Ribonucleoprotein Networks Analyzed by Mutational Profiling
ربن نیوکلیوپروٹین نیٹ ورکس انالیزڈ بائی میوٹیشنل پروفائلنگ (آر این پی-ایم اے پی) نیوکلیوٹائڈ ریزولوشن پر آر این اے-پروٹین نیٹ ورکس اور پروٹین بائنڈنگ سائٹس کی تحقیقات کے لیے ایک حکمت عملی ہے۔ آر این پی اسمبلی اور فنکشن کے بارے میں معلومات حیاتیاتی میکانزم کی بہتر تفہیم کو آسان بنا سکتی ہیں۔ آر این پی-ایم اے پی آر این اے سے منسلک پروٹین کو منجمد کرنے کے لیے این ایچ ایس-ڈیازیرائن (ایس ڈی اے) کا استعمال کرتا ہے، جو ایک ہیٹرو-بائی فنکشنل کراس لنکر ہے۔ ایک بار جب آر این اے-پروٹین کراس لنکس بن جاتے ہیں، تو ایم اے پی ریورس ٹرانسکرپشن کو پروٹین سے منسلک آر این اے کو الٹا نقل کرنے کے ساتھ ساتھ آر این اے-پروٹین کراس لنکس کی جگہ پر تغیرات متعارف کرانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ سی ڈی این اے کے ترتیب کے نتائج پروٹین-آر این اے تعامل نیٹ ورک اور پروٹین بائنڈنگ سائٹس دونوں کے بارے میں معلومات ظاہر کرتے ہیں۔ حکمت عملی کے اجزاء آر این اے-ایم اے پی میں تین بڑے اجزاء شامل ہیں: ربن نیوکلیوپروٹین (آر این پی): آر این اے اور آر این اے بائنڈنگ پروٹین (آر بی پی) این ایچ ایس ڈیازیرائن (ایس ڈی اے) سے بنے کمپلیکس: ایک سیل پارمیبل کراس لنکنگ ریجینٹ۔ ایس ڈی اے دو رد عمل والے گروپوں پر مشتمل ہے-ایک ڈیازیرائن اور ایک سکینیمیڈائل ایسٹر۔ سکینیمیڈائل ایسٹرز اور امین گروپوں کے درمیان تعامل (مثال کے طور پر۔ لائسین سائیڈ چینز) کے نتیجے میں پیپٹائڈ بانڈز (یا امیڈ بانڈز) ہوتے ہیں۔ جب 365 این ایم کی طول موج کے ساتھ یووی روشنی کے سامنے آتا ہے، تو نیوکلیوٹائڈ رائبوس اور اڈوں کی طرف ایک انٹرمیڈیٹ وسیع پیمانے پر رد عمل پیدا ہوتا ہے۔ نتیجے کے طور پر، پروٹین ایس ڈی اے لنکر کے ذریعے آر این اے کے ساتھ جڑے ہوتے ہیں۔ میوٹیشنل پروفائلنگ (ایم اے پی): پروٹین-آر این اے بائنڈنگ سائٹس پر ترمیم شدہ باقیات کو شامل کرنے کے لیے آرام دہ وفاداری کے ساتھ ریورس ٹرانسکرپٹ کا استعمال کرنے والا ایک طریقہ۔ ورک فلو لانگ ویو لینتھ یو وی اور ایس ڈی اے ریجینٹس کو سب سے پہلے زندہ خلیوں کو فراہم کیا جاتا ہے تاکہ وہ پروٹین کے باقیات کو آر این اے کے ساتھ کراس لنک کر سکیں اور لائسین (یا ارجنائن) کے باقیات اور سکینیمیڈائل ایسٹرز کے امین گروپوں کے درمیان امیڈ بانڈ بنا سکیں۔ اس کے بعد، کراس لنکڈ آر این پیز پر مشتمل خلیوں کو لیس کیا جاتا ہے اور آر این اے سے منسلک پروٹین کو پیپٹائڈ ایڈکٹس میں ہضم کیا جاتا ہے۔ ایم اے پی ریورس ٹرانسکرپشن پھر پیپٹائڈ ایڈکٹ-انڈیوسڈ میوٹیشنز کے ذریعے پروٹین-آر این اے بائنڈنگ سائٹس کو لیبل کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ اتپریورتن پر مشتمل سی ڈی این اے پروڈکٹ کی ترتیب اتپریورتن سائٹس (یا آر این پی-ایم اے پی سائٹس) کو ظاہر کرے گی اور آر این پی-ایم اے پی سائٹس کے درمیان ارتباط کا تعین 3-نیوکلیوٹائڈ ونڈوز کا استعمال کرتے ہوئے کمپیوٹیشنل طور پر کیا جاتا ہے۔ تجزیہ آر این پی-ایم اے پی سائٹ کی شناخت آر این پی-ایم اے پی سائٹس کو پروٹین سے منسلک نیوکلیوٹائڈز کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ ایس ڈی اے اور یو وی ٹریٹڈ اور یو وی صرف ٹریٹڈ سیمپل سیکوینس ریڈز سیدھے ہوتے ہیں اور میوٹیشنز کو شیپ میپر 2 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیا جاتا ہے۔ نیوکلیوٹائڈ کے لیے ایس ڈی اے یا آر این پی-ایم اے پی رد عمل کراس لنکڈ (ایس ڈی اے اور یو وی ٹریٹڈ) میوٹیشنل فریکوئنسی اور غیر کراس لنکڈ (صرف یو وی) میوٹیشن فریکوئنسی کا تناسب ہے۔ تفریق تغیراتی اشاروں کا استعمال کرتے ہوئے، آر این پی-ایم اے پی سائٹس کی شناخت معروف ساخت کے ربن نیوکلیوپروٹینز کے تجزیے سے حاصل کردہ ہر آر این اے نیوکلیوٹائڈ (یو، اے، سی، اور جی) پر یونیورسل نارملائزیشن عوامل اور حد کی بنیاد پر کی جاتی ہے۔ نیوکلیوٹائڈ کی شناخت آر این پی-ایم اے پی سائٹ کے طور پر کی جاتی ہے اگر یہ تین فلٹرز سے گزرتا ہے: ایس ڈی اے + یو وی علاج شدہ نمونے میں اتپریورتن کے واقعات کی تعداد یو وی علاج شدہ نمونے سے کم از کم 50 زیادہ ہوتی ہے۔ سائٹ ری ایکٹیویٹیز کو نیوکلیوٹائڈ پر منحصر حد () سے تجاوز کرنا چاہیے جن کی تجرباتی طور پر تعریف اس طرح کی گئی ہے: جہاں نیوکلیوٹائڈ U، A، C، یا G پس منظر کی حد ہے جس کی وضاحت نیوکلیوٹائڈز کی 90 ٪ ری ایکٹیویٹی ویلیوز کے ذریعے کی گئی ہے ایک> 10 Å گروپ میں تمام نیوکلیوٹائڈز کے لیے تمام ری ایکٹیویٹیز کا میڈین ہے جو تمام نیوکلیوٹائڈز کے لیے ری ایکٹیویٹیز کا معیاری انحراف ہے حساب شدہ Z-عنصر صفر سے زیادہ ہے حساب شدہ Z-عنصر کی تعریف اس طرح کی گئی ہے، جہاں SDA اور UV کے ساتھ علاج کیے جانے والے نیوکلیوٹائڈ کی اتپریورتن کی شرح ہے اور صرف UV کے ساتھ علاج کیے جانے والے نیوکلیوٹائڈ کی اتپریورتن کی شرح ہے، جہاں علاج (SDA + UV یا UV صرف) پروٹین-RNA تعامل نیٹ ورک ہے۔ آر این پی-ایم اے پی ارتباط آر این پی-ایم اے پی سائٹس سے آزاد آر این اے کے لیے پروٹین کے پابند ہونے کی ایک تکمیلی پیمائش فراہم کرتے ہیں۔ ان کی شناخت جی-ٹیسٹ فریم ورک کا استعمال کرتے ہوئے کی جاتی ہے جسے رنگ میپر کہا جاتا ہے۔ آر این پی-ایم اے پی ارتباط کے لیے کم از کم دو کراس لنکس بنانے کے لیے ایک واحد آر این اے مالیکیول کی ضرورت ہوتی ہے اور یہ تین منظرناموں میں سے کسی ایک سے پیدا ہوتا ہے: ایک واحد پروٹین ایک آر این اے کے دو مقامات سے جڑا ہوتا ہے۔ دو پروٹین جو ایک آر این اے پر دو مقامات پر تعامل کرتے ہیں اور جڑے ہوتے ہیں۔ دو پروٹین ایک مربوط اسمبلی کے عمل کے ذریعے ایک آر این اے پر دو مقامات پر جمع کیے جاتے ہیں۔ آر این پی-ایم اے پی ارتباط کا استعمال کرتے ہوئے، پروٹین-آر این اے تعامل سائٹس کا ایک نیٹ ورک پایا جاتا ہے اور پھر اسے فعال تجزیہ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ متعلقہ طریقے کراس لنکنگ امیونوپریسیپیٹیشن (سی ایل آئی پی) سی ایل آئی پی یو وی کراس لنکنگ اور امیونوپریسیپیٹیشن کو ملا کر آر این اے کے ساتھ پروٹین کے تعاملات کا تجزیہ کرتا ہے۔ سی ایل آئی پی پر مبنی تکنیکیں جینوم وسیع پیمانے پر دلچسپی کے آر این اے بائنڈنگ پروٹین بائنڈنگ سائٹس کا نقشہ بنانے کے قابل ہیں۔ سی ایل آئی پی پر مبنی بہت سے طریقے ہیں جن میں شامل ہیں: ایچ آئی ٹی ایس-سی ایل آئی پی (کراس لنکنگ امیونوپریسیپیٹیشن یا سی ایل آئی پی-سی کیو کے ذریعے الگ تھلگ آر این اے کی ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ) پی اے آر-سی ایل آئی پی (فوٹو ایکٹیویٹ ایبل ربونیوکلیوسائڈ-بہتر کراس لنکنگ اور امیونوپریسیپیٹیشن) آئی سی ایل آئی پی (انفرادی نیوکلیوٹائڈ-ریزولوشن کراس لنکنگ اور امیونوپریسیپیٹیشن) ای سی ایل آئی پی (بہتر کراس لنکنگ اور امیونوپریسیپیٹیشن کے بعد ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ) ایس سی ایل آئی پی (سادہ کراس لنکنگ اور امیونوپریسیپیٹیشن) ماس سپیکٹرومیٹری مقداری ماس سپیکٹرومی لیبلنگ ایم ایس کے طریقوں میں مستحکم آاسوٹوپ لیبلز کا تفریقی استعمال یا نمونوں اور کنٹرول میں پروٹین کی کیمیائی ٹیگنگ شامل ہے۔ یہ لیبل شدہ پیپٹائڈز کے تناسب کے ذریعے افزودگی کے اسکور اور حقیقی بائنڈنگ پارٹنرز حاصل کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ لیبل فری ایم ایس طریقے نمونوں اور کنٹرول میں پروٹین کی شناخت کرنے کے قابل ہیں۔ غیر مخصوص پروٹینوں کے لیے حقیقی بائنڈنگ پارٹنرز میں فرق کرنے کے لیے، غیر مقداری ایم ایس سے سپیکٹرم گنتی کے اعداد و شمار کے ساتھ استعمال ہونے والے تجزیاتی ٹولز کو حقیقی آر بی پی-آر این اے تعامل کے امکانات کو اسکور کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ فوائد اور حدود۔ فوائد آر این پی-ایم اے پی بائنڈنگ سائٹ ڈینسٹی اور باہمی ربط کے ذریعے فعال طور پر اہم آر این اے-پروٹین بائنڈنگ نیٹ ورکس کو ظاہر کرنے میں مدد کر سکتا ہے جو تعامل کرنے والے پروٹینوں کے پچھلے علم سے آزاد ہے۔ تجزیہ کی غیر جانبدار نوعیت کی وجہ سے، آر این پی-ایم اے پی انواع کے درمیان محفوظ آر این اے-پروٹین تعاملات کا پتہ لگانے میں کامیاب ہے۔ آر این پی-ایم اے پی بڑے غیر کوڈنگ آر این اے یا یہاں تک کہ وائرل آر این اے میں فعال طور پر اہم عناصر کی خصوصیت کو آسان بنانے کے قابل بھی ہے۔ حدود ایک الگ تھلگ تکنیک کے طور پر، آر این پی-ایم اے پی کو پروٹین-آر این اے بائنڈنگ میکانزم یا پروٹین کی شناخت کا تعین کرنے کے لیے استعمال نہیں کیا جا سکتا۔ ایسا کرنے کے لیے، آر این پی-ایم اے پی کو دیگر تکنیکوں جیسے سی ایل آئی پی اور ماس سپیکٹرومیٹری کے ساتھ مل کر استعمال کیا جانا چاہیے۔ تجزیہ کے لیے آر این پی-ایم اے پی کو انتہائی اعلی پڑھنے کی گہرائی کی ضرورت ہوتی ہے۔ آر این پی-ایم اے پی سائٹس کی شناخت کے لیے 1000x سیکوینسنگ کوریج کی ضرورت ہے، جبکہ آر این پی-ایم اے پی ارتباط سائٹس کو 10,000x سیکوینسنگ کوریج کی ضرورت ہے۔ دور دراز (> 500 نیوکلیوٹائڈز) آر این پی-ایم اے پی سائٹس کے درمیان آر این پی-ایم اے پی ارتباط کو نمایاں کرنے کی صلاحیت پر شدید حدود ہیں۔ یہ ایم اے پی ریورس ٹرانسکرپشن پروسیکیوٹی (500-600 نیوکلیوٹائڈز) اور سیکوینسنگ انسٹرومنٹ کلسٹرنگ (<1,000 نیوکلیوٹائڈز) کی حدود کی وجہ سے ہے۔ حوالہ جات جینیاتی تکنیک آر این اے