Cycloheximide chase
سائکلوہیکسیمائڈ پیچھا جانچ ایک تجرباتی تکنیک ہے جو سالماتی اور سیلولر حیاتیات میں مستحکم حالت کے پروٹین کے استحکام کی پیمائش کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ سائکلوہیکسیمائڈ ایک ایسی دوا ہے جو یوکرائیوٹک پروٹین کے ترجمہ میں لمبائی کے مرحلے کو روکتی ہے، اس طرح پروٹین کی ترکیب کو روکتی ہے۔ کلچرڈ خلیوں میں سائکلوہیکسیمائڈ کا اضافہ اور اس کے بعد متعدد ٹائم پوائنٹس پر پروٹین لائسیس کا انعقاد وقت کے ساتھ پروٹین کے انحطاط کا مشاہدہ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے اور اسے پروٹین کی نصف زندگی کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ان جانچوں کے بعد اکثر پروٹین کی کثرت کا اندازہ لگانے کے لیے ویسٹرن بلاٹنگ کی جاتی ہے اور امیج جے جیسے مقداری ٹولز کا استعمال کرتے ہوئے ان کا تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ عمل درآمد سائکلوہیکسیمائڈ کے تعاقب کی جانچ مختلف قسم کے خلیوں جیسے خمیر اور ممالیہ خلیوں کی لکیروں کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی ہے۔ تجزیہ کے لیے استعمال ہونے والے خلیے کے نظام پر منحصر ہے، جانچ درخواست اور وقت کے لحاظ سے مختلف ہو سکتی ہے۔ مثال کے طور پر، خمیر کے خلیات جو دلچسپی کے پروٹین سبسٹریٹ کا اظہار کرتے ہیں عام طور پر 90 منٹ تک چلنے والے سائکلوہیکسیمائڈ کے تعاقب کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ پروٹین کا کاروبار ہو سکے۔ اس کے برعکس، پروٹین جو ممالیہ سیل لائنوں میں ظاہر ہوتے ہیں وہ مستحکم حالت میں زیادہ مستحکم ہوتے ہیں اور انہیں 3 سے 8 گھنٹے تک پیچھا کرنے کی ضرورت پڑ سکتی ہے۔ پروٹین کی پیچیدگی پر منحصر ہے اور آیا یہ ماڈل سسٹم کے لیے حد سے زیادہ اظہار یا اینڈوجینس ہے، تعاقب کی مطلوبہ لمبائی مختلف ہو سکتی ہے۔ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ پورے تعاقب کے دوران پروٹین کی ترکیب کو روکا جائے، سائکلوہیکسیمائڈ کو اکثر ہر چند گھنٹوں میں نمونے میں شامل کیا جاتا ہے۔ خمیر میں، حذف کرنے والے تناؤ اکثر سائکلوہیکسیمائڈ کے تعاقب کے ساتھ وقت کے ساتھ پروٹین کے استحکام کا اندازہ کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ مثال کے طور پر، خمیر کے تناؤ میں اہم انحطاط کی مشینری کی کمی ہوتی ہے جیسے چیپرونز، ای 3 لیگیز، اور ویکیوولر پروٹین اکثر دلچسپی کے پروٹین سبسٹریٹ کے لیے انحطاط کے طریقہ کار کا تعین کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ منشیات کے علاج (جیسے کہ ایم جی 132) کو انحطاط کے اقدامات کو روکنے کے لیے بھی استعمال کیا جاتا ہے، اس کے بعد سائکلوہیکسیمائڈ کا پیچھا کیا جاتا ہے تاکہ یہ مشاہدہ کیا جا سکے کہ دلچسپی کے پروٹین کا استحکام کس طرح متاثر ہوتا ہے۔ یہ تجربات ممالیہ خلیوں میں خمیر کو ہٹانے کے تناؤ کی جگہ مطابقت پذیر ناک ڈاؤن طریقہ کار کے نفاذ کے ساتھ کیے جا سکتے ہیں۔ سائکلوہیکسیمائڈ کا تعاقب اس بات کا اندازہ لگانے کے لیے بھی قیمتی ہے کہ مختلف تغیرات پروٹین کے استحکام کو کس طرح متاثر کرتے ہیں۔ خمیر اور ممالیہ خلیوں میں تجربات کیے گئے ہیں تاکہ پروٹین کے استحکام کے لیے درکار اہم باقیات کا تعین کیا جا سکے اور بیماری سے وابستہ تغیرات خلیے کے اندر پروٹین کی نصف زندگی کو کس طرح متاثر کر سکتے ہیں۔ یہ معلومات پروٹین فولڈنگ کی پیچیدگیوں کو سمجھنے کے لیے قیمتی ہے اور یہ کہ کس طرح تغیرات ان بیماریوں کے پیتھوجینسیس میں حصہ ڈالتے ہیں جن سے وہ وابستہ ہیں۔ فوائد پروٹین کے استحکام کا اندازہ لگانے والے دوسرے طریقوں کے برخلاف سائکلوہیکسیمائڈ پیچھا جانچ کا استعمال کرنے کے بہت سے فوائد ہیں۔ سائکلوہیکسیمائڈ کے تعاقب کو مختلف قسم کے ماڈل سسٹمز کے ساتھ استعمال کیا جا سکتا ہے اور اسے تقریبا کسی بھی پروٹین سبسٹریٹ کا مطالعہ کرنے کے لیے لاگو کیا جا سکتا ہے۔ سائکلوہیکسیمائڈ دیگر ادویات کے مقابلے میں نسبتا سستا مرکب ہے اور یہ اس وقت مؤثر ہوتا ہے جب اسے مختصر مدت کے لیے کم مقدار میں استعمال کیا جائے۔ پلس چیس اسیسز سائکلوہیکسیمائڈ چیس اسیسز کا ایک متبادل طریقہ ہے اور اس میں نئے ترجمہ شدہ پروٹینز کی تابکار لیبلنگ شامل ہوتی ہے جس کے بعد اسی طرح کی "پیچھا" کی مدت ہوتی ہے۔ اگرچہ یہ طریقہ معلوماتی ہے اور نوزائیدہ پروٹین کی کثرت کا مشاہدہ کرنے کا فائدہ فراہم کرتا ہے، لیکن اس کے لیے درکار تابکار مواد کم شیلف لائف کے ساتھ مہنگا ہے اور سائکلوہیکسیمائڈ کے مقابلے میں استعمال کرنے کے لیے زیادہ احتیاط کا مطالبہ کرتا ہے۔ نقصانات سائکلوہیکسیمائڈ پیچھا جانچ کرنے کے کچھ نقصانات میں سائکلوہیکسیمائڈ کی زہریلی نوعیت شامل ہے۔ جب طویل عرصے تک اعلی ارتکاز پر استعمال کیا جاتا ہے، تو سائکلوہیکسیمائڈ سیل کے اندر ڈی این اے کو نقصان پہنچائے گا اور اہم سیلولر فنکشن کو خراب کرے گا۔ اس وجہ سے، سائکلوہیکسیمائڈ کا پیچھا عام طور پر 12 گھنٹے سے زیادہ نہیں ہوتا ہے۔ اگر کسی خاص طور پر مستحکم پروٹین کے کاروبار کا مطالعہ کیا جا رہا ہے تو یہ ایک حد پیش کرتا ہے۔ مزید برآں، سائکلوہیکسیمائڈ کا پیچھا صرف مستحکم ریاستی پروٹین کی سطح کو دیکھنے کی صلاحیت پیش کرتا ہے جیسا کہ نئی ترجمہ شدہ پروٹین کی سطح جیسے نبض کے تعاقب کے ساتھ ہوتا ہے۔ لہذا، صرف پروٹین کا انحطاط دیکھا جا سکتا ہے نہ کہ پروٹین کی پختگی۔ تجربات سالماتی حیاتیات خلیہ حیاتیات پروٹین