیے کرومیٹوگرافک سپورٹ اور آلات میں حالیہ پیش رفت مختلف مستحکم مراحل جیومیٹریز کا استعمال کرتے ہوئے تیز رفتار اور انتہائی موثر علیحدگی کو آسان بناتی ہے۔ مختلف تجزیاتی حکمت عملیاں تجویز کی گئی ہیں، جیسے کہ سلیکا پر مبنی مونولیتھک سپورٹس کا استعمال، موبائل مرحلے کے درجہ حرارت میں اضافہ، اور ذیلی-3 مائیکرو میٹر سطحی طور پر سوراخ دار ذرات (فیوزڈ یا ٹھوس کور) یا ذیلی-2 مائیکرو میٹر مکمل طور پر سوراخ دار ذرات سے بھرے کالم الٹرا ہائی پریشر ایل سی سسٹمز (یو ایچ پی ایل سی) میں استعمال کے لیے۔ موبائل فیز ریورسڈ فیز کرومیٹوگرافی میں موبائل فیز سلیکشن کے جدید رجحانات اور بہترین طریقوں پر ایک جامع مضمون بوئز اور ڈونگ نے شائع کیا تھا۔ ریورسڈ فیز کرومیٹوگرافی میں ایک متحرک مرحلہ پانی یا آبی بفرز کے مرکب پر مشتمل ہوتا ہے، جس میں نامیاتی سالوینٹس شامل کیے جاتے ہیں، تاکہ انتخابی انداز میں ریورسڈ فیز کالم سے تجزیہ کیا جا سکے۔ اضافی نامیاتی سالوینٹس پانی کے ساتھ غلط ہونے چاہئیں، اور استعمال ہونے والے دو سب سے عام نامیاتی سالوینٹس ایسیٹونیٹریل، میتھانول ہیں۔ دیگر سالوینٹس بھی استعمال کیے جا سکتے ہیں جیسے ایتھنول یا 2-پروپینول (آئسوپروپائل الکحل) اور ٹیٹرا ہائیڈروفوران (ٹی ایچ ایف)۔ نامیاتی سالوینٹ کو موڈیفایر بھی کہا جاتا ہے، کیونکہ اسے متحرک مرحلے کی قطعیت میں ترمیم کرنے کے لیے متحرک مرحلے میں آبی محلول میں شامل کیا جاتا ہے۔ ریورسڈ فیز موبائل فیز میں پانی سب سے زیادہ قطبی سالوینٹ ہے، لہذا، موڈیفائرز کو شامل کرکے موبائل فیز کی قطعیت کو کم کرنے سے اس کی ایلیوشن طاقت میں اضافہ ہوتا ہے۔ دو سب سے زیادہ استعمال ہونے والے نامیاتی ترمیم کنندگان ایسیٹونیٹریل اور میتھانول ہیں، حالانکہ ایسیٹونیٹریل زیادہ مقبول انتخاب ہے۔ اسوپروپینول (2-پروپینول) کو اس کی مضبوط ایلیوٹنگ خصوصیات کی وجہ سے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے، لیکن اس کا استعمال اس کی اعلی چپچپا پن کی وجہ سے محدود ہے، جس کے نتیجے میں بیک پریشر زیادہ ہوتا ہے۔ ایسیٹونیٹریل اور میتھانول دونوں آئسوپروپینول سے کم چپچپا ہوتے ہیں، حالانکہ 50:50 ٪ میتھانول کا مرکب: پانی بھی بہت چپچپا ہوتا ہے اور بیک پریشر کا سبب بنتا ہے۔ تینوں سالوینٹس بنیادی طور پر یو وی شفاف ہیں۔ یہ عام الٹے مرحلے کی کرومیٹوگرافی کے لیے ایک اہم خاصیت ہے کیونکہ نمونے کے اجزاء کا پتہ عام طور پر یو وی ڈٹیکٹرز کے ذریعے لگایا جاتا ہے۔ ایسیٹونیٹریل کم یووی طول موج کی حد میں دوسروں کے مقابلے میں زیادہ شفاف ہے، لہذا یہ تقریبا خصوصی طور پر اس وقت استعمال ہوتا ہے جب کمزور یا بغیر کروموفورز (یووی-وی آئی ایس جذب کرنے والے گروپ) والے مالیکیولز کو الگ کیا جاتا ہے، جیسے پیپٹائڈز۔ زیادہ تر پیپٹائڈز صرف الٹرا وایلیٹ سپیکٹرم (عام طور پر 225 این ایم سے کم) میں کم طول موج پر جذب ہوتے ہیں اور ایسیٹونیٹریل دوسرے عام سالوینٹس کے مقابلے میں کم طول موج پر بہت کم پس منظر جذب فراہم کرتا ہے۔ متحرک مرحلے کا پی ایچ تجزیہ کار کو برقرار رکھنے میں اہم کردار ادا کر سکتا ہے اور بعض تجزیہ کاروں کے انتخاب کو تبدیل کر سکتا ہے۔ آئنائزڈ فنکشنل گروپوں والے سالیوٹس پر مشتمل نمونوں کے لیے، جیسے کہ امینز، کاربوکسائلز، فاسفیٹس، فاسفونٹس، سلفیٹس، اور سلفونٹس، ان گروپوں کی آئنائزیشن کو موبائل فیز بفرز کا استعمال کرتے ہوئے کنٹرول کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، سالیوٹس میں کارباکسیلک گروپ تیزی سے منفی طور پر چارج ہو جاتے ہیں کیونکہ موبائل مرحلے کا پی ایچ ان کے پی کے اے سے اوپر بڑھتا ہے، اس لیے پورا مالیکیول زیادہ قطبی ہو جاتا ہے اور اے-پولر اسٹیشنری مرحلے پر کم برقرار رہتا ہے۔ اس صورت میں، فیز موبائل کے پی ایچ کو 4-5 = پی ایچ سے اوپر اٹھانا (جو کاربوکسلک گروپوں کے لیے عام پی کے اے رینج ہے) ان کی آئنائزیشن کو بڑھاتا ہے، اس لیے ان کی برقرار رکھنے میں کمی آتی ہے۔ اس کے برعکس، 4 سے کم پی ایچ پر متحرک مرحلے کا استعمال ان کے برقرار رکھنے میں اضافہ کرے گا، کیونکہ اس سے ان کی آئنائزیشن کی ڈگری کم ہو جائے گی، جس سے وہ کم قطبی ہو جائیں گے۔ یہی خیالات بنیادی فعال گروپوں پر مشتمل مادوں پر لاگو ہوتے ہیں، جیسے کہ امینز، جن کی پی کے اے کی حدود تقریبا 8 اور اس سے زیادہ ہوتی ہیں، زیادہ برقرار رہتی ہیں، جیسے جیسے موبائل مرحلے کا پی ایچ بڑھتا ہے، 8 اور اس سے اوپر پہنچتا ہے، کیونکہ وہ کم آئنائزڈ ہوتے ہیں، اس لیے کم قطبی ہوتے ہیں۔ تاہم، اعلی پی ایچ موبائل مراحل کے معاملے میں، زیادہ تر روایتی سلیکا جیل پر مبنی ریورسڈ فیز کالم عام طور پر پی ایچ 8 اور اس سے اوپر کے موبائل مراحل کے ساتھ استعمال کے لیے محدود ہوتے ہیں، لہذا، اس حد میں امینوں کے برقرار رکھنے پر کنٹرول محدود ہے۔ بفر قسم کا انتخاب آر پی-ایل سی طریقہ کار کی ترقی میں ایک اہم عنصر ہے، کیونکہ یہ دلچسپی کے تجزیہ کاروں کے برقرار رکھنے، انتخاب اور حل کو متاثر کر سکتا ہے۔ آر پی-ایچ پی ایل سی کے لیے بفر کا انتخاب کرتے وقت، غور کرنے کے لیے کئی عوامل ہیں، جن میں شامل ہیں: موبائل مرحلے کا مطلوبہ پی ایچ: بفر ان کی پی کے اے ویلیو کے ارد گرد سب سے زیادہ موثر ہوتے ہیں، اس لیے پی کے اے کے ساتھ ایک بفر کا انتخاب کرنا ضروری ہے جو مطلوبہ موبائل مرحلے کے پی ایچ کے قریب ہو۔ نامیاتی سالوینٹ میں بفر کی گھلنشیلتا: بفر کو متحرک مرحلے میں استعمال ہونے والے نامیاتی سالوینٹ کے ساتھ مطابقت رکھتا ہونا چاہیے، زیادہ تر اوپر بیان کردہ عام نامیاتی سالوینٹس، ایسیٹونیٹریل، میتھانول اور اسوپروپینول کے ساتھ۔ بفر کا یو وی کٹ آف: یو وی کا پتہ لگانے کی صورت میں، بفر میں یو وی جذب ہونا چاہیے جو دلچسپی کے تجزیہ کاروں کی پتہ لگانے والی طول موج سے نیچے ہو۔ یہ بفر کو اس تجزیہ کاروں کا پتہ لگانے میں مداخلت کرنے سے روکے گا۔ ڈٹیکٹر کے ساتھ بفر کی مطابقت: اگر ماس سپیکٹرومیٹری (ایم ایس) کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا رہا ہے، تو بفر ماس سپیکٹرومیٹری (ایم ایس) آلے کے ساتھ مطابقت رکھتا ہونا چاہیے۔ کچھ بفر، جیسے کہ فاسفیٹ نمکیات پر مشتمل، ایم ایس ڈٹیکٹرز کے ساتھ استعمال نہیں کیے جا سکتے، کیونکہ وہ ضرورت کے مطابق غیر مستحکم نہیں ہوتے ہیں، اور وہ اینالائٹس آئنائزیشن کو دبا کر ایم ایس کا پتہ لگانے میں مداخلت کرتے ہیں، جس کی وجہ سے ان کا ایم ایس کے ذریعے پتہ نہیں چل پاتا ہے۔ آر پی-ایچ پی ایل سی میں استعمال ہونے والے کچھ سب سے عام بفرز میں شامل ہیں: فاسفیٹ بفر: فاسفیٹ بفر ورسٹائل ہے اور اسے 3 پی کے اے اقدار کی بدولت پی ایچ اقدار کی ایک وسیع رینج حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ان میں یو وی کا پتہ لگانے کے لیے بہت کم یو وی پس منظر بھی ہوتا ہے۔ تاہم، وہ ایم ایس کا پتہ لگانے کے لیے موزوں نہیں ہیں۔ ایسیٹیٹ بفر: ایسیٹیٹ بفر بھی ورسٹائل ہوتے ہیں اور عام طور پر آر پی-ایل سی میں استعمال ہونے والی پی ایچ اقدار کی حد حاصل کرنے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ ذیلی 220 این ایم طول موج پر یو وی کا پتہ لگانے کے لحاظ سے، یہ اتنا سازگار نہیں ہے۔ امونیم ایسیٹیٹ بفر ایم ایس کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔ فارمیٹ بفر: فارمیٹ بفر استعمال شدہ پی ایچ کی حد اور 225 این ایم کے تحت محدود یو وی پتہ لگانے کے لحاظ سے ایسیٹیٹ بفر سے ملتا جلتا ہے۔ اس کا امونیم ایسیٹیٹ بھی ایم ایس کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔ امونیم بفر: امونیم بفر اتار چڑھاؤ والے ہوتے ہیں اور اکثر ایل سی-ایم ایس طریقوں میں استعمال ہوتے ہیں۔ وہ کم یووی پتہ لگانے کے لیے بھی محدود ہیں۔ چارج شدہ تجزیہ کاروں کو آئن جوڑی (جسے آئن تعامل بھی کہا جاتا ہے) کے استعمال سے الٹے مرحلے والے کالم پر الگ کیا جا سکتا ہے۔ اس تکنیک کو ریورس فیز آئن پیئرنگ کرومیٹوگرافی کے نام سے جانا جاتا ہے۔ ایلیوشن کو آئسوکریٹک طور پر انجام دیا جا سکتا ہے (پانی کے سالوینٹ کی ساخت علیحدگی کے عمل کے دوران تبدیل نہیں ہوتی) یا حل کے میلان کا استعمال کرکے (پانی کے سالوینٹ کی ساخت علیحدگی کے عمل کے دوران تبدیل ہوتی ہے، عام طور پر قطعیت کو کم کرکے)۔ آبی نارمل فیز کرومیٹوگرافی حوالہ جات بیرونی لنکس ٹیبلز مختلف قسم کے الٹے مراحل کا خلاصہ، اور فنکشنلائزیشن کے عمل کرومیٹوگرافی کے بارے میں معلومات بھی دیکھیں۔