Terminal amine isotopic labeling of substrates
ٹرمینل امین اسوٹوپک لیبلنگ آف سبسٹریٹس (ٹی اے آئی ایل ایس) مقداری پروٹومکس کا ایک طریقہ ہے جو ہر پروٹین (این-ٹرمینل پیپٹائڈز) کے این-ٹرمینل ٹکڑوں کی بنیاد پر نمونوں کے پروٹین کے مواد کی شناخت کرتا ہے اور نمونوں کے درمیان پروٹین کی کثرت میں فرق کا پتہ لگاتا ہے۔ این-ٹرمینل پیپٹائڈز پر مبنی دیگر طریقوں کی طرح، یہ جانچ پروٹین کو ٹکڑوں میں توڑنے کے لیے ٹرپسن کا استعمال کرتی ہے اور این-ٹرمینل پیپٹائڈز (اصل پروٹین کے این-ٹرمینی پر مشتمل ٹکڑے) کو دوسرے ٹکڑوں (اندرونی ٹرپٹک پیپٹائڈز) سے الگ کرتی ہے۔ ٹی اے ایل ایس اندرونی ٹرپٹک پیپٹائڈز کی شناخت اور انہیں ہٹا کر این-ٹرمینل پیپٹائڈز کو الگ کرتا ہے۔ یہ منفی انتخاب ٹی اے آئی ایل ایس طریقہ کار کو دیئے گئے نمونوں میں تمام این-ٹرمینی کا پتہ لگانے کی اجازت دیتا ہے۔ متبادل طریقے جو این-ٹرمینل پیپٹائڈز کی شناخت کے لیے این-ٹرمینس کے مفت امینو گروپ پر انحصار کرتے ہیں وہ کچھ این-ٹرمینیوں کا پتہ نہیں لگا سکتے کیونکہ وہ "قدرتی طور پر مسدود" ہیں (یعنی۔ قدرتی پروٹین میں مفت امینو گروپ نہیں ہوتا ہے)۔ ٹی اے آئی ایل ایس طریقہ کار میں متعدد ایپلی کیشنز ہیں جن میں نئے سبسٹریٹس اور پروٹیسیس کی شناخت (بشمول وہ جن کی ایک نامعلوم اور وسیع خاصیت ہے) اور پروٹین کے اختتامی حصے کی وضاحت کرنے کے ایک طریقے کے طور پر جو پروٹین اینوٹیشن کو قابل بناتا ہے۔ ٹی اے ایل ایس کا استعمال کینسر جیسی بیماریوں میں مختلف قسم کے متعین حیاتیاتی راستوں کے ساتھ پروٹیسیس کو جوڑنے کے لیے بھی کیا جا سکتا ہے، تاکہ بیماری کی حالت میں شامل سبسٹریٹس اور پروٹیسیس کی واضح تفہیم حاصل کی جا سکے۔ میتھڈ ٹیلز این-ٹرمینل پیپٹائڈز کی لیبلنگ اور تنہائی کے لیے 2 ڈی یا 3 ڈی پروٹومکس پر مبنی جانچ ہے، جسے برٹش کولمبیا یونیورسٹی کے ایک گروپ نے تیار کیا ہے۔ ٹی اے آئی ایل ایس طریقہ متعدد پروٹیز علاج شدہ خلیوں کے موازنہ اور پروٹوم خلیوں کو کنٹرول کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ نمونے مختلف ذرائع سے حاصل کیے جا سکتے ہیں جن میں ٹشو، فائبر بلاسٹ، کینسر کے خلیات اور سیال کے اخراج شامل ہیں۔ یہ جانچ الٹرا فلٹریشن کے ذریعے اندرونی ٹرپٹک پیپٹائڈز کو ہٹا کر این-ٹرمینل پیپٹائڈز کو الگ کرتی ہے جس سے لیبل شدہ بالغ این-ٹرمینل اور نیو-این-ٹرمینل پیپٹائڈز کا تجزیہ ٹینڈم ماس سپیکٹرومیٹری (ایم ایس/ایم ایس) کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ یہ منفی انتخاب ٹی اے آئی ایل ایس طریقہ کار کو دیئے گئے نمونوں میں تمام این-ٹرمینی کا پتہ لگانے کی اجازت دیتا ہے۔ متبادل طریقے جو این-ٹرمینل پیپٹائڈز کو الگ کرنے کے لیے این-ٹرمینس کے فری امینو گروپ پر انحصار کرتے ہیں وہ قدرتی طور پر بلاک شدہ این-ٹرمینی کا پتہ نہیں لگا سکتے کیونکہ ان میں فری امینو گروپ نہیں ہوتا ہے۔ ٹی اے ایل ایس کو تجربے کے لیے پیپٹائڈ کے صرف چھوٹے نمونے کی ضرورت ہوتی ہے (100-300 یو جی)، پروٹیسیس کے ساتھ استعمال کیا جا سکتا ہے جس میں نامعلوم یا وسیع مخصوصیت ہوتی ہے اور نمونے کی لیبلنگ کے لیے مختلف طریقوں کی حمایت کرتا ہے۔ تاہم، یہ 50 ٪ پروٹین کی شناخت دو یا زیادہ مختلف اور منفرد پیپٹائڈز (اصل بالغ این-ٹرمینس میں سے ایک اور/یا کلیویج سائٹ کے ذریعے ایک یا زیادہ نیو-این-ٹرمینل پیپٹائڈ) سے کرتا ہے جو آزاد حیاتیاتی واقعات کی نمائندگی نہیں کرتے ہیں اس طرح مقدار کے لیے اوسط نہیں کیا جا سکتا۔ اس میں سنگل پیپٹائڈ بیس این-ٹرمینوم تجزیہ کے نتائج کی توثیق کرنے میں بھی دشواری ہوتی ہے۔ مندرجہ ذیل مراحل ڈائی میتھیلیشن-ٹیلز جانچ کے لیے ہیں، ایک کنٹرول نمونے (عام پروٹولائٹک سرگرمی کی نمائش) اور ایک علاج شدہ نمونے (جو اس مثال میں ایک اضافی پروٹولائٹک سرگرمی کی نمائش کرتا ہے) کا موازنہ کرتے ہوئے۔ علاج شدہ نمونے میں اضافی پروٹولائٹک سرگرمی کے ساتھ علاج شدہ اور کنٹرول شدہ نمونوں دونوں میں ہونے والا پروٹیوم وسیع پروٹولائسس۔ پروٹیسیس اور پروٹین کی انحطاط اور کمی کو غیر فعال کرنا۔ مستحکم آاسوٹوپس کے ساتھ لیبلنگ۔ یہ کنٹرول نمونے میں پیدا ہونے والے پیپٹائڈز کو علاج شدہ نمونے میں پیدا ہونے والے پیپٹائڈز سے ممتاز کرنے کی اجازت دیتا ہے تاکہ ان کی نسبتا کثرت کا موازنہ کیا جا سکے۔ اس مثال میں، لیبلنگ کا اطلاق علاج شدہ نمونوں کے لیے بھاری یا کنٹرول کے لیے ہلکے کا استعمال کرتے ہوئے بنیادی امینوں کے کم کرنے والے ڈائی میتھیلیشن کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ یہ تعامل سوڈیم سائانو بور ہائیڈرائیڈ کے ذریعے اتپریرک ہوتا ہے اور لیبل شدہ میتھائل گروپوں کو لائسین-امینز اور پروٹین اور پروٹیز کلیویج مصنوعات کے این-ٹرمینی پر فری (ꯘꯥ)-امینو گروپوں سے جوڑتا ہے۔ رد عمل والے امینو گروپوں کو روکنا۔ یہ اندرونی ٹرپٹک پیپٹائڈز کو بعد میں اس عمل میں شناخت کرنے کی اجازت دیتا ہے کیونکہ وہ رد عمل والے امینو گروپوں کے ساتھ واحد پیپٹائڈز ہوں گے۔ اس مثال میں لیبلنگ ری ایکشن (ریڈکٹو ڈائی میتھیلیشن) بھی رد عمل والے امینو گروپوں کو روکتا ہے۔ پولنگ۔ لیبل والے دو پروٹیوم اب ملے ہوئے ہیں۔ یہ اس بات کو یقینی بناتا ہے کہ نمونوں کو بعد کے تمام مراحل میں یکساں طور پر علاج کیا جائے جس سے دونوں نمونوں میں پروٹین کی متعلقہ مقدار کو زیادہ درست طریقے سے ماپا جا سکے۔ ٹرپسینائزیشن۔ یہ ہر پروٹین کو ٹکڑوں میں توڑ دیتا ہے۔ اصل پروٹین کا لیبل شدہ این-ٹرمینی مسدود رہتا ہے، جبکہ نئے اندرونی ٹرپٹک پیپٹائڈز میں ایک مفت این-ٹرمینس ہوتا ہے۔ منفی انتخاب۔ ٹرپٹک پیپٹائڈ بائنڈنگ کے لیے مخصوص ایک ہائپر برانچڈ پولی گلسرول اور ایلڈیہائیڈ (ایچ پی جی) پولیمر نمونے میں شامل کیا جاتا ہے اور نئے پیدا شدہ ٹرپٹک پیپٹائڈز کے ساتھ ان کے مفت این-ٹرمینی کے ذریعے رد عمل ظاہر کرتا ہے۔ جیسا کہ اوپر کے مرحلہ 3 میں، یہ تعامل سوڈیم سائانو بور ہائیڈرائیڈ کے ذریعے اتپریرک ہوتا ہے۔ ڈائی میتھلیٹڈ لائسین کے ایسیٹیلیٹڈ اور آئسوٹوپک لیبل والے پروٹین پیپٹائڈز اور نیو (نئے)-این-ٹرمینل پیپٹائڈز غیر فعال ہوتے ہیں اور غیر پابند رہتے ہیں اور الٹرا فلٹریشن کا استعمال کرتے ہوئے پولی-اندرونی ٹرپٹک پیپٹائڈ کمپلیکس سے الگ کیے جا سکتے ہیں۔ ایلیوٹڈ ان باؤنڈ پروٹین این-ٹرمینل پیپٹائڈز اور نیو-این-ٹرمینل پیپٹائڈز کے ساتھ بہت زیادہ مرتکز ہوتے ہیں۔ اس ایلیوٹڈ نمونے کی پھر مقدار مقرر کی جاتی ہے اور تجزیہ ایم ایس/ایم ایس کے ذریعے مکمل کیا جاتا ہے۔ ٹی اے ایل ایس میں آخری مرحلے میں بائیو انفارمیٹکس شامل ہے۔ پیپٹائڈ آاسوٹوپ کی مقدار اور کچھ بائیو انفارمیٹک تلاش کے معیار کے ذریعہ پس منظر پروٹیولیسس مصنوعات اور غیر صاف شدہ پروٹین سے امتیازی سلوک کرنے والے درجہ بندی والے سبسٹریٹ ونونگ کے عمل کا استعمال کرنا۔ اقسام ٹیالز کی اقسام پروٹین اور پروٹیز کلیویج مصنوعات کے امینو گروپس کو بلاک اور لیبل کرنے کے لیے استعمال ہونے والے طریقوں میں مختلف ہوتی ہیں۔ ان امینو گروپوں میں لائسین امینز اور پروٹین کے این-ٹرمینی کے فری (ꯘꯥ) امینو گروپ شامل ہیں۔ ڈائی میتھیلیشن-ٹیلز طریقہ کار کیمیائی لیبلنگ پر مبنی طریقہ کار ہے جو امین رد عمل والے آئسوٹوپک ریجینٹس کا استعمال کرتے ہوئے ایک مرحلے میں انجام دیا جاتا ہے۔ دو نمونوں کی لیبلنگ میں یا تو 12CH2-فارملڈیہائیڈ (ہلکا) یا 13CD2-فارملڈیہائیڈ (بھاری) استعمال ہوتا ہے اور سوڈیم سائانوبوروہائیڈرائڈ کو اتپریرک کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ اس طریقہ کار کا فائدہ یہ ہے کہ یہ مضبوط، موثر اور لاگت سے موثر ہے۔ کنٹرول اور پروٹیز کے علاج شدہ نمونوں کے لیے لیبلنگ کا طریقہ کار انہیں جمع کرنے سے پہلے الگ سے کیا جانا چاہیے، اور یہ فی تجربے میں دو نمونوں تک محدود ہے، جو ایک نقصان ہو سکتا ہے اگر بیک وقت متعدد نمونوں کا مطالعہ کرنے کی ضرورت ہو۔ سیل کلچر میں امینو ایسڈ کے ساتھ مستحکم آاسوٹوپ لیبلنگ (ایس آئی ایل اے سی) ایک ایسا طریقہ کار ہے جو ویو میں کیا جا سکتا ہے۔ یہ طریقہ کار سیل کلچر کی تمام لیبارٹریوں میں استعمال کیا جا سکتا ہے اور یہ باقاعدگی سے استعمال ہونے والی لیبلنگ تکنیک ہے۔ یہ میٹابولک لیبلنگ حیاتیاتی نمونوں میں دی گئی پروٹیز کی روک تھام اور ایکس ویو پروسیسنگ کے تجزیے کو قابل بناتی ہے۔ کیمیائی لیبلنگ پر اس میٹابولک لیبلنگ کے طریقہ کار کو استعمال کرنے کا ایک فائدہ یہ ہے کہ یہ حقیقی سیلولر سے ماخوذ پروٹینوں کے درمیان قابل اعتماد، تیز اور موثر امتیاز کی اجازت دیتا ہے جن کی سیرم پروٹین جیسے آلودگیوں سے تفتیش کی جا رہی ہے۔ ایس آئی ایل اے سی ٹیلز کو پانچ تک ملٹی پلیکس نمونوں کے تجزیے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ایس آئی ایل اے سی طبی لحاظ سے متعلقہ انسانی نمونوں کے لیے موزوں نہیں ہے جو میٹابولک طور پر لیبل کیے جانے کے قابل نہیں ہیں۔ ایس آئی ایل اے سی ایک مہنگا طریقہ ہے اور زیادہ تر لیبارٹریوں کے لیے قابل عمل آپشن نہیں ہو سکتا۔ رشتہ دار اور مطلق مقدار (آئی ٹی آر اے کیو) طریقہ یا آئی ٹی آر اے کیو-ٹیلز کے لیے آئسوبارک ٹیگ بیک وقت متعدد نمونوں کی مقدار کو قابل بناتا ہے۔ یہ طریقہ چار اور آٹھ پلیکس آئی ٹی آر اے کیو ریجینٹس کا استعمال کرتے ہوئے ملٹی پلیکس تجربات میں 4 سے 8 نمونوں سے بیک وقت تجزیہ کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ یہ طریقہ نمونوں کی اعلی درستگی کی شناخت اور مقدار فراہم کرتا ہے اور نمونوں کی نقلوں کے زیادہ تولیدی تجزیہ کی اجازت دیتا ہے۔ دیگر آئی ٹی آر اے کیو طریقوں کی طرح، آئی ٹی آر اے کیو-ٹیلز کے لیے بھی مالڈی ماس سپیکٹرومیٹر اور مہنگے آئی ٹی آر اے کیو ریجینٹس کی ضرورت ہوتی ہے۔ متبادل طریقے این ٹرمینی اور پروٹیولیسس مصنوعات کا مطالعہ کرنے کے کئی متبادل طریقے ہیں۔ امینوں کی ایسیٹیلیشن کے بعد ٹرپٹک ہاضمہ اور مفت این-ٹرمینل پیپٹائڈز کی بائیوٹینیلیشن فری لائسینز اور این-ٹرمینی کو لیبل کرنے کے لیے کیمیائی (ایسیٹیلیشن) کا استعمال کرتی ہے۔ بلاک شدہ این-ٹرمینی کو پھر منفی طور پر منتخب کیا جاتا ہے۔ تاہم، قدرتی طور پر آزاد اندرونی این-ٹرمینی اور بلاک شدہ این-ٹرمینی کو ایسیٹیلیشن کے بعد الگ نہیں کیا جا سکتا۔ یہ طریقہ آئسوٹوپک لیبلنگ کا استعمال نہیں کرتا ہے، اس طرح نتائج کی مقدار کا تعین کرنا مشکل ہے۔ اس کے علاوہ، تجرباتی اور پس منظر پروٹیولیسس مصنوعات کے درمیان فرق کرنا مشکل ہے۔ لائسین گوانیڈیشن کے بعد این-ٹرمینی کی بائیوٹینیلیشن لائسین کے باقیات کو روکنے اور ٹیگ فری این-ٹرمینی کے لیے ایک کیمیکل کا استعمال کرتی ہے۔ اس کے بعد ٹیگ شدہ مفت این-ٹرمینی کو منتخب کیا جاتا ہے۔ اس طریقہ کار کا منفی پہلو یہ ہے کہ قدرتی طور پر بلاک شدہ این-ٹرمینی کو پکڑنے کے قابل نہ ہونے کی وجہ سے غیر صاف شدہ پیپٹائڈز کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی ماڈل پر نتائج کا اطلاق نہیں کیا جا سکتا۔ چونکہ اس میں آئسوٹوپک لیبلنگ شامل نہیں ہے، اس لیے نتائج کی مقدار نہیں بتائی جا سکتی۔ کلیویج سائٹ کو بھی لیبلنگ کرنے کے لیے پہلے سے جانا جاتا ہے۔ این-ٹرمینی کی سبٹیلیگیس بائیوٹینیلیشن این-ٹرمینل پیپٹائڈز کی انزیمیٹک لیبلنگ کا استعمال کرتی ہے، لیکن لائسین بلاکنگ کیمیکلز کا استعمال نہیں کرتی ہے۔ لائسین بلاکنگ کے بغیر، بہت سے کلیوڈ این-ٹرمینل پیپٹائڈ شناخت کے لیے بہت چھوٹے ہوں گے۔ نتائج سبٹیلیگیس کی خصوصیات پر بہت زیادہ منحصر ہو سکتے ہیں اس طرح متعصبانہ ہو سکتے ہیں۔ یہ طریقہ قدرتی طور پر بلاک شدہ این-ٹرمینی کو نہیں پکڑتا ہے اور آئسوٹوپک لیبلنگ کا بھی استعمال نہیں کرتا ہے اس طرح نتائج کی مقدار کا تعین کرنا مشکل ہوگا۔ این-ٹرمینی کی آئی ٹی آر اے کیو-لیبلنگ این-ٹرمینی کو لیبل کرنے کے لیے آئی ٹی آر اے کیو کا استعمال کرتی ہے۔ نیو-این-ٹرمینی پیپٹائڈز کو سلیکو کے ذریعے منتخب کیا جاتا ہے۔ اس تکنیک کا منفی پہلو یہ ہے کہ مالڈی ماس سپیکٹرومیٹر کی ضرورت ہوتی ہے اور درکار آئی ٹی آر اے کیو ریجینٹ مہنگے ہوتے ہیں۔ یہ طریقہ قدرتی طور پر بلاک شدہ این-ٹرمینی کو نہیں پکڑتا ہے۔ پورے عمل کے لیے 50-100 ملی گرام پیپٹائڈ کے نمونوں کی ضرورت ہوگی۔ کمبائنڈ فریکشنل ڈائیگنل کرومیٹوگرافی (COFRADIC) قدرتی طور پر بلاک شدہ N-ٹرمینی اور پروٹیز جنریٹڈ نیو-N-ٹرمینی کے لیے مختلف لیبلنگ کی اجازت دیتی ہے۔ تمام بلاک شدہ این-ٹرمینی منفی طور پر منتخب کیے گئے ہیں۔ تاہم اس عمل کے لیے بہت سی کیمیائی پروسیسنگ، کرومیٹوگرافی اور ماس سپیکٹرومیٹری کی ضرورت ہوتی ہے۔ علیحدگی کے بہترین نتائج امینو ایسڈ میں ترمیم پر منحصر ہوتے ہیں جیسے کہ ہینڈلنگ کے دوران میتھیونائن آکسیڈیشن نہیں ہوتا ہے۔ اس طریقہ کار کے لیے فی نمونہ 150 ایم ایس/ایم ایس تجزیہ کی ضرورت ہوتی ہے لیکن ماس سپیکٹرومیٹری کے لیے نمونے اکٹھے کیے جا سکتے ہیں (اور تجزیہ کی تعداد کو کم کیا جا سکتا ہے)۔ یہ تکنیک نامعلوم یا وسیع مخصوصیت کے ساتھ پروٹیسیس کے لیے استعمال ہونے کے لیے موزوں ہے۔ ایس آئی ایل اے سی آئی ٹی آر اے کیو حوالہ جات پروٹومیکس ماس سپیکٹرومیٹری بھی دیکھیں۔