VINE-seq
VINE-SEQ (ویسل آئسولیشن اینڈ نیوکلی ایکسٹریکشن فار سیکوینسنگ) انسانی دماغ کے مائکرو ویسلز کے ویسکولر اور پیری ویسکولر خلیوں کو سنگل نیوکلی ریزولوشن پر الگ تھلگ اور سالماتی طور پر نمایاں کرنے کا ایک طریقہ ہے۔ یہ تکنیک مختلف معروف لیبارٹری پر مبنی حکمت عملیوں کو یکجا کرکے حاصل کی جاتی ہے جس میں دماغ کے بافتوں کے نمونوں کو واحد خلیوں میں مکینیکل علیحدگی، کثافت گریڈینٹ سینٹری فیوگیشن اور مائکرو ویسلز کے مرکزوں کو الگ کرنے کے لیے فلٹریشن، سیلولر آبادیوں کی فلوروسینس ایکٹیویٹڈ سیل چھانٹ (ایف اے سی) اور بوند پر مبنی سنگل نیوکلی آر این اے سیکوینسنگ (ڈراپ-ایس این آر این اے-ایس ای کیو) شامل ہیں۔ مجموعی طور پر، یہ دماغ کے ویسکولچر میں موجود مختلف خلیوں کی اقسام کا ایک واحد نیوکلی ٹرانسکرپٹومیک پروفائل تیار کرتا ہے۔ سنگل نیوکلی ٹرانسکرپٹومک ڈیٹا کی پروسیسنگ اور تجزیہ کے ذریعے، خلیوں کی اقسام کے اندر اور ان کے درمیان متنوعیت کو انسانی دماغ کے ویسکولچر کے سالماتی منظر نامے کی تعمیر کے لیے ممتاز کیا جا سکتا ہے جو پہلے نہیں کیا گیا تھا۔ پس منظر دماغی صحت کی ایک مرکزی خصوصیت پیچیدہ ویسکولچر کی دیکھ بھال ہے جو ضروری میٹابولائٹس، آکسیجن، غذائی اجزاء اور فضلہ کو انسانی دماغ میں اور وہاں سے منتقل کرنے کے لیے کام کرتی ہے۔ ویسکولچر میں خلل اعصابی عوارض جیسے الزائمر کی بیماری اور فالج کا باعث بن سکتا ہے۔ ویسکولچر خلیوں کی اقسام کے ایک متنوع گروپ کا گھر ہے جس میں اینڈوتھیلیل خلیات، پیریسیٹس، ایسٹروسائٹس اور لیوکوسائٹس شامل ہیں لیکن ان تک محدود نہیں ہیں۔ اگرچہ گزشتہ برسوں میں ویسکولچر میں سیلولر تنوع کو سمجھنے کی بہت سی کوششیں کی گئی ہیں، لیکن طریقہ کار اور تکنیکی حدود نے دماغ کے پیچیدہ وجود کو ڈی کوڈ کرنے کی ہماری صلاحیت میں رکاوٹ پیدا کی ہے۔ لہذا، اس پیچیدہ ماحول میں ویسکولر اور پیری ویسکولر خلیوں کی نامکمل خصوصیت کی وجہ سے اعصابی عوارض کے لیے ہمارے علاج کے اختیارات ناکافی رہے ہیں۔ سنگل سیل آر این اے سیکوینسنگ (ایس سی آر این اے-ایس ای کیو) میں حالیہ پیشرفت کے ذریعے، چوہوں میں دماغی ویسکولچر کے مالیکیولر اٹلس کو ڈی کوڈ کیا گیا ہے اور انسانی دماغ میں پائے جانے والے خلیوں کی اقسام کے اندر متنوع نوعیت کو آہستہ آہستہ بے نقاب کیا گیا ہے۔ ان کامیابیوں کے باوجود، میورین برین ویسکولچر انسانی دماغ کے ویسکولچر کو مکمل طور پر دوبارہ تشکیل نہیں دے سکتا ہے جس کی وجہ سے ٹرانسلیشنل صلاحیت کے خدشات پیدا ہوتے ہیں۔ مزید برآں، انسانی دماغ کے ایس سی آر این اے-سی کیو پر توجہ مرکوز کرنے والے بہت سے پچھلے مطالعات ویسکولچر میں سیلولر ہیٹرجینیٹی کی خصوصیت نہیں رکھتے تھے۔ VINE-SEQ نامی ایک نیا طریقہ متعارف کروا کر، ایک تحقیقی گروپ نے دماغ کے مائکرو ویسلز سے برقرار مرکزوں کو الگ کرنے کا ایک طریقہ اخذ کیا۔ اسے پورا کرنے کے لیے، انہیں نیوکلئی کو نقصان پہنچائے بغیر مائیکرو ویسلز کو گھیرے ہوئے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ای سی ایم) کو ہٹانے کے چیلنج پر قابو پانا پڑا۔ ہپپوکیمپس اور پرانتستا سے منجمد دماغ کے بافتوں پر VINE-SEQ کا استعمال کرتے ہوئے، انہوں نے سنگل نیوکلی ریزولوشن پر انسانی دماغ کے ویسکولچر میں مختلف قسم کے خلیوں کی پہلی خصوصیت فراہم کی۔ طریقہ کار VINE-Seq انسانی دماغ کے ویسکولچر کی تفصیل کے لیے ایک نیا طریقہ ہے۔ یہ دماغ کے اندر ویسکولر اور پیری ویسکولر سیل کی اقسام کا اٹلس بنانے کے لیے سنگل نیوکلیوٹائڈ ٹرانسکرپٹومیکس کے ساتھ لیبارٹری کے طریقوں کا ایک مجموعہ استعمال کرتا ہے۔ مندرجہ ذیل مراحل VINE-Seq پروٹوکول کی بنیاد کی تفصیل دیتے ہیں: پروٹوکول کا ابتدائی حصہ اسپلینوسیٹ آئسولیشن اور نمونے کی صفائی سے اپنائے گئے طریقہ کار پر مشتمل ہوتا ہے۔ VINE-Seq کے لیے، انسانی دماغ کے ٹشو کو ابتدائی طور پر پوسٹ مارٹم کے بعد نکالا جاتا ہے۔ محققین نے ہپپوکیمپس اور اعلی فرنٹل پرانتستا سے دماغی ٹشو نکالا۔ ٹشو کے نمونے اس وقت تک یکساں ہوتے ہیں جب تک کہ مکمل طور پر مرکب نہ ہو جائیں اور کوئی نظر آنے والا ٹشو باقی نہ رہے۔ نمونوں کو ایچ بی ایس ایس میں 32 فیصد ڈیکسٹرین محلول کے ساتھ ملایا جاتا ہے۔ سینٹری فیوگیشن 4,400 گرام پر 20 منٹ کے لیے کیا جاتا ہے تاکہ سیلولر تہوں کو کنڈینسڈ ویسکولچر پر مشتمل گولی سے الگ کیا جا سکے۔ مائیلن اور پیرنکائمل خلیوں کی بقیہ تہوں کو گولی کو پریشان کیے بغیر تیز کیا جاتا ہے۔ چھروں کو ڈیکسٹرین محلول میں دوبارہ معطل کیا جاتا ہے۔ سیلولر ملبے سے گولی کو مزید جراثیم سے پاک کرنے کے لیے پی بی ایس کے ساتھ دھونے کا ایک سلسلہ انجام دیا جاتا ہے۔ مائیکرو ویسلز کو بے نقاب کیا جاتا ہے اور باقی سیلولر ملبے کو ہٹا دیا جاتا ہے۔ ماؤس سپلینوسائٹس کو نکالنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ایک طریقہ اپنایا گیا اور نیوکلئی کو بقیہ ویسکولر خلیوں سے الگ کرنے میں مدد کے لیے انجام دیا گیا۔ 10 منٹ کے لیے 500 گرام پر سینٹری فیوگیشن نیوکلئی سے ویسکولر خلیوں کو الگ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے اور اسے لائسس بفر، آر نیس انفیکٹر، اور ای ڈی ٹی اے فری پروٹیز انفیکٹر کے حل میں دوبارہ معطل کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد شیشے کے ڈونسر کا استعمال کرتے ہوئے مرکزوں کو یکساں بنایا جاتا ہے۔ سینٹری فیوگیشن کے ذریعے نمونوں کو ایک بار پھر پھینکا جاتا ہے۔ بقیہ سیلولر ملبے اور ضمنی مصنوعات کو سکروس گریڈینٹ واش اور فلوروسینس ایکٹیویٹڈ سیل شارٹنگ (ایف اے سی ایس) کا استعمال کرتے ہوئے ختم کیا جاتا ہے۔ چھروں کو اعلی معیار کا ڈیٹا حاصل کرنے میں مدد کے لیے صاف کیا جاتا ہے۔ بقیہ مرکزوں کے لیے فلو سائٹومیٹری کا استعمال کیا جاتا ہے۔ یہ تکنیک ویسکولر نیوکلئی کی جسمانی اور کیمیائی خصوصیات کا تعین کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ فلو سائٹومیٹری کے لیبارٹری رنوں کا متوقع اقدار سے 3.4 گنا زیادہ تخمینہ لگایا گیا ہے۔ جواب میں، محققین نے فی نمونہ تقریبا 10,000 مرکزے حاصل کرنے کے لیے مزید مرکزوں کو الگ اور ترتیب دیا۔ بہاؤ کی چھانٹ کے بعد، بوندوں پر مبنی ایس این آر این اے-ایس ای کیو لائبریریوں کو انجام دینے کے لیے فی نمونے 10,000 مرکزوں کی ضرورت ہوتی ہے۔ ڈراپلیٹ پر مبنی ایس این آر این اے-ایس ای کیو لائبریریاں ترتیب کے لیے تیار کی جاتی ہیں۔ پی سی آر کے 15 چکروں کے بعد کافی سی ڈی این اے حاصل کیا جاتا ہے۔ محققین نے نوواسیک 6000 پر ایس 4 لینوں پر ویسکولر نیوکلئی کو کامیابی کے ساتھ ترتیب دیا۔ ایپلی کیشنز برین میپنگ اپنے تجربے اور ٹرانسکرپٹومک تجزیے کے ذریعے، VINE-Seq کے مصنفین اور تخلیق کاروں نے دریافت کیا کہ طریقوں کا سلسلہ صحت مند انسانی دماغ کے بافتوں میں شریانوں کی تنظیم میں موجود ویسکولر اینڈوتھیلیل اور ہموار پٹھوں کے خلیوں کے ٹرانسکرپٹومک اظہار کو واضح کرنے میں کامیاب رہا۔ مزید برآں، VINE-SEQ پیری سائٹس کی دو نئی ذیلی آبادیوں کو پکڑنے میں کامیاب رہا جسے میٹرکس پیری سائٹس اور ٹرانسپورٹ پیری سائٹس کہا جاتا ہے جو بالترتیب ای سی ایم ماڈیولیشن اور ٹرانس میمبرین ٹرانسپورٹیشن میں شامل ہو سکتے ہیں۔ الزائمر کی بیماری VINE-SEQ کا استعمال کرتے ہوئے، یہ محققین الزائمر کی بیماری (AD) میں انسانی دماغ کے ویسکولچر کی سالماتی بنیاد کو بے نقاب کرنے میں مدد کرنے میں کامیاب رہے۔ انہوں نے دکھایا کہ AD سے وابستہ جین ویسکولر سیل کی اقسام میں بہت زیادہ ظاہر ہوتے ہیں اور یہ کہ دماغ کے عام نمونوں کے مقابلے AD دماغ کے نمونوں میں جین کے اظہار میں تبدیلی یا اینڈوتھیلیل خلیوں، ہموار پٹھوں کے خلیوں اور پیری ویسکولر فائبربلاسٹ خلیوں کی کثرت کا نقصان ہوتا ہے۔ مزید ایپلی کیشنز VINE-Seq اصل میں انسانی دماغ کے ویسکولچر کا نقشہ بنانے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا، کیونکہ فی الحال کوئی سالماتی نقشہ موجود نہیں ہے۔ جب سے 2021 میں VINE-SEQ متعارف کرانے والے مقالے کا پری پرنٹ دستیاب ہوا تھا، سالماتی نقشے کو دماغی ویسکولچر کے بارے میں ہمارے علم کو بڑھانے میں اس کی شراکت کے لیے تسلیم کیا گیا ہے جو دماغی بیماریوں کے مزید گہرائی سے مطالعے اور ممکنہ طور پر اس پر قابو پانے کی اجازت دے گا۔ VINE-SEQ کے ذریعہ تیار کردہ ڈیٹا کی کچھ ایپلی کیشنز نے AD، ڈیمینشیا، اسکیمک اسٹروک، اور دماغ پر شدید COVID-19 کے اثرات کے پیتھوجینسیس میں ہمارے علم کو آگے بڑھانے میں اہم کردار ادا کیا ہے۔ فوائد اور نقصانات پچھلی سنگل نیوکلی آئسولیشن تکنیکوں کے مقابلے میں زیادہ سیریبرووسکولر نیوکلیز کو الگ تھلگ کرتا ہے نیوکلیز کی بہتر تنہائی کی وجہ سے ویسکولچر میں نایاب خلیوں کو پکڑتا ہے۔ منجمد آرکائیوڈ دماغی ٹشو پر لاگو ہونے والے انزیمیٹک ڈس ایسوسی ایشن سے گریز کرکے جین کے اظہار کو تبدیل کرنے کے اثر کو کم کرتا ہے۔ نقصانات خلیوں کی اقسام کی خصوصیت معروف نیوکلیئر مارکرز تک محدود ہے۔ آر این اے کے نیوکلیئر سوراخوں سے نیوکلیائی ممکنہ رساو کو الگ کرنے کے ذریعے سائٹوپلاسمک ٹرانسکرپٹومیک معلومات کا نقصان، اس طرح کچھ اہم آر این اے ٹرانسکرپٹس کو کھو دیتا ہے۔