Bisulfite sequencing
بیسولفائٹ سیکوینسنگ (جسے بیسولفائٹ سیکوینسنگ بھی کہا جاتا ہے) میتھیلیشن کے نمونے کا تعین کرنے کے لیے معمول کی ترتیب سے پہلے ڈی این اے کے بیسولفائٹ علاج کا استعمال ہے۔ ڈی این اے میتھیلیشن پہلا دریافت شدہ ایپیجینیٹک نشان تھا، اور اب بھی سب سے زیادہ مطالعہ شدہ ہے۔ جانوروں میں اس میں بنیادی طور پر ڈینیوکلیوٹائڈ سی پی جی کے سائٹوسین کے باقیات کی کاربن-5 پوزیشن میں میتھائل گروپ کا اضافہ شامل ہوتا ہے، اور یہ نقل و حمل کی سرگرمی کے جبر میں ملوث ہوتا ہے۔ بیسلفائٹ کے ساتھ ڈی این اے کا علاج سائٹوسین کے باقیات کو یوراسل میں تبدیل کر دیتا ہے، لیکن 5-میتھائلسیٹوسین کے باقیات کو غیر متاثر کر دیتا ہے۔ لہذا، جس ڈی این اے کا بیسلفائٹ کے ساتھ علاج کیا گیا ہے وہ صرف میتھیلیٹیڈ سائٹوسین کو برقرار رکھتا ہے۔ اس طرح، بیسلفائٹ علاج ڈی این اے کی ترتیب میں مخصوص تبدیلیاں متعارف کراتا ہے جو انفرادی سائٹوسین کے باقیات کی میتھیلیشن کی حیثیت پر منحصر ہوتی ہیں، جس سے ڈی این اے کے ایک حصے کی میتھیلیشن کی حیثیت کے بارے میں سنگل نیوکلیوٹائڈ ریزولوشن کی معلومات حاصل ہوتی ہیں۔ اس معلومات کو دوبارہ حاصل کرنے کے لیے تبدیل شدہ ترتیب پر مختلف تجزیے کیے جا سکتے ہیں۔ اس لیے اس تجزیے کا مقصد بیسلفائٹ کے تبادلے (شکل 1) کے نتیجے میں واحد نیوکلیوٹائڈ پولیمرفزم (سائٹوسینز اور تھائمیڈین) کے درمیان فرق کرنے تک کم ہو جاتا ہے۔ طریقہ بیسلفائٹ کی ترتیب سی پی جی ڈینیوکلیوٹائڈز پر میتھیلیشن کی حیثیت کا تعین کرنے کے لیے بیسلفائٹ سے علاج شدہ جینومک ڈی این اے پر معمول کی ترتیب کے طریقوں کا اطلاق کرتی ہے۔ دیگر غیر ترتیب کی حکمت عملی بھی مخصوص لوکی پر یا جینوم وسیع سطح پر میتھیلیشن سے پوچھ گچھ کے لیے استعمال کی جاتی ہیں۔ تمام حکمت عملیاں یہ فرض کرتی ہیں کہ بائیسلفائٹ کی وجہ سے غیر میتھیلیٹیڈ سائٹوسینز کی یوراسل میں تبدیلی مکمل ہو چکی ہے، اور یہ بعد کی تمام تکنیکوں کی بنیاد کے طور پر کام کرتی ہے۔ مثالی طور پر، استعمال کیا جانے والا طریقہ ہر ایلیل کے لیے میتھیلیشن کی حیثیت کا الگ سے تعین کرے گا۔ بیسولفائٹ کی ترتیب کے متبادل طریقوں میں مشترکہ بیسولفائٹ پابندی کا تجزیہ اور میتھیلیٹڈ ڈی این اے امیونوپریسیپیٹیشن (ایم ای ڈی آئی پی) شامل ہیں۔ بیسلفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے کا تجزیہ کرنے کے طریقے مسلسل تیار کیے جا رہے ہیں۔ ان تیزی سے بدلتے ہوئے طریقوں کا خلاصہ کرنے کے لیے، متعدد جائزے کے مضامین لکھے گئے ہیں۔ طریقہ کار کو عام طور پر میتھیلیشن مخصوص پی سی آر (ایم ایس پی) (شکل 4) پر مبنی حکمت عملیوں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے، اور پولیمرس چین ری ایکشن (پی سی آر) کو استعمال کرنے والی حکمت عملیوں کو غیر میتھیلیشن مخصوص حالات (شکل 3) کے تحت انجام دیا جاتا ہے۔ مائیکرو ارے پر مبنی طریقے غیر میتھیلیشن مخصوص حالات کی بنیاد پر بھی پی سی آر کا استعمال کرتے ہیں۔ غیر میتھیلیشن مخصوص پی سی آر پر مبنی طریقے براہ راست ترتیب بیسولفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے کا استعمال کرتے ہوئے میتھیلیشن تجزیہ کے پہلے رپورٹ شدہ طریقہ میں پی سی آر اور معیاری ڈائیڈوکسینوکلیوٹائڈ ڈی این اے ترتیب کا استعمال کیا گیا تاکہ بائیسلفائٹ تبدیلی کے خلاف مزاحم نیوکلیوٹائڈز کا براہ راست تعین کیا جا سکے۔ پرائمرز کو اسٹرینڈ مخصوص ہونے کے ساتھ ساتھ بیسولفائٹ مخصوص ہونے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے (یعنی، غیر سی پی جی سائٹوسینز پر مشتمل پرائمرز جیسے کہ وہ غیر بیسولفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے کی تکمیل نہیں کرتے ہیں)، دلچسپی کے میتھیلیشن سائٹ کو فلیکنگ (لیکن شامل نہیں) کرتے ہیں۔ لہذا، یہ میتھیلیشن مخصوص پی سی آر کے برعکس میتھیلیٹڈ اور غیر میتھیلیٹڈ دونوں ترتیبات کو بڑھائے گا۔ غیر میتھلیٹڈ سائٹوسینز کی تمام سائٹس کو سینس اسٹرینڈ کے نتیجے میں بڑھے ہوئے ترتیب میں تھائمینز کے طور پر، اور بڑھے ہوئے اینٹی سینس اسٹرینڈ میں اڈینائنز کے طور پر دکھایا جاتا ہے۔ پی سی آر پرائمرز میں ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ اڈاپٹرز کو شامل کرکے، پی سی آر مصنوعات کو بڑے پیمانے پر متوازی ترتیب کے ساتھ ترتیب دیا جا سکتا ہے۔ متبادل طور پر، اور محنت سے بھرپور، پی سی آر پروڈکٹ کو کلون اور ترتیب دیا جا سکتا ہے۔ سیکوینسنگ کے لیے پروڈکٹ کو بڑھانے کے لیے نیسٹڈ پی سی آر طریقوں کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ بیسلفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے کا استعمال کرتے ہوئے اس کے بعد کی تمام ڈی این اے میتھیلیشن تجزیہ تکنیک فرومر اور دیگر کی اس رپورٹ پر مبنی ہیں۔ (شکل 2)۔ اگرچہ زیادہ تر دوسرے طریقے درست ترتیب پر مبنی تکنیک نہیں ہیں، لیکن "بیسولفائٹ ترتیب" کی اصطلاح اکثر بیسولفائٹ میں تبدیلی ڈی این اے میتھیلیشن تجزیہ کی تکنیکوں کو عام طور پر بیان کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ میتھیلیشن مخصوص پی سی آر کا استعمال کیے بغیر بائیسلفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے کا تجزیہ کرنے کے لیے بھی پائروسیکوینسنگ پائروسیکوینسنگ کا استعمال کیا گیا ہے۔ دلچسپی کے علاقے کی پی سی آر امپلیفکیشن کے بعد، خطے میں مخصوص سی پی جی سائٹس کی بیسلفائٹ میں تبدیل شدہ ترتیب کا تعین کرنے کے لیے پائروسیکوینسنگ کا استعمال کیا جاتا ہے۔ انفرادی مقامات پر سی-ٹو-ٹی کا تناسب ترتیب کی توسیع کے دوران سی اور ٹی کی شمولیت کی مقدار کی بنیاد پر مقداری طور پر طے کیا جا سکتا ہے۔ اس طریقہ کار کی بنیادی حد ٹیکنالوجی کی لاگت ہے۔ تاہم، پائروسیکوینسنگ ہائی تھرو پٹ اسکریننگ کے طریقوں میں توسیع کی اچھی طرح سے اجازت دیتا ہے۔ اس تکنیک کا ایک متغیر، جسے وانگ اور دیگر نے بیان کیا ہے، ایلیل مخصوص پرائمرز کا استعمال کرتا ہے جو سیکوینسنگ پرائمر کی ترتیب میں سنگل نیوکلیوٹائڈ پولیمورفزم کو شامل کرتے ہیں، اس طرح زچگی اور پدرانہ ایلیلز کا الگ تجزیہ کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ یہ تکنیک جینومک امپرنٹنگ تجزیہ کے لیے خاص طور پر مفید ہے۔ میتھیلیشن حساس سنگل اسٹرینڈ کنفارمیشن تجزیہ (ایم ایس-ایس ایس سی اے) یہ طریقہ سنگل نیوکلیوٹائڈ پولیمورفزم (ایس این پی) تجزیہ کے لیے تیار کردہ سنگل اسٹرینڈ کنفارمیشن پولیمورفزم تجزیہ (ایس ایس سی اے) طریقہ پر مبنی ہے۔ ایس ایس سی اے ایک ہی سائز کے لیکن الگ ترتیب کے سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے ٹکڑوں کے درمیان فرق کرتا ہے جو غیر ڈی نیچوریٹنگ الیکٹروفورسس میں تفریق منتقلی پر مبنی ہوتا ہے۔ ایم ایس-ایس ایس سی اے میں، اس کا استعمال بیسلفائٹ سے علاج شدہ، پی سی آر سے بڑھے ہوئے علاقوں کے درمیان فرق کرنے کے لیے کیا جاتا ہے جن میں دلچسپی کے سی پی جی مقامات ہوتے ہیں۔ اگرچہ ایس ایس سی اے میں حساسیت کا فقدان ہوتا ہے جب صرف ایک نیوکلیوٹائڈ کا فرق موجود ہوتا ہے، بیسولفائٹ علاج اکثر دلچسپی کے زیادہ تر علاقوں میں متعدد سی-ٹو-ٹی تبادلے کرتا ہے، اور اس کے نتیجے میں حساسیت 100% تک پہنچ جاتی ہے۔ ایم ایس-ایس ایس سی اے بینڈ کی شدت کے تناسب کی بنیاد پر ڈی این اے میتھیلیشن کی ڈگری کا نیم مقداری تجزیہ بھی فراہم کرتا ہے۔ تاہم، یہ طریقہ انفرادی میتھیلیشن سائٹس کے بجائے دلچسپی کے علاقے میں مجموعی طور پر تمام سی پی جی سائٹس کا جائزہ لینے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ ہائی ریزولوشن پگھلنے کا تجزیہ (ایچ آر ایم) غیر تبدیل شدہ بیسلفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے سے تبدیل ہونے والے ڈی این اے کو الگ کرنے کا ایک اور طریقہ ہائی ریزولوشن پگھلنے کا تجزیہ (ایچ آر ایم) استعمال کرنا ہے، جو ابتدائی طور پر ایس این پیز میں فرق کرنے کے لیے ڈیزائن کی گئی ایک مقداری پی سی آر پر مبنی تکنیک ہے۔ پی سی آر امپلیکنز کا براہ راست درجہ حرارت میں اضافے کے ذریعے تجزیہ کیا جاتا ہے اور اس کے نتیجے میں پگھلنے کے دوران ایک انٹرکالیٹنگ فلوروسینٹ ڈائی کی آزادی ہوتی ہے۔ میتھیلیشن کی ڈگری، جیسا کہ ایمپلیکن میں سی-ٹو-ٹی مواد سے ظاہر ہوتا ہے، پگھلنے کی رفتار اور اس کے نتیجے میں رنگ کی رہائی کا تعین کرتا ہے۔ یہ طریقہ سنگل ٹیوب جانچ میں براہ راست مقدار کی اجازت دیتا ہے، لیکن مخصوص سی پی جی سائٹس کے بجائے مجموعی طور پر امپلیفائیڈ ریجن میں میتھیلیشن کا اندازہ لگاتا ہے۔ میتھیلیشن حساس سنگل نیوکلیوٹائڈ پرائمر ایکسٹینشن (ایم ایس-سنوپی) ایم ایس-سنوپی ابتدائی طور پر سنگل نیوکلیوٹائڈ پولیمرفزم کا تجزیہ کرنے کے لیے ڈیزائن کردہ پرائمر ایکسٹینشن طریقہ استعمال کرتا ہے۔ ڈی این اے بیسولفائٹ میں تبدیل ہوتا ہے، اور بیسولفائٹ کے مخصوص پرائمرز کو دلچسپی کے سی پی جی سے فورا پہلے بیس جوڑے تک کی ترتیب میں شامل کیا جاتا ہے۔ پرائمر کو ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کرتے ہوئے سی (یا ٹی) میں ایک بیس جوڑی کو بڑھانے کی اجازت ہے جو ڈائیڈوکسینوکلیوٹائڈز کو ختم کرتا ہے، اور سی سے ٹی کا تناسب مقداری طور پر طے کیا جاتا ہے۔ اس سی: ٹی تناسب کا تعین کرنے کے لیے کئی طریقے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ ابتدا میں، ایم ایس-سنوپی نے پرائمر ایکسٹینشن کے رپورٹر کے طور پر تابکار ڈی ڈی این ٹی پیز پر انحصار کیا۔ فلوروسینس پر مبنی طریقے یا پائروسیکوینسنگ بھی استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ تاہم، میٹرکس کی مدد سے لیزر ڈسورپشن آئنائزیشن/ٹائم آف فلائٹ (ایم اے ایل ڈی آئی-ٹی او ایف) ماس سپیکٹرومیٹری تجزیہ دو پولیمورفک پرائمر ایکسٹینشن پروڈکٹس کے درمیان فرق کرنے کے لیے، جوہر میں، ایس این پی جینو ٹائپنگ کے لیے ڈیزائن کردہ گڈ اسیسے کی بنیاد پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ آئن جوڑی ریورس فیز ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (آئی پی-آر پی-ایچ پی ایل سی) کو بھی پرائمر ایکسٹینشن پروڈکٹس میں فرق کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ بیس-مخصوص کلیویج/مالڈی-ٹی او ایف اے حال ہی میں ایہرچ اور دیگر کے ذریعہ بیان کردہ طریقہ۔ نیوکلیوٹائڈ کی تبدیلیوں سے حاصل ہونے والی معلومات کو بڑھانے کے لیے بیس مخصوص کلیویج مرحلہ شامل کر کے بیسلفائٹ کے تبادلوں کا مزید فائدہ اٹھاتا ہے۔ سب سے پہلے آر این اے میں دلچسپی کے علاقے کی ان وٹرو ٹرانسکرپشن کا استعمال کرکے (ابتدائی امپلیفکیشن میں پی سی آر پرائمر میں آر این اے پولیمرس پروموٹر سائٹ شامل کرکے)، آر این اے اے کو بیس مخصوص سائٹوں پر آر این اے ٹرانسکرپٹ کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ جیسا کہ آر نیس اے آر این اے کو خاص طور پر سائٹوسین اور یوراسل ربنیوکلیوٹائڈز پر الگ کرتا ہے، جب سائٹوسین مخصوص (سی-مخصوص) کلیویج مطلوب ہو تو کلیویج مزاحم ڈی ٹی ٹی پی کو شامل کرکے، اور جب یوراسل مخصوص (یو-مخصوص) کلیویج مطلوبہ ہو تو ڈی سی ٹی پی کو شامل کرکے بیس کی خاصیت حاصل کی جاتی ہے۔ پھر کٹے ہوئے ٹکڑوں کا تجزیہ مالڈی-ٹی او ایف کے ذریعے کیا جا سکتا ہے۔ بیسولفائٹ کے علاج کے نتیجے میں یا تو سی-ٹو-یو تبادلوں کے ذریعے کلیویج سائٹس کا تعارف/ہٹانا یا ایمپلیفائیڈ ریورس اسٹرینڈ میں جی-ٹو-اے تبادلوں کے ذریعے ٹکڑے ٹکڑے میں تبدیلی آتی ہے۔ سی-مخصوص کلیویج خاص طور پر تمام میتھیلیٹیڈ سی پی جی سائٹس پر کٹ جائے گا۔ نتیجے کے ٹکڑوں کے سائز کا تجزیہ کرکے، پورے خطے کی میتھیلیشن کی حد کا تعین کرنے کے بجائے، خطے کے اندر سی پی جی سائٹس کے ڈی این اے میتھیلیشن کے مخصوص نمونے کا تعین کرنا ممکن ہے۔ اس طریقہ کار نے ہائی تھرو پٹ اسکریننگ کے لیے افادیت کا مظاہرہ کیا، جس سے متعدد سی پی جی سائٹس کی متعدد بافتوں میں سرمایہ کاری مؤثر طریقے سے کی جا سکتی ہے۔ میتھیلیشن مخصوص پی سی آر (ایم ایس پی) میتھیلیشن تجزیہ کا یہ متبادل طریقہ بیسلفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے کا بھی استعمال کرتا ہے لیکن دلچسپی کے علاقے کو ترتیب دینے کی ضرورت سے بچتا ہے۔ اس کے بجائے، پرائمر جوڑوں کو صرف غیر تبدیل شدہ 5-میتھائلسیٹوسینز کی تکمیل کرنے والے ترتیبات کو شامل کرکے خود کو "میتھیلیٹڈ-مخصوص" کے طور پر ڈیزائن کیا جاتا ہے، یا، اس کے برعکس، "غیر میتھیلیٹڈ-مخصوص"، غیر میتھیلیٹڈ سائٹوسینز سے تبدیل شدہ تھامینز کی تکمیل کرتے ہیں۔ میتھیلیشن کا تعین امپلیفکیشن حاصل کرنے کے لیے مخصوص پرائمر کی صلاحیت سے ہوتا ہے۔ یہ طریقہ خاص طور پر ممکنہ طور پر زیادہ میتھیلیشن کثافت والے سی پی جی جزائر سے پوچھ گچھ کے لیے مفید ہے، کیونکہ پرائمر میں سی پی جی جوڑوں کی بڑھتی ہوئی تعداد جانچ کی خاصیت میں اضافہ کرتی ہے۔ سی پی جی جوڑی کو پرائمر کے 3 'سرے پر رکھنے سے حساسیت میں بھی بہتری آتی ہے۔ ایم ایس پی کا استعمال کرتے ہوئے ابتدائی رپورٹ میں 0.1 ٪ ایلیلز کی میتھیلیشن کا پتہ لگانے کے لیے کافی حساسیت بیان کی گئی۔ عام طور پر، کسی مخصوص مقام پر میتھیلیشن کی حیثیت سے پوچھ گچھ کرتے وقت ایم ایس پی اور اس سے متعلق پروٹوکول کو سب سے زیادہ حساس سمجھا جاتا ہے۔ میتھی لائٹ طریقہ ایم ایس پی پر مبنی ہے، لیکن مقداری پی سی آر کا استعمال کرتے ہوئے مقداری تجزیہ فراہم کرتا ہے۔ میتھیلیٹیڈ مخصوص پرائمرز استعمال کیے جاتے ہیں، اور ایک میتھیلیٹیڈ مخصوص فلوروسینس رپورٹر پروب بھی استعمال کیا جاتا ہے جو امپلیفائیڈ ریجن تک پہنچتا ہے۔ متبادل انداز میں، اگر شامل ترتیبات کے اندر سی پی جی جوڑوں کے درمیان امتیازی سلوک کی ضرورت ہو تو پرائمرز یا تحقیقات کو میتھیلیشن کی خاصیت کے بغیر ڈیزائن کیا جا سکتا ہے۔ مقدار میتھیلیٹڈ حوالہ ڈی این اے کے حوالے سے کی جاتی ہے۔ کامیابی سے بیسولفائٹ میں تبدیل شدہ ڈی این اے (کون لائٹ-ایم ایس پی) کے لیے پی سی آر کی خاصیت کو بڑھانے کے لیے اس پروٹوکول میں ترمیم اس غیر مخصوص وسعت کی مقدار کے لیے بیسولفائٹ میں تبدیل شدہ ڈی این اے کے لیے ایک اضافی تحقیقات کا استعمال کرتی ہے۔ ایم ایس پی-ایمپلیفائیڈ ڈی این اے کا استعمال کرتے ہوئے مزید طریقہ کار پگھلنے والے منحنی تجزیہ (میک-ایم ایس پی) کا استعمال کرتے ہوئے مصنوعات کا تجزیہ کرتا ہے۔ یہ طریقہ میتھیلیٹڈ مخصوص اور غیر میتھیلیٹڈ مخصوص دونوں پرائمرز کے ساتھ بیسلفائٹ میں تبدیل شدہ ڈی این اے کو بڑھاتا ہے، اور پگھلتے ہوئے منحنی تجزیہ میں پیدا ہونے والی تفریق چوٹیوں کا موازنہ کرکے دونوں مصنوعات کے مقداری تناسب کا تعین کرتا ہے۔ ایک اعلی ریزولوشن پگھلنے کے تجزیے کا طریقہ جو مقداری پی سی آر اور پگھلنے کے تجزیے دونوں کا استعمال کرتا ہے، متعارف کرایا گیا ہے، خاص طور پر، نچلی سطح کے میتھیلیشن مائیکرو آرے پر مبنی طریقوں کا حساس پتہ لگانے کے لیے مائیکرو آرے پر مبنی طریقے بیسلفائٹ سے علاج شدہ ڈی این اے کا تجزیہ کرنے کے لیے دستیاب ٹیکنالوجیز کی منطقی توسیع ہیں تاکہ میتھیلیشن کے جینوم وسیع تجزیہ کی اجازت دی جا سکے۔ اولیگونیوکلیوٹائڈ مائکرواریوں کو اولیگونیوکلیوٹائڈ ہائبرڈائزیشن تحقیقات کے جوڑوں کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا ہے جو دلچسپی کے سی پی جی سائٹس کو نشانہ بناتے ہیں۔ ایک غیر تبدیل شدہ میتھیلیٹڈ ترتیب کی تکمیل کرتا ہے، اور دوسرا C-to-U-تبدیل شدہ غیر میتھیلیٹڈ ترتیب کی تکمیل کرتا ہے۔ تحقیقات بیسلفائٹ کے ذریعے نامکمل طور پر تبدیل شدہ ڈی این اے کے پابند ہونے کو روکنے کے لیے بیسلفائٹ کے لیے بھی مخصوص ہیں۔ الومینا میتھیلیشن اسیسے ایک ایسی جانچ ہے جو جینوم وسیع میتھیلیشن ڈیٹا تیار کرنے کے لیے مائیکرو ارے کی سطح پر بیسلفائٹ سیکوینسنگ ٹیکنالوجی کا اطلاق کرتی ہے۔ حدود 5-ہائڈروکسیمیتھائلسیٹوسین بیسلفائٹ سیکوینسنگ ممالیہ جینوموں میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی ہے، تاہم ایک نئے ممالیہ ڈی این اے ترمیم 5-ہائیڈروکسیمیتھائلسیٹوسین کی دریافت کے ساتھ پیچیدگیاں پیدا ہوئی ہیں۔ 5-ہائڈروکسیمیتھائلسیٹوسین بیسلفائٹ کے علاج پر سائٹوسین-5-میتھائل سلفونٹ میں تبدیل ہو جاتی ہے، جو اس کے بعد ترتیب دینے پر سی کے طور پر پڑھتی ہے۔ لہذا، بیسلفائٹ کی ترتیب 5-میتھائلسیٹوسین اور 5-ہائیڈروکسیمیتھائلسیٹوسین کے درمیان فرق نہیں کر سکتی۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ بیسلفائٹ سیکوینسنگ سے حاصل ہونے والی پیداوار کو اب صرف ڈی این اے میتھیلیشن کے طور پر بیان نہیں کیا جا سکتا، کیونکہ یہ 5-میتھائلسیٹوسین اور 5-ہائیڈروکسیمیتھائلسیٹوسین کا مرکب ہے۔ شکاگو یونیورسٹی میں چوان ہی کے ذریعہ ٹیٹ کی مدد سے آکسیڈیٹیو بیسلفائٹ سیکوینسنگ کی ترقی اب سنگل بیس ریزولوشن پر دونوں ترامیم کے درمیان فرق کرنے کے قابل ہے۔ نامکمل تبدیلی بیسلفائٹ کی ترتیب کا انحصار ہر ایک غیر میتھیلیٹڈ سائٹوسین کے باقیات کو یوراسل میں تبدیل کرنے پر ہے۔ اگر تبدیلی نامکمل ہے، تو اس کے بعد کا تجزیہ غیر تبدیل شدہ غیر میتھیلیٹڈ سائٹوسینز کی غلط تشریح میتھیلیٹڈ سائٹوسینز کے طور پر کرے گا، جس کے نتیجے میں میتھیلیشن کے غلط مثبت نتائج برآمد ہوں گے۔ سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے میں صرف سائٹوسینز بیسلفائٹ کے حملے کے لیے حساس ہوتے ہیں، اس لیے تجزیہ سے گزرنے والے ڈی این اے کی ڈی نیچوریشن اہم ہے۔ اس بات کو یقینی بنانا ضروری ہے کہ رد عمل کے پیرامیٹرز جیسے درجہ حرارت اور نمک کا ارتکاز ڈی این اے کو سنگل اسٹرینڈڈ تشکیل میں برقرار رکھنے اور مکمل تبدیلی کی اجازت دینے کے لیے موزوں ہوں۔ اگروز جیل میں ڈی این اے کو شامل کرنے سے ڈی این اے کے تاروں کو جسمانی طور پر الگ رکھ کر تبدیلی کی شرح کو بہتر بنانے کی اطلاع ملی ہے۔ نامکمل تبادلوں کی شرحوں کا تخمینہ لگایا جا سکتا ہے اور ترتیب کے بعد ترتیب لائبریری میں اندرونی کنٹرول کو شامل کرکے ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے، جیسے کہ لیمبڈا فیج ڈی این اے (جو غیر میتھیلیٹڈ ہونے کے لیے جانا جاتا ہے) یا حیاتیات میں کسی معروف غیر میتھیلیٹڈ علاقے، جیسے کلوروپلاسٹ جینوم کے لیے بیسولفائٹ ترتیب کو سیدھا کرکے۔ بیسلفائٹ کے علاج کے دوران ڈی این اے کی انحطاط بیسلفائٹ کی ترتیب میں ایک بڑا چیلنج ڈی این اے کا انحطاط ہے جو تبدیلی کے ساتھ ساتھ ہوتا ہے۔ مکمل تبدیلی کے لیے ضروری حالات، جیسے کہ انکیوبیشن کا طویل وقت، بلند درجہ حرارت، اور زیادہ بیسلفائٹ کا ارتکاز، انکیوبیٹڈ ڈی این اے کے تقریبا 90 فیصد کے انحطاط کا باعث بن سکتے ہیں۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ ڈی این اے کی ابتدائی مقدار اکثر محدود ہوتی ہے، اس طرح کی وسیع انحطاط پریشانی کا باعث بن سکتی ہے۔ انحطاط غلاظت کے طور پر ہوتا ہے جس کے نتیجے میں بے ترتیب اسٹرینڈ ٹوٹ جاتا ہے۔ لہذا، مطلوبہ پی سی آر ایمپلیکن جتنا لمبا ہوگا، برقرار ٹیمپلیٹ مالیکیولز کی تعداد اتنی ہی محدود ہوگی۔ یہ پی سی آر امپلیفکیشن کی ناکامی کا باعث بن سکتا ہے، یا ٹیمپلیٹ مالیکیولز کے محدود نمونے لینے کے نتیجے میں میتھیلیشن کی سطح پر مقداری طور پر درست معلومات کا نقصان ہو سکتا ہے۔ اس طرح، یہ ضروری ہے کہ استعمال شدہ رد عمل کے حالات کے نتیجے میں ڈی این اے کے انحطاط کی مقدار کا اندازہ لگایا جائے، اور اس بات پر غور کیا جائے کہ یہ مطلوبہ ایمپلیکن کو کس طرح متاثر کرے گا۔ ڈی این اے کے انحطاط کو کم کرنے کے لیے تکنیکوں کا بھی استعمال کیا جا سکتا ہے، جیسے کہ سائیکلنگ انکیوبیشن درجہ حرارت۔ 2020 میں، نیو انگلینڈ بائیولیبس نے ڈی این اے کے نقصان کو کم سے کم کرنے کے لیے ایک متبادل انزیمیٹک نقطہ نظر NEBNext Enzymmatic Methyl-Seq تیار کیا۔ دیگر خدشات بیسلفائٹ کے علاج کے بعد ایک ممکنہ طور پر اہم مسئلہ محلول کی ناکافی الکلائزیشن کی وجہ سے پیریمیڈائن کے باقیات کی نامکمل ڈیسلفونشن ہے۔ یہ کچھ ڈی این اے پولیمریز کو روک سکتا ہے، جس سے بعد میں پی سی آر مشکل ہو جاتا ہے۔ تاہم، محلول کے پی ایچ کی نگرانی کرکے اس صورتحال سے بچا جا سکتا ہے تاکہ اس بات کو یقینی بنایا جا سکے کہ ڈیسلفونشن مکمل ہو جائے گا۔ ایک حتمی تشویش یہ ہے کہ بیسلفائٹ کا علاج نمونے میں پیچیدگی کی سطح کو بہت کم کر دیتا ہے، جو کہ اگر متعدد پی سی آر رد عمل انجام دیے جائیں تو پریشانی کا باعث بن سکتا ہے (2006)۔ پرائمر ڈیزائن زیادہ مشکل ہے، اور نامناسب کراس ہائبرڈائزیشن زیادہ کثرت سے ہوتی ہے۔ ایپلی کیشنز: جینوم وسیع میتھیلیشن تجزیہ بیسلفائٹ ترتیب میں پیشرفت نے انہیں جینوم وسیع پیمانے پر لاگو کرنے کے امکان کو جنم دیا ہے، جہاں، پہلے، ڈی این اے میتھیلیشن کی عالمی پیمائش صرف دیگر تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے ممکن تھی، جیسے کہ پابندی تاریخی جینومک اسکیننگ۔ انسانی ایپیجینوم کی نقشہ سازی کو بہت سے سائنس دان ہیومن جینوم پروجیکٹ کی تکمیل کی منطقی پیروی کے طور پر دیکھتے ہیں۔ یہ ایپیجینومک معلومات یہ سمجھنے میں اہم ہوں گی کہ جینیاتی ترتیب کے کام کو کس طرح نافذ اور منظم کیا جاتا ہے۔ چونکہ ایپیجینوم جینوم سے کم مستحکم ہے، اس لیے اسے جین اور ماحول کے تعاملات میں اہم سمجھا جاتا ہے۔ ایپیجینومک میپنگ فطری طور پر جینوم کی ترتیب سے زیادہ پیچیدہ ہے، تاہم، کیونکہ ایپیجینوم جینوم کے مقابلے میں بہت زیادہ متغیر ہے۔ کسی کا ایپیجینوم عمر کے ساتھ مختلف ہوتا ہے، بافتوں کے درمیان مختلف ہوتا ہے، ماحولیاتی عوامل سے تبدیل ہوتا ہے، اور بیماریوں میں انحراف ظاہر کرتا ہے۔ تاہم، اس طرح کی بھرپور ایپیجینومک نقشہ سازی، جو مختلف عمروں، بافتوں کی اقسام اور بیماری کی حالتوں کی نمائندگی کرتی ہے، ایپیجینٹک نشانات کے معمول کے کام کے ساتھ ساتھ عمر بڑھنے اور بیماری کا باعث بننے والے طریقہ کار کے بارے میں قیمتی معلومات فراہم کرے گی۔ ایپیجینومک میپنگ کے براہ راست فوائد میں کلوننگ ٹیکنالوجی میں ممکنہ پیش رفت شامل ہیں۔ یہ خیال کیا جاتا ہے کہ عام عملداری اور عمر کے ساتھ کلون شدہ جانوروں کو پیدا کرنے میں ناکامی ایپیجینیٹک نشانات کے نامناسب نمونوں کا نتیجہ ہے۔ اس کے علاوہ، بہت سے کینسروں میں غیر معمولی میتھیلیشن کے نمونے اچھی طرح سے نمایاں ہوتے ہیں۔ گلوبل ہائپو میتھیلیشن کے نتیجے میں جینومک استحکام میں کمی واقع ہوتی ہے، جبکہ ٹیومر سپریسر جین پروموٹروں کی مقامی ہائپر میتھیلیشن اکثر ان کے فنکشن کے نقصان کا سبب بنتی ہے۔ میتھیلیشن کے مخصوص نمونے کینسر کی مخصوص اقسام کی نشاندہی کرتے ہیں، ان کی پیشن گوئی کی قدر ہوتی ہے، اور یہ علاج کے بہترین طریقہ کار کی رہنمائی کرنے میں مدد کر سکتے ہیں۔ دنیا بھر میں بڑے پیمانے پر ایپیجینوم میپنگ کی کوششیں جاری ہیں اور ہیومن ایپیجینوم پروجیکٹ کے تحت ان کا اہتمام کیا گیا ہے۔ یہ ایک کثیر درجے کی حکمت عملی پر مبنی ہے، جس کے تحت بیسلفائٹ سیکوینسنگ کا استعمال حوالہ ایپیجینومز کی محدود تعداد کے لیے ہائی ریزولوشن میتھیلیشن پروفائلز حاصل کرنے کے لیے کیا جاتا ہے، جبکہ نمونوں کے وسیع میدان عمل پر کم مکمل تجزیہ کیا جاتا ہے۔ اس نقطہ نظر کا مقصد وسائل کی دی گئی مقدار سے حاصل کردہ بصیرت کو زیادہ سے زیادہ کرنا ہے، کیونکہ ہائی ریزولوشن جینوم وائڈ میپنگ ایک مہنگا کام ہے۔ جین سیٹ تجزیہ (مثال کے طور پر ڈیوڈ اور گوسیک جیسے ٹولز کا استعمال کرتے ہوئے) جب ہائی تھرو پٹ میتھیلیشن ڈیٹا پر لاگو کیا جاتا ہے تو یہ شدید متعصبانہ ثابت ہوتا ہے۔ جینوم وسیع بائیسلفائٹ سیکوینسنگ) ؛ یہ تجویز کیا گیا ہے کہ اسے نمونے کے لیبل کی تغیرات کا استعمال کرتے ہوئے یا ہر جین کو نشانہ بنانے والے سی پی جی تحقیقات/سی پی جی سائٹس کی تعداد میں فرق کو کنٹرول کرنے کے لیے شماریاتی ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے درست کیا جا سکتا ہے۔ آکسیڈیٹیو بیسولفائٹ سیکوینسنگ 5-میتھائلسیٹوسین اور 5-ہائیڈروکسیمیتھائلسیٹوسین دونوں بیسولفائٹ سیکوینسنگ میں سی کے طور پر پڑھتے ہیں۔ آکسیڈیٹیو بیسلفائٹ سیکوینسنگ ایک واحد بیس ریزولوشن پر 5-میتھائلسیٹوسین اور 5-ہائیڈروکسیمیتھائلسیٹوسین کے درمیان فرق کرنے کا ایک طریقہ ہے۔ یہ طریقہ 5-ہائیڈروکسیمیتھائلسیٹوسین کی ایک مخصوص (ٹیٹ کی مدد سے) کیمیائی آکسیکرن کو 5-فارمائلسیٹوسین میں استعمال کرتا ہے، جو بعد میں بیسلفائٹ علاج کے دوران یوراسل میں تبدیل ہو جاتا ہے۔ واحد بیس جو پھر سی کے طور پر پڑھتا ہے وہ 5-میتھائلسیٹوسین ہے، جو ڈی این اے کے نمونے میں حقیقی میتھیلیشن کی حیثیت کا نقشہ دیتا ہے۔ بیسولفائٹ اور آکسیڈیٹیو بیسولفائٹ سیکوینسنگ کے درمیان فرق کی پیمائش کرکے بھی 5-ہائیڈروکسیمیتھلسیٹوسین کی سطح کی مقدار کی پیمائش کی جا سکتی ہے۔ کم نمائندگی بسلفائٹ ترتیب حوالہ جات بیرونی روابط بسلفائٹ تبادلوں کے پروٹوکول ہیومن ایپیجینوم پروجیکٹ (ایچ ای پی)-ڈیٹا-سینگر انسٹی ٹیوٹ دی ایپیجینوم نیٹ ورک آف ایکسی لینس مالیکیولر بائیولوجی ایپیجینٹکس جینومکس تکنیک