Super-resolution microscopy
سپر ریزولوشن مائکروسکوپی آپٹیکل مائکروسکوپی میں تکنیکوں کا ایک سلسلہ ہے جو ایسی تصاویر کو تفریق کی حد کے ذریعہ عائد کردہ ریزولوشن سے زیادہ ریزولوشن کی اجازت دیتا ہے، جو روشنی کے تفریق کی وجہ سے ہوتا ہے۔ سپر ریزولوشن امیجنگ تکنیک کا انحصار نیئر فیلڈ (فوٹون ٹنلنگ مائکروسکوپی کے ساتھ ساتھ وہ جو پینڈری سپر لینس اور نیئر فیلڈ اسکیننگ آپٹیکل مائکروسکوپی استعمال کرتے ہیں) یا فار فیلڈ پر ہوتا ہے۔ مؤخر الذکر پر انحصار کرنے والی تکنیکوں میں وہ ہیں جو ریزولوشن کو صرف معمولی طور پر (تقریبا دو کے عنصر تک) تفریق کی حد سے باہر بہتر بناتی ہیں، جیسے کہ بند پن ہول کے ساتھ کنفوکل مائکروسکوپی یا کمپیوٹیشنل طریقوں جیسے ڈیکونولوشن یا ڈیٹیکٹر پر مبنی پکسل ری اسائنمنٹ (جیسے۔ ری اسکین مائکروسکوپی، پکسل ری اسائنمنٹ)، 4 پی آئی مائکروسکوپ، اور اسٹرکچرڈ-ایلیومینیشن مائکروسکوپی ٹیکنالوجیز جیسے سم اور ایس ایم آئی۔ دور کے میدان میں سپر ریزولوشن مائکروسکوپی کے طریقوں کے دو بڑے گروپ ہیں جو بہت بڑے عنصر کے ذریعے ریزولوشن کو بہتر بنا سکتے ہیں: ڈیٹرمینیسٹک سپر ریزولوشن: حیاتیاتی مائکروسکوپی میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والے ایمیٹر، فلوروفورز، ایکسائٹیشن کے لیے غیر لکیری ردعمل ظاہر کرتے ہیں، جسے ریزولوشن کو بڑھانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح کے طریقوں میں ایس ٹی ای ڈی، جی ایس ڈی، ریسولفٹ اور ایس ایس آئی ایم شامل ہیں۔ سٹوچسٹک سپر ریزولوشن: بہت سے سالماتی روشنی کے ذرائع کی کیمیائی پیچیدگی انہیں ایک پیچیدہ عارضی طرز عمل فراہم کرتی ہے، جس کا استعمال کئی قریبی فلوروفورز کو الگ الگ اوقات میں روشنی کا اخراج کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے اور اس طرح وقت کے ساتھ حل ہو جاتا ہے۔ ان طریقوں میں سپر ریزولوشن آپٹیکل فلوکچوایشن امیجنگ (ایس او ایف آئی) اور تمام سنگل مالیکیول لوکلائزیشن کے طریقے (ایس ایم ایل ایم) شامل ہیں، جیسے ایس پی ڈی ایم، ایس پی ڈی ایم فائیموڈ، پی اے ایل ایم، ایف پی اے ایل ایم، اسٹورم، اور ڈی ایس ٹی او آر ایم۔ 8 اکتوبر 2014 کو کیمسٹری کا نوبل انعام ڈبلیو ای ایرک بیٹزگ کو دیا گیا۔ مویرنر اور اسٹیفن ہیل "سپر ریزولیوڈ فلوروسینس مائکروسکوپی کی ترقی" کے لیے، جو "نینو ڈائیمینشن میں آپٹیکل مائکروسکوپی" لاتا ہے۔ بائیو میڈیکل ریسرچ کمیونٹی کے ذریعے سپر ریزولوشن مائکروسکوپی کے مختلف طریقوں کو تیزی سے اپنایا جا رہا ہے، اور یہ تکنیکیں سالماتی سطح پر حیاتیاتی فعل کو سمجھنے کے لیے ناگزیر اوزار بن رہی ہیں۔ تاریخ 1978 تک، ابی کی حد کو توڑنے کے لیے پہلے نظریاتی خیالات تیار کیے گئے تھے، جس میں 4 پی آئی خوردبین کو کنفوکل لیزر اسکیننگ فلوروسینس خوردبین کے طور پر استعمال کرنے کا مطالبہ کیا گیا تھا جہاں روشنی ہر طرف سے ایک مشترکہ فوکس پر مرکوز ہوتی ہے جو 'پوائنٹ بائی پوائنٹ' کے ذریعے اسکین کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ تاہم 1978 کی اشاعت نے ایک نامناسب جسمانی نتیجہ اخذ کیا تھا (یعنی۔ روشنی کا ایک نقطہ نما مقام) اور ٹھوس زاویے کے دوسرے رخ کو شامل کرنے کے اصل فائدے کے طور پر محوری ریزولوشن میں اضافے سے مکمل طور پر محروم ہو گیا تھا۔ مندرجہ ذیل میں سے کچھ معلومات کیمسٹری بلاگ کے ذیلی تفریق خوردبین تکنیکوں کے جائزے سے (اجازت کے ساتھ) اکٹھا کی گئی تھیں۔ 1986 میں، محرک اخراج پر مبنی ایک سپر ریزولوشن آپٹیکل خوردبین کو اوکھونن نے پیٹنٹ کرایا تھا۔ سپر ریزولوشن تکنیک فوٹون ٹنلنگ مائکروسکوپی (پی ٹی ایم) لوکل اینہانسمنٹ/اے این ایس او ایم/آپٹیکل نینو اینٹینا نیئر فیلڈ آپٹیکل رینڈم میپنگ (این او آر ایم) مائکروسکوپی نیئر فیلڈ آپٹیکل رینڈم میپنگ (این او آر ایم) مائکروسکوپی ایک دور فیلڈ مائکروسکوپ کے ذریعے آپٹیکل نیئر فیلڈ کے حصول کا ایک طریقہ ہے جس میں نینو پارٹیکلز کی براؤنین حرکت کو وسرجن مائع میں مشاہدہ کیا جاتا ہے۔ این او آر ایم سٹاکسٹک طور پر حرکت پذیر نینو پارٹیکلز کے ذریعے آبجیکٹ سرفیس اسکیننگ کا استعمال کرتا ہے۔ خوردبین کے ذریعے نینو پارٹیکلز سمیٹرک گول دھبوں کی طرح نظر آتے ہیں۔ اسپاٹ کی چوڑائی پوائنٹ اسپریڈ فنکشن (~ 250 این ایم) کے برابر ہے اور اس کی وضاحت خوردبین ریزولوشن کے ذریعے کی جاتی ہے۔ دیئے گئے ذرہ کے لیٹرل کوآرڈینیٹس کا اندازہ خوردبین کے ریزولوشن سے بہت زیادہ درستگی کے ساتھ کیا جا سکتا ہے۔ بہت سے فریموں سے معلومات اکٹھا کرکے خوردبین کے پورے میدان میں قریب فیلڈ کی شدت کی تقسیم کا نقشہ بنایا جا سکتا ہے۔ این ایس او ایم اور اے این ایس او ایم کے مقابلے میں اس طریقہ کار کو ٹپ پوزیشننگ کے لیے کسی خاص سامان کی ضرورت نہیں ہے اور اس میں دیکھنے کا ایک بڑا میدان اور توجہ کی گہرائی ہے۔ اسکیننگ "سینسرز" کی بڑی تعداد کی وجہ سے کوئی بھی کم وقت میں تصویری حصول حاصل کر سکتا ہے۔ 4 پی آئی اے 4 پی آئی خوردبین ایک لیزر اسکیننگ فلوروسینس خوردبین ہے جس میں بہتر محوری ریزولوشن ہے۔ 500-700 nm کی عام قیمت کو 100-150 nm تک بہتر بنایا جا سکتا ہے، جو کہ معیاری کنفوکل مائکروسکوپی کے مقابلے میں 5-7 گنا کم حجم کے ساتھ تقریبا گول فوکل اسپاٹ سے مطابقت رکھتا ہے۔ ریزولوشن میں بہتری دو مخالف آبجیکٹیو لینس کا استعمال کرکے حاصل کی جاتی ہے، یہ دونوں ایک ہی ہندسی مقام پر مرکوز ہیں۔ نیز، دونوں معروضی لینس میں سے ہر ایک کے ذریعے نظری راستے کی لمبائی میں فرق کو احتیاط سے کم کیا جاتا ہے۔ اس کے ذریعے، دونوں مقاصد کے مشترکہ فوکل ایریا میں رہنے والے مالیکیولز کو دونوں طرف سے مربوط طور پر روشن کیا جا سکتا ہے، اور عکاسی یا خارج ہونے والی روشنی کو مربوط طور پر جمع کیا جا سکتا ہے، یعنی۔ ڈٹیکٹر پر خارج ہونے والی روشنی کی مربوط سپرپوزیشن ممکن ہے۔ روشنی اور پتہ لگانے کے لیے استعمال ہونے والے ٹھوس زاویے کو بڑھایا جاتا ہے اور مثالی صورت کے قریب پہنچ جاتا ہے، جہاں نمونے کو روشن کیا جاتا ہے اور بیک وقت ہر طرف سے پتہ لگایا جاتا ہے۔ اب تک، 4 پی آئی خوردبین میں بہترین معیار طے شدہ خلیوں میں ایس ٹی ای ڈی خوردبین اور زندہ خلیوں میں بدلنے والے پروٹین کے ساتھ ریسولفٹ خوردبین کے ساتھ مل کر حاصل کیا گیا ہے۔ اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی (SIM) اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی (SIM) قابل مشاہدہ علاقے سے باہر فریکوئنسی اسپیس سے معلومات اکٹھا کرکے مقامی ریزولوشن کو بڑھاتا ہے۔ یہ عمل باہمی جگہ میں کیا جاتا ہے: ایس آئی امیج کا فورئیر ٹرانسفارم (ایف ٹی) باہمی جگہ کے مختلف علاقوں سے سپر امپوزڈ اضافی معلومات پر مشتمل ہوتا ہے۔ کئی فریموں کے ساتھ جہاں روشنی کو کسی مرحلے سے منتقل کیا جاتا ہے، کمپیوٹیشنل طور پر ایف ٹی امیج کو الگ کرنا اور دوبارہ تعمیر کرنا ممکن ہے، جس میں بہت زیادہ ریزولوشن کی معلومات ہوتی ہے۔ ریورس ایف ٹی دوبارہ تعمیر شدہ تصویر کو سپر ریزولوشن والی تصویر میں واپس کرتا ہے۔ سم مائکروسکوپی ممکنہ طور پر الیکٹران مائکروسکوپی کو کچھ طبی تشخیص کے آلے کے طور پر تبدیل کر سکتی ہے۔ ان میں گردے کی خرابی، گردے کے کینسر اور خون کی بیماریوں کی تشخیص شامل ہے۔ اگرچہ "اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی" کی اصطلاح بعد کے سالوں میں دوسروں کے ذریعہ وضع کی گئی تھی، گوریرا (1995) نے پہلی بار ایسے نتائج شائع کیے جن میں 50 این ایم پچ گریٹنگ کے پیٹرن والی روشنی نے پچ 50 این ایم کی دوسری گریٹنگ کو روشن کیا، جس میں گریٹنگز ایک دوسرے کے حوالے سے گھومتی ہیں۔ میگنفکیشن حاصل کرنے کے لیے درکار کونیی مقدار۔ اگرچہ روشن کرنے والی طول موج 650 این ایم تھی، لیکن 50 این ایم گریٹنگ کو آسانی سے حل کیا گیا۔ اس نے 232 این ایم کی آبے ریزولوشن کی حد کے مقابلے میں تقریبا 5 گنا بہتری دکھائی جو کہ استعمال شدہ عددی یپرچر اور طول موج کے لیے حاصل کی جانے والی سب سے چھوٹی ہونی چاہیے تھی۔ اس کام کی مزید ترقی میں، گوریرا نے یہ ظاہر کیا کہ انتہائی حل شدہ لیٹرل ٹپوگرافی ایونسینٹ فیلڈ کو فیز شفٹ کرکے حاصل کی جاتی ہے۔ کئی امریکی پیٹنٹ گوریرا کو انفرادی طور پر، یا ساتھیوں کے ساتھ جاری کیے گئے، اور پولرائڈ کارپوریشن کو تفویض کیے گئے۔ آپٹیکل ڈیٹا اسٹوریج اور مائکروسکوپی میں اس سپر ریزولوشن تکنیک کے استعمال کے لیے اس ٹیکنالوجی کے لائسنس ڈائر انرجی سسٹمز، کیلی میٹرکس انکارپوریشن اور نینوپیک کارپوریشن نے حاصل کیے تھے۔ مقامی طور پر ماڈیولڈ روشنی (ایس ایم آئی) ساختی روشنی کے ایک نفاذ کو مقامی طور پر ماڈیولڈ روشنی (ایس ایم آئی) کے نام سے جانا جاتا ہے۔ معیاری ساختہ روشنی کی طرح، ایس ایم آئی تکنیک خوردبین کے پوائنٹ اسپریڈ فنکشن (پی ایس ایف) کو مناسب طریقے سے تبدیل کرتی ہے۔ تاہم اس معاملے میں، "آپٹیکل ریزولوشن خود بہتر نہیں ہے" ؛ اس کے بجائے ساختی روشنی کا استعمال فلوروسینٹ اشیاء کی فاصلے کی پیمائش کی درستگی کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے، تاکہ "چند دسیوں نینو میٹر کے سالماتی طول و عرض پر سائز کی پیمائش کو قابل بنایا جا سکے"۔ ورٹیکو ایس ایم آئی خوردبین محور کے ساتھ ایک یا دو مخالف مداخلت کرنے والی لیزر بیموں کا استعمال کرکے ساختی روشنی حاصل کرتا ہے۔ تصویر میں دکھائی جانے والی شے کو پھر لہر کے میدان کے ذریعے اعلی صحت سے متعلق مراحل میں منتقل کیا جاتا ہے، یا لہر کے میدان کو خود مرحلے کی شفٹوں کے ذریعے شے کے مقابلے میں منتقل کیا جاتا ہے۔ اس کے نتیجے میں محوری سائز اور فاصلے کے حل میں بہتری آتی ہے۔ ایس ایم آئی کو دیگر سپر ریزولوشن ٹیکنالوجیز کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے، مثال کے طور پر 3 ڈی لیمون یا ایل ایس آئی-ٹی آئی آر ایف کے ساتھ کل اندرونی عکاسی انٹرفیرومیٹر کے طور پر پس منظر کی ساخت والی روشنی کے ساتھ (یہ آخری آلہ اور تکنیک بنیادی طور پر ایک فیز شفٹڈ فوٹون ٹنلنگ خوردبین ہے، جو فیز شفٹڈ ایونسینٹ فیلڈ (گوریرا، 1996) کے ساتھ کل اندرونی عکاسی روشنی خوردبین کو استعمال کرتا ہے۔ یہ ایس ایم آئی تکنیک کسی کو پہلے سے بے مثال نظری ریزولوشن کے ساتھ انسانی آنکھ کے بافتوں کے حصوں میں آٹوفلووروفور کی تقسیم کی ہلکی نظری تصاویر حاصل کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ تین مختلف محرک طول موج (488، 568، اور 647 این ایم) کا استعمال، آٹو فلوریسنس سگنل کے بارے میں سپیکٹرم کی معلومات اکٹھا کرنے کے قابل بناتا ہے۔ اس کا استعمال میکولر انحطاط سے متاثر انسانی آنکھ کے بافتوں کی جانچ کے لیے کیا گیا ہے۔ تعیناتی فعال تکنیکیں ریورسیبل سیچوریبل آپٹیکل فلوروسینس ٹرانزیشنز (RESOLFT) خوردبین ایک نظری خوردبین ہے جس میں بہت زیادہ ریزولوشن ہے جو ان نمونوں میں تفصیلات کی تصویر لے سکتا ہے جن کی روایتی یا کنفوکل خوردبین سے تصویر نہیں لی جا سکتی۔ ریسولفٹ کے اندر ایس ٹی ای ڈی خوردبین اور جی ایس ڈی خوردبین کے اصولوں کو عام کیا گیا ہے۔ نیز، ریسولفٹ یا ایس ایس آئی ایم کے علاوہ دیگر تصورات کے ساتھ تکنیکیں بھی ہیں۔ مثال کے طور پر، نائٹروجن ویکینسی سینٹر کی آپٹیکل اینڈ گیٹ پراپرٹی کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس مائکروسکوپی، یا تھرمل ریڈی ایشن (ایس ای ٹی آر) کے محرک اخراج کے ذریعے سپر ریزولوشن، جو بلیک باڈی ریڈی ایشن کی اندرونی سپر لائنرٹیز کا استعمال کرتا ہے اور مائکروسکوپی سے آگے سپر ریزولوشن کے تصور کو وسعت دیتا ہے۔ محرک اخراج کی کمی (ایس ٹی ای ڈی) محرک اخراج کی کمی مائکروسکوپی (ایس ٹی ای ڈی) دو لیزر دالوں کا استعمال کرتی ہے، فلوروفورز کی ان کی فلوروسینٹ حالت میں حوصلہ افزائی کے لیے محرک پلس اور محرک اخراج کے ذریعے فلوروفورز کی حوصلہ شکنی کے لیے ایس ٹی ای ڈی پلس۔ عملی طور پر، ایکسائٹیشن لیزر پلس کو پہلے لاگو کیا جاتا ہے جس کے بعد جلد ہی ایک ایس ٹی ای ڈی پلس آتی ہے (مسلسل لہر لیزرز کا استعمال کرتے ہوئے دالوں کے بغیر ایس ٹی ای ڈی بھی استعمال کیا جاتا ہے)۔ مزید برآں، ایس ٹی ای ڈی پلس کو اس طرح سے تبدیل کیا جاتا ہے تاکہ اس میں ایک صفر شدت والا مقام ہو جو ایکسائٹیشن فوکل اسپاٹ کے ساتھ موافق ہو۔ ایس ٹی ای ڈی بیم کی شدت پر محرک اخراج کی شرح کے غیر لکیری انحصار کی وجہ سے، فوکل ایکسائٹیشن اسپاٹ کے آس پاس کے تمام فلوروفورز اپنی غیر حالت (فلوروفورز کی زمینی حالت) میں ہوں گے۔ اس فوکل اسپاٹ کو اسکین کرکے، تصویر کو دوبارہ حاصل کیا جاتا ہے۔ مساوات () کے مطابق، ایکسائٹیشن فوکل اسپاٹ کے پوائنٹ اسپریڈ فنکشن (پی ایس ایف) کی نصف زیادہ سے زیادہ (ایف ڈبلیو ایچ ایم) پر مکمل چوڑائی کو نظریاتی طور پر ایس ٹی ای ڈی پلس کی شدت کو بڑھا کر صوابدیدی چوڑائی تک کمپریس کیا جا سکتا ہے۔ () جہاں  मुंदلی ریزولوشن  मुंदلی ریزولوشن ہے، ड़िفریکشن محدود پی ایس ایف کا ایف ڈبلیو ایچ ایم ہے، آئی میکس ایس ٹی ای ڈی لیزر کی چوٹی کی شدت ہے، اور سنترپت اخراج کی کمی کو حاصل کرنے کے لیے درکار حد کی شدت ہے۔ ایس ٹی ای ڈی کا بنیادی نقصان، جس نے اس کے وسیع پیمانے پر استعمال کو روکا ہے، یہ ہے کہ مشینری پیچیدہ ہے۔ ایک طرف، تصویر کے حصول کی رفتار دیکھنے کے بڑے شعبوں کے لیے نسبتا سست ہوتی ہے کیونکہ تصویر کو بازیافت کرنے کے لیے نمونے کو اسکین کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔ دوسری طرف، یہ دیکھنے کے چھوٹے شعبوں کے لیے بہت تیز ہو سکتا ہے: فی سیکنڈ 80 فریم تک کی ریکارڈنگ دکھائی گئی ہے۔ ایس ٹی ای ڈی سے وابستہ بڑی آئی ایس ویلیو کی وجہ سے، ہائی انٹینسیٹی ایکسائٹیشن پلس کی ضرورت ہوتی ہے، جو نمونے کو نقصان پہنچا سکتی ہے۔ گراؤنڈ اسٹیٹ ڈیپلیشن (جی ایس ڈی) گراؤنڈ اسٹیٹ ڈیپلیشن مائکروسکوپی (جی ایس ڈی مائکروسکوپی) فلورفور کی ٹرپلٹ حالت کو آف اسٹیٹ اور سنگلٹ حالت کو آن اسٹیٹ کے طور پر استعمال کرتا ہے، جس کے ذریعے ایک ایکسائٹیشن لیزر کا استعمال فلورفورز کو سنگلٹ اسٹیٹ مالیکیول کے دائرے میں ٹرپلٹ حالت میں لے جانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ یہ کافی حد تک ایس ٹی ای ڈی کی طرح ہے، جہاں آف اسٹیٹ فلوروفورز کی زمینی حالت ہے، یہی وجہ ہے کہ اس معاملے میں مساوات () بھی لاگو ہوتی ہے۔ قیمت ایس ٹی ای ڈی سے کم ہے، جس سے لیزر کی بہت کم شدت پر سپر ریزولوشن امیجنگ ممکن ہوتی ہے۔ ایس ٹی ای ڈی کے مقابلے میں، اگرچہ، جی ایس ڈی میں استعمال ہونے والے فلوروفورز عام طور پر کم فوٹوسٹیبل ہوتے ہیں ؛ اور ٹرپلٹ حالت کی سنترپتی کا احساس کرنا مشکل ہو سکتا ہے۔ سیچوریٹڈ اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی (ایس ایس آئی ایم) سیچوریٹڈ اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی (ایس ایس آئی ایم) ایکسائٹیشن لیزر کی شدت پر فلوروفورز کے اخراج کی شرح کے غیر لکیری انحصار کا استحصال کرتی ہے۔ فلورفورز کو ان کی فلوروسینٹ حالت میں سیر کرنے کے لیے ضرورت کے قریب چوٹی کی شدت کے ساتھ سینوسائڈل روشنی کے نمونے کو لاگو کرنے سے، کوئی موائر کے کنارے کو بازیافت کرتا ہے۔ کناروں میں اعلی ترتیب کی مقامی معلومات ہوتی ہیں جنہیں کمپیوٹیشنل تکنیکوں کے ذریعے نکالا جا سکتا ہے۔ ایک بار معلومات نکالنے کے بعد، ایک سپر ریزولوشن والی تصویر بازیافت کی جاتی ہے۔ ایس ایس آئی ایم میں روشنی کے نمونے کو متعدد بار تبدیل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، جس سے تکنیک کے عارضی حل کو مؤثر طریقے سے محدود کیا جاتا ہے۔ اس کے علاوہ سنترپت حالات کی وجہ سے بہت ہی فوٹوسٹیبل فلوروفورز کی ضرورت ہے، جو نمونے پر تابکاری کو نقصان پہنچاتے ہیں اور ممکنہ ایپلی کیشنز کو محدود کرتے ہیں جن کے لیے ایس ایس آئی ایم کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس خوردبین کی مثالیں سیکشن اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی (SIM) کے تحت دکھائی گئی ہیں: سیل نیوکلیز اور مائٹوٹک مراحل کی تصاویر جو 3D-SIM مائکروسکوپی کے ساتھ ریکارڈ کی گئی ہیں۔ اسٹوکاسٹک فنکشنل تکنیک لوکلائزیشن مائکروسکوپی سنگل مالیکیول لوکلائزیشن مائکروسکوپی (ایس ایم ایل ایم) ان تمام خوردبین تکنیکوں کا خلاصہ پیش کرتی ہے جو اخراج کاروں کو الگ کرکے اور ان کی تصاویر کو پوائنٹ اسپریڈ فنکشن (پی ایس ایف) کے ساتھ فٹ کرکے سپر ریزولوشن حاصل کرتی ہیں۔ عام طور پر، پوائنٹ اسپریڈ فنکشن (~ 250 این ایم) کی چوڑائی ریزولوشن کو محدود کرتی ہے۔ تاہم، ایک الگ تھلگ ایمیٹر کو دیکھتے ہوئے، کوئی بھی مساوات () کے مطابق اس کی شدت سے محدود درستگی کے ساتھ اس کے مقام کا تعین کرنے کے قابل ہوتا ہے۔ () جہاں Δloc لوکلائزیشن کی درستگی ہے، Δ پی ایس ایف کا ایف ڈبلیو ایچ ایم (نصف زیادہ سے زیادہ پر مکمل چوڑائی) ہے اور این جمع شدہ فوٹونوں کی تعداد ہے۔ یہ فٹنگ کا عمل صرف الگ تھلگ اخراج کنندگان کے لیے قابل اعتماد طریقے سے انجام دیا جا سکتا ہے (دیکھیں ڈیکونولوشن)، اور دلچسپ حیاتیاتی نمونوں کو اخراج کنندگان کے ساتھ اتنا گھنے طور پر لیبل کیا جاتا ہے کہ جب تمام اخراج کنندگان ایک ہی وقت میں فعال ہوں تو فٹنگ ناممکن ہے۔ ایس ایم ایل ایم تکنیک ایک ہی وقت میں اخراج کاروں کے صرف ایک چھوٹے سے ذیلی سیٹ کو چالو کرکے، ان چند اخراج کاروں کو بہت درست طریقے سے مقامی بنا کر، انہیں غیر فعال کر کے اور دوسرے ذیلی سیٹ کو فعال کر کے اس مخمصے کو حل کرتی ہے۔ پس منظر اور کیمرہ پکسلشن پر غور کرتے ہوئے، اور ایک عام خوردبین کے پوائنٹ اسپریڈ فنکشن (ایئر ڈسک) کے لیے گوسیائی تخمینہ کا استعمال کرتے ہوئے، نظریاتی ریزولوشن تھامسن اور دیگر نے تجویز کیا ہے۔ اور مورٹنسن اور دیگر کے ذریعہ عمدہ ٹیون کیا گیا۔ : جہاں * σ ایک ہی مالیکیول کے مرکز کے مقامات کا گوسیائی معیاری انحراف ہے اگر متعدد بار ماپا جائے (مثال کے طور پر۔ ویڈیو کے فریم)۔ (اکائی m) * σPSF پوائنٹ اسپریڈ فنکشن کا گوسیائی معیاری انحراف ہے، جس کا FWHM ارنسٹ ابی مساوات d = λ/(2 N. A.) کی پیروی کرتا ہے۔ (اکائی m) * a ہر تصویر پکسل کا سائز ہے۔ (اکائی m) * Nsig دلچسپی کے تمام پکسلز پر کل پی ایس ایف کی فوٹون گنتی ہے۔ (یونٹ لیس) * این بی جی اوسط پس منظر کے فوٹون کی گنتی فی پکسل (سیاہ گنتی پہلے ہی ہٹا دی گئی ہے)، جو کہ وقت کے ساتھ ہر پکسل کے پوسن تقسیم کے پس منظر کے شور کے گوسیائی معیاری انحراف کا مربع یا صرف پس منظر کے شور کے ساتھ تمام پکسلز کے معیاری انحراف کا تخمینہ ہے، σbg2۔ جتنا بڑا σbg2، اتنا ہی بہتر تخمینہ (مثال کے طور پر۔ σbg2> 10 کے لیے اچھا، σbg2> 1000 کے لیے بہترین)۔ (یونٹ لیس) * ریزولوشن ایف ڈبلیو ایچ ایم ~ 2.355 گنا گوسیائی معیاری انحراف ہے۔ عام طور پر، لوکلائزیشن مائکروسکوپی فلوروفورز کے ساتھ کی جاتی ہے۔ مناسب فلوروفورس (مثال کے طور پر۔ اسٹورم کے لیے) زیادہ تر وقت غیر فلوروسینٹ تاریک حالت میں رہتا ہے اور عام طور پر کم شدت کے ایکسائٹیشن لیزر کے ساتھ اسٹاکسٹک طور پر چالو ہوتا ہے۔ ایک ریڈ آؤٹ لیزر فلوروسینس کو متحرک کرتا ہے اور بلیچ یا فوٹوسوچ فلورفورز کو واپس تاریک حالت میں لے جاتا ہے، عام طور پر 10-100 ایم ایس کے اندر۔ نینو اسکیل ٹوپوگرافی (پی اے آئی این ٹی) میں امیجنگ کے لیے پوائنٹس کے جمع ہونے میں، فلوروفورز بائنڈنگ سے پہلے غیر فلوروسینٹ اور بعد میں فلوروسینٹ ہوتے ہیں۔ فلوروسینٹ مرحلے کے دوران خارج ہونے والے فوٹون ایک کیمرے کے ساتھ جمع کیے جاتے ہیں اور فلوروفور کی نتیجے میں بننے والی تصویر (جسے پی ایس ایف کے ذریعے مسخ کیا جاتا ہے) کو بہت زیادہ درستگی کے ساتھ نصب کیا جا سکتا ہے، یہاں تک کہ چند اینگسٹروم کی ترتیب پر بھی۔ اس عمل کو کئی ہزار بار دہرانے سے یہ یقینی بنتا ہے کہ تمام فلوروفورز روشن حالت سے گزر سکتے ہیں اور ریکارڈ کیے جاتے ہیں۔ اس کے بعد ایک کمپیوٹر ایک انتہائی حل شدہ تصویر کو دوبارہ تشکیل دیتا ہے۔ ریزولوشن کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے ان طریقوں کے لیے استعمال ہونے والے فلوروفورز کی مطلوبہ خصوصیات یہ ہیں کہ وہ روشن ہونے چاہئیں۔ یعنی ان میں معدومیت کا زیادہ گتانک اور زیادہ مقدار میں پیداوار ہونی چاہیے۔ ان کا موازنہ بھی زیادہ ہونا چاہیے (روشنی کی حالت میں خارج ہونے والے فوٹونوں کی تعداد اور تاریک حالت میں خارج ہونے والے فوٹونوں کی تعداد کے درمیان تناسب)۔ نیز، نائکوسٹ معیار کے مطابق، ایک گھنے لیبل والا نمونہ مطلوب ہے۔ لوکلائزیشن مائکروسکوپی کے طریقوں کی کثرت زیادہ تر استعمال شدہ فلوروفورز کی قسم میں مختلف ہوتی ہے۔ سپیکٹرم صحت سے متعلق فاصلہ خوردبین (ایس پی ڈی ایم) روشنی کا ایک واحد، چھوٹا ذریعہ خوردبین کے ریزولوشن سے بہت بہتر پایا جا سکتا ہے جو عام طور پر اس کی اجازت دیتا ہے: اگرچہ روشنی ایک دھندلا دھندلا مقام پیدا کرے گی، کمپیوٹر الگورتھم کا استعمال دھندلا دھندلا مقام کے مرکز کا درست حساب لگانے کے لیے کیا جا سکتا ہے، جس میں خوردبین کے پوائنٹ اسپریڈ فنکشن، ڈٹیکٹر کی شور کی خصوصیات وغیرہ کو مدنظر رکھا جاتا ہے۔ تاہم، یہ نقطہ نظر اس وقت کام نہیں کرتا جب ایک دوسرے کے قریب بہت زیادہ ذرائع ہوں: ذرائع پھر سب ایک ساتھ دھندلا پڑ جاتے ہیں۔ سپیکٹرم پریسیشن ڈسٹنس مائکروسکوپی (ایس پی ڈی ایم) فلوروسینس مائکروسکوپی میں لوکلائزنگ تکنیک کا ایک خاندان ہے جو ایک وقت میں صرف چند ذرائع کی پیمائش کرکے بہت سے ذرائع ہونے کے مسئلے کو حل کرتا ہے، تاکہ ہر ماخذ دوسروں سے "آپٹیکل طور پر الگ تھلگ" ہو (یعنی خوردبین کے ریزولوشن سے زیادہ سے الگ، عام طور پر ~ 200-250 nm)، اگر زیر جانچ ذرات میں مختلف سپیکٹرم کے اشارے ہوں، تاکہ مناسب روشنی کے ذرائع اور فلٹرز کا استعمال کرکے ایک وقت میں صرف چند مالیکیولز سے روشنی کو دیکھنا ممکن ہو۔ یہ روایتی نظری ریزولوشن سے کئی گنا بہتر ایک موثر نظری ریزولوشن حاصل کرتا ہے جس کی نمائندگی موثر پوائنٹ امیج فنکشن کے مرکزی زیادہ سے زیادہ نصف چوڑائی سے ہوتی ہے۔ ایس پی ڈی ایم کا استعمال کرتے ہوئے حاصل ہونے والی ساختی ریزولوشن کا اظہار مختلف سپیکٹرم خصوصیات ("ٹوپولوجیکل ریزولوشن") کے دو پنکٹیفارم ذرات کے درمیان سب سے چھوٹے قابل پیمائش فاصلے کے لحاظ سے کیا جا سکتا ہے۔ ماڈلنگ سے پتہ چلتا ہے کہ لوکلائزیشن، ذرہ کثافت وغیرہ کی درستگی کے حوالے سے مناسب حالات میں، "ٹپوولوجیکل ریزولوشن" ایک "اسپیس فریکوئنسی" سے مطابقت رکھتا ہے، جو کلاسیکی تعریف کے لحاظ سے، بہت بہتر آپٹیکل ریزولوشن کے برابر ہے۔ سالمات کو فلوروسینٹ لائف ٹائم اور دیگر تکنیکوں کی بنیاد پر اور بھی زیادہ لطیف طریقوں سے ممتاز کیا جا سکتا ہے۔ ایک اہم اطلاق جینوم ریسرچ (جینوم کی فعال تنظیم کا مطالعہ) میں ہے۔ استعمال کا ایک اور اہم شعبہ جھلیوں کی ساخت پر تحقیق ہے۔ بہت سے معیاری فلوروسینٹ رنگوں جیسے جی ایف پی، الیکسا رنگ، اور فلوروسین مالیکیولز کے لیے ایس پی ڈی ایم فائیموڈ لوکلائزیشن مائکروسکوپی ممکن ہے اگر کچھ فوٹو فزیکل حالات موجود ہوں۔ اس نام نہاد جسمانی طور پر قابل ترمیم فلوروفورز (ایس پی ڈی ایم فائیموڈ) ٹیکنالوجی کے ساتھ، مناسب شدت کا ایک واحد لیزر طول موج نینو امیجنگ کے لیے کافی ہے اس کے برعکس دیگر لوکلائزیشن مائکروسکوپی ٹیکنالوجیز کو دو لیزر طول موج کی ضرورت ہوتی ہے جب خصوصی فوٹو سوئچ ایبل/فوٹو ایکٹیویٹ ایبل فلوروسینس مالیکیول استعمال کیے جاتے ہیں۔ ایس پی ڈی ایم فائیموڈ کے استعمال کی ایک اور مثال تمباکو موزیک وائرس (ٹی ایم وی) کے ذرات کا تجزیہ یا وائرس سیل کے تعامل کا مطالعہ ہے۔ سنگل-ٹرپلٹ حالت کی منتقلی کی بنیاد پر ایس پی ڈی ایم فائیموڈ کے لیے یہ بہت ضروری ہے کہ یہ عمل جاری رہے اور اس اثر کی طرف لے جائے کہ ایک واحد مالیکیول پہلے ایک بہت طویل عرصے تک رہنے والی بدلنے والی تاریک حالت (کئی سیکنڈ تک کی نصف زندگی کے ساتھ) میں آتا ہے جس سے یہ ایک فلوروسینٹ حالت میں واپس آتا ہے جو کئی ملی سیکنڈ تک بہت سے فوٹونوں کا اخراج کرتا ہے اس سے پہلے کہ وہ بہت طویل عرصے تک رہنے والی، نام نہاد ناقابل واپسی تاریک حالت میں واپس آئے۔ ایس پی ڈی ایم فائیموڈ مائکروسکوپی فلوروسینٹ مالیکیولز کا استعمال کرتی ہے جو ایک ہی سپیکٹرم لائٹ فریکوئنسی کا اخراج کرتے ہیں لیکن چمکتی ہوئی خصوصیات کی بنیاد پر مختلف سپیکٹرم سگنیچرز کے ساتھ۔ ایک ہی خلیے کی دو ہزار تصاویر کو یکجا کرکے، لیزر آپٹیکل صحت سے متعلق پیمائش کا استعمال کرتے ہوئے، نمایاں طور پر بہتر آپٹیکل ریزولوشن کے ساتھ لوکلائزیشن امیجز کو ریکارڈ کرنا ممکن ہے۔ ایس پی ڈی ایم فائیموڈ ٹیکنالوجی کے ساتھ پہلے سے ہی کامیابی سے استعمال ہونے والے معیاری فلوروسینٹ رنگوں میں جی ایف پی، آر ایف پی، وائی ایف پی، الیکسا 488، الیکسا 568، الیکسا 647، سائ 2، سائ 3، ایٹو 488 اور فلوروسین شامل ہیں۔ 3 ڈی (کولڈ) میں کریوجینک آپٹیکل لوکلائزیشن 3 ڈی (کولڈ) میں کریوجینک آپٹیکل لوکلائزیشن ایک ایسا طریقہ ہے جو انگسٹروم پیمانے کے ریزولوشن کے ساتھ ایک چھوٹے سے درمیانے درجے کے حیاتیاتی سالمے کے اندر متعدد فلوروسینٹ سائٹس کو مقامی بنانے کی اجازت دیتا ہے۔ اس نقطہ نظر میں لوکلائزیشن کی درستگی میں اضافہ ہوتا ہے کیونکہ کم درجہ حرارت پر سست فوٹو کیمسٹری فوٹونوں کی زیادہ تعداد کا باعث بنتی ہے جو فوٹو بلیچنگ سے پہلے ہر فلوروفور سے خارج ہو سکتے ہیں۔ نتیجے کے طور پر، کریوجینک اسٹوچسٹک لوکلائزیشن مائکروسکوپی ایک چھوٹے سے پروٹین سے منسلک کئی فلوروفورز کی 3D پوزیشنوں کو حل کرنے کے لیے درکار ذیلی سالماتی ریزولوشن کو حاصل کرتی ہے۔ الیکٹران مائکروسکوپی سے معلوم الگورتھم کو استعمال کرتے ہوئے، فلوروفورز کے 2D پروجیکشنز کو 3D ترتیب میں دوبارہ تعمیر کیا جاتا ہے۔ کولڈ لیبل کے سائز کے لحاظ سے فلوروسینس مائکروسکوپی کو اپنی بنیادی حد تک لاتا ہے۔ قیمتی تکمیلی معلومات اور خاصیت فراہم کرنے کے لیے اس طریقہ کو دیگر ساختی حیاتیات کی تکنیکوں جیسے ایکس رے کرسٹلگرافی، مقناطیسی گونج سپیکٹروسکوپی، اور الیکٹران مائکروسکوپی کے ساتھ بھی جوڑا جا سکتا ہے۔ بائنڈنگ ایکٹیویٹڈ لوکلائزیشن مائکروسکوپی (بی اے ایل ایم) بائنڈنگ ایکٹیویٹڈ لوکلائزیشن مائکروسکوپی (بی اے ایل ایم) سنگل مالیکیول لوکلائزیشن مائکروسکوپی (ایس ایم ایل ایم) کے لیے ایک عام تصور ہے: ڈی این اے اور ڈائی کی خصوصیات میں ترمیم کی بنیاد پر ڈی این اے بائنڈنگ رنگوں کی انتہائی حل شدہ امیجنگ۔ کیمیائی ماحول کی محتاط ایڈجسٹمنٹ سے-جس سے مقامی، ریورسیبل ڈی این اے پگھلتا ہے اور فلوروسینس سگنل پر ہائبرڈائزیشن کنٹرول ہوتا ہے-ڈی این اے بائنڈنگ ڈائی مالیکیول متعارف کرائے جا سکتے ہیں۔ ایک وقت میں صرف چند ڈی این اے بائنڈنگ ڈائی سگنلز کو رجسٹر کرنے اور آپٹیکل طور پر الگ کرنے کے لیے انٹرکالیٹنگ اور معمولی نالی والے بائنڈنگ ڈی این اے رنگوں کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ڈی این اے ڈھانچے کے اتار چڑھاؤ کی مدد سے بی اے ایل ایم (ایف بی اے ایل ایم) کو جوہری فن تعمیر میں نینو اسکیل کے فرق کے لیے استعمال کیا گیا ہے، جس کی متوقع ساختی ریزولوشن تقریبا 50 این ایم ہے۔ ڈی این اے ڈھانچے کے اتار چڑھاؤ کی بنیاد پر بائنڈنگ ایکٹیویٹڈ لوکلائزیشن مائکروسکوپی کے ساتھ کرومیٹن نینو اسٹرکچر کی امیجنگ۔ حال ہی میں، این آئی اے ڈی-4 کی فلوروسینس کوانٹم پیداوار میں امائلوئڈ سے جڑنے پر نمایاں اضافہ امائلوئڈ فائبرلز اور اولیگومرز کی بی اے ایل ایم امیجنگ کے لیے استعمال کیا گیا۔ اسٹورم، پی اے ایل ایم، اور ایف پی اے ایل ایم اسٹوچسٹک آپٹیکل ری کنسٹرکشن مائکروسکوپی (ایس ٹی او آر ایم)، فوٹو ایکٹیویٹڈ لوکلائزیشن مائکروسکوپی (پی اے ایل ایم)، اور فلوروسینس فوٹو ایکٹیویشن لوکلائزیشن مائکروسکوپی (ایف پی اے ایل ایم) سپر ریزولوشن امیجنگ تکنیک ہیں جو ہائی ریزولوشن امیجز بنانے کے لیے فوٹو وچ ایبل فلوروفورز کی ترتیب وار ایکٹیویشن اور وقت سے حل شدہ لوکلائزیشن کا استعمال کرتی ہیں۔ امیجنگ کے دوران، کسی بھی لمحے فلوروسینٹ حالت میں صرف فلوروفورز کا آپٹک طور پر حل کرنے والا ذیلی سیٹ چالو کیا جاتا ہے، اس طرح کہ ہر فلوروفور کی پوزیشن کا تعین کسی خاص فلوروفور کی واحد سالماتی تصاویر کی سینٹرایڈ پوزیشنوں کو تلاش کرکے اعلی درستگی کے ساتھ کیا جا سکتا ہے۔ فلوروفورز کا ایک ذیلی سیٹ بعد میں غیر فعال ہو جاتا ہے، اور دوسرا ذیلی سیٹ فعال اور امیج کیا جاتا ہے۔ اس عمل کی تکرار متعدد فلوروفورز کو مقامی بنانے اور تصویری ڈیٹا سے ایک سپر ریزولوشن امیج بنانے کی اجازت دیتی ہے۔ یہ تینوں طریقے مختصر عرصے میں آزادانہ طور پر شائع کیے گئے تھے، اور ان کے اصول ایک جیسے ہیں۔ اسٹورم کو اصل میں نیوکلک ایسڈ یا پروٹین سے منسلک Cy5 اور Cy3 رنگوں کا استعمال کرتے ہوئے بیان کیا گیا تھا، جبکہ PALM اور FPALM کو فوٹو وچ ایبل فلوروسینٹ پروٹین کا استعمال کرتے ہوئے بیان کیا گیا تھا۔ اصولی طور پر کوئی بھی فوٹو وچ ایبل فلوروفور استعمال کیا جا سکتا ہے، اور اسٹورم کا مظاہرہ مختلف تحقیقات اور لیبلنگ کی حکمت عملیوں کے ساتھ کیا گیا ہے۔ واحد فلوروفورز، جیسے Cy5 کی سٹوچسٹک فوٹوسوچنگ کا استعمال کرتے ہوئے، STORM کو ایک ہی سرخ لیزر ایکسائٹیشن سورس کے ساتھ انجام دیا جا سکتا ہے۔ سرخ لیزر دونوں ایک ایڈکٹ کی تشکیل کے ذریعے Cy5 فلوروفور کو تاریک حالت میں بدل دیتا ہے اور اس کے بعد مالیکیول کو فلوروسینٹ حالت میں واپس کر دیتا ہے۔ بہت سے دوسرے رنگ بھی اسٹورم کے ساتھ استعمال کیے گئے ہیں۔ سنگل فلوروفورز کے علاوہ، ایک ایکٹیویٹر فلوروفور (جیسے الیکسا 405، Cy2، یا Cy3) پر مشتمل ڈائی جوڑی اور فوٹو وچ ایبل رپورٹر ڈائی (جیسے Cy5، الیکسا 647، Cy5.5، یا Cy7) کو STORM کے ساتھ استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس اسکیم میں، ایکٹیویٹر فلوروفور، جب اس کے جذب کی زیادہ سے زیادہ حد کے قریب پرجوش ہوتا ہے، تو فوٹو وچ ایبل ڈائی کو فلوروسینٹ حالت میں دوبارہ فعال کرنے کا کام کرتا ہے۔ ملٹی کلر امیجنگ کو ڈائی جوڑوں میں فرق کرنے کے لیے مختلف ایکٹیویشن طول موج کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا ہے، استعمال شدہ ایکٹیویٹر فلوروفور پر منحصر ہے، یا ایکٹیویٹر فلوروفورز کے ساتھ یا اس کے بغیر سپیکٹرم سے الگ فوٹو وچ ایبل فلوروفورز کا استعمال کرتے ہوئے۔ فوٹوسوچ ایبل فلوروسینٹ پروٹین بھی استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ اینٹی باڈی سٹیننگ، پروٹین کی براہ راست کنجگیشن، اور جینیاتی انکوڈنگ کے ساتھ فوٹو وچ ایبل تحقیقات کے ساتھ حیاتیاتی ڈھانچوں کی انتہائی مخصوص لیبلنگ حاصل کی گئی ہے۔ ایس ٹی او آر ایم کو آپٹیکل ایسٹیگمیٹزم کا استعمال کرتے ہوئے تین جہتی امیجنگ تک بڑھایا گیا ہے، جس میں پوائنٹ اسپریڈ فنکشن کی الپٹیکل شکل کئی مائکرو میٹر موٹے نمونوں کے لیے ایکس، وائی، اور زیڈ پوزیشنوں کو انکوڈ کرتی ہے، اور زندہ خلیوں میں اس کا مظاہرہ کیا گیا ہے۔ آج تک، اس تکنیک کے ذریعے حاصل کردہ مقامی ریزولوشن لیٹرل طول و عرض میں ~ 20 این ایم اور محوری طول و عرض میں ~ 50 این ایم ہے ؛ اور عارضی ریزولوشن 0.1-0.33s جتنی تیز ہے۔ نینو اسکیل ٹوپوگرافی (پی اے آئی این ٹی) میں امیجنگ کے لیے پوائنٹس جمع کرنا نینو اسکیل ٹوپوگرافی (پی اے آئی این ٹی) میں امیجنگ کے لیے پوائنٹس جمع کرنا ایک واحد مالیکیول لوکلائزیشن طریقہ ہے جو مالیکیولر ایڈسورپشن/جذب اور فوٹو بلیچنگ/ڈسورپشن کے ذریعے اسٹاکسٹک سنگل مالیکیول فلوروسینس حاصل کرتا ہے۔ استعمال ہونے والا پہلا رنگ نیل ریڈ تھا جو آبی محلول میں غیر فلوروسینٹ ہوتا ہے لیکن جب ہائیڈروفوبک ماحول، جیسے مائیکلز یا زندہ خلیے کی دیواروں میں ڈالا جاتا ہے تو فلوروسینٹ ہوتا ہے۔ اس طرح، ڈائی کا ارتکاز نینوملر سطح پر چھوٹا رکھا جاتا ہے، تاکہ ڈیفریکشن محدود علاقے میں مالیکیول کی جذب کی شرح ملی سیکنڈ کے علاقے میں ہو۔ ایک متحرک ہدف کے ساتھ سنگل ڈائی مالیکیولز (تحقیقات) کے اسٹاکسٹک بائنڈنگ کو ایک عام وائڈ فیلڈ فلوروسینس خوردبین کے تحت مقامی اور عارضی طور پر حل کیا جا سکتا ہے۔ فیلڈ کو تاریک حالت میں واپس لانے کے لیے ہر ڈائی کو فوٹو بلیچ کیا جاتا ہے، تاکہ اگلا ڈائی باندھ سکے اور مشاہدہ کیا جا سکے۔ اس طریقہ کار کا فائدہ، دوسرے سٹوچسٹک طریقوں کے مقابلے میں، یہ ہے کہ مقررہ ہدف کی انتہائی حل شدہ تصویر حاصل کرنے کے علاوہ، یہ حل میں، ہدف تک پھیلے ہوئے پروب مالیکیولز کی متحرک بائنڈنگ حرکیات کی پیمائش کر سکتا ہے۔ 3 ڈی سپر ریزولوشن تکنیک کو یکجا کرنا (مثال کے طور پر۔ ڈبل ہیلکس پوائنٹ اسپریڈ فنکشن مورر کے گروپ میں تیار ہوتا ہے)، فوٹو ایکٹیویٹڈ ڈائز، پاور پر منحصر فعال انٹرمیٹنسی، اور نینو اسکیل ٹپوگرافی میں امیجنگ کے لیے پوائنٹس کا جمع ہونا، ایس پی آر اے آئی پی اے آئی این ٹی (ایس پی آر اے آئی = سپر ریزولوشن بذریعہ پوور پر منحصر فعال انٹرمیٹنسی) لائیو سیل والز کو سپر حل کر سکتا ہے۔ پینٹ ڈائی ایڈسورپشن/جذب اور فوٹو بلیچنگ/ڈیسرپشن کی شرحوں کے درمیان توازن برقرار رکھتے ہوئے کام کرتا ہے۔ اس توازن کا تخمینہ شماریاتی اصولوں سے لگایا جا سکتا ہے۔ گیس یا مائع محلول میں کسی سطح یا انٹرفیس پر پتلے محلول کے جذب یا جذب کی شرح کا حساب فک کے پھیلاؤ کے قوانین کا استعمال کرتے ہوئے کیا جا سکتا ہے۔ فوٹو بلیچنگ/ڈسورپشن کی شرح کو حل کی دی گئی حالت اور روشنی کی طاقت کی کثافت کے لیے ماپا جا سکتا ہے۔ ڈی این اے-پی اے آئی این ٹی کو باقاعدہ رنگوں کے استعمال کے لیے مزید بڑھایا گیا ہے، جہاں ڈائی لیبلڈ ڈی این اے تحقیقات کو ایک مقررہ ڈی این اے اوریگامی کے ساتھ متحرک بائنڈنگ اور ان بائنڈنگ کا استعمال اسٹاکسٹک سنگل مالیکیول امیجنگ حاصل کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ ڈی این اے-پینٹ اب ماحول کے حساس رنگوں تک محدود نہیں ہے اور ہدف تک تحقیقات کے جذب اور خارج ہونے والے حرکیات دونوں کی پیمائش کر سکتا ہے۔ یہ طریقہ حرکت پذیر رنگوں کے کیمرہ دھندلاؤ اثر کا استعمال کرتا ہے۔ جب کوئی باقاعدہ رنگ محلول میں پھیل رہا ہوتا ہے، تو ایک عام سی سی ڈی کیمرے پر اس کی تصویر اس کی نسبتا تیز رفتار اور نسبتا طویل کیمرے کی نمائش کے وقت کی وجہ سے دھندلی ہو جاتی ہے، جو فلوروسینس کے پس منظر میں معاون ہوتی ہے۔ تاہم، جب یہ کسی مقررہ ہدف سے جڑا ہوتا ہے، تو رنگ حرکت کرنا بند کر دیتا ہے ؛ اور پوائنٹ اسپریڈ فنکشن میں واضح ان پٹ حاصل کیا جا سکتا ہے۔ اس طریقہ کار کی اصطلاح ایم بی پی اے آئی این ٹی ("ایم بی" کا مطلب موشن بلر ہے) ہے۔ جب امیجنگ کے لیے کل اندرونی عکاسی فلوروسینس خوردبین (ٹی آئی آر ایف) کا استعمال کیا جاتا ہے، تو محرک کی گہرائی سبسٹریٹ سے ~ 100 این ایم تک محدود ہوتی ہے، جو سبسٹریٹ کے قریب دھندلے رنگوں اور بلک حل میں پس منظر سے فلوروسینس کے پس منظر کو مزید کم کر دیتی ہے۔ بہت روشن رنگوں کو ایم بی پی اے آئی این ٹی کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جو نسبتا ہلکی فوٹو ایکسائٹیشن شدت کے تحت 20 این ایم کی عام سنگل فریم مقامی ریزولوشن اور 20 ایم ایس کی سنگل مالیکیول کینیٹک عارضی ریزولوشن دیتا ہے، جو واحد پروٹین کی سالماتی علیحدگی کا مطالعہ کرنے میں مفید ہے۔ ڈیٹا کے حصول اور مسخ شدہ پوائنٹ اسپریڈ فنکشن کو حل کرنے کے دوران فورئیر طیارہ میں رکھے گئے گردشی مرحلے کے ماسک کا استعمال کرتے ہوئے عارضی ریزولوشن کو مزید بہتر (20 گنا) کیا گیا ہے جس میں عارضی معلومات شامل ہیں۔ اس طریقہ کار کو سپر ٹیمپورل ریزولیوڈ مائکروسکوپی (ایس ٹی آر ای ایم) کا نام دیا گیا۔ لیبل فری لوکلائزیشن مائکروسکوپی تقریبا 50 این ایم کی حد میں سیلولر ڈھانچوں کا آپٹیکل ریزولوشن حاصل کیا جا سکتا ہے، یہاں تک کہ لیبل فری خلیوں میں بھی، لوکلائزیشن مائکروسکوپی ایس پی ڈی ایم کا استعمال کرتے ہوئے۔ دو مختلف لیزر طول موج کا استعمال کرتے ہوئے، ایس پی ڈی ایم سیلولر اشیاء کو ظاہر کرتا ہے جو روایتی فلوروسینس وائڈ فیلڈ امیجنگ حالات کے تحت قابل شناخت نہیں ہیں، اس کے علاوہ آٹو فلوروسینٹ ڈھانچوں کے ریزولوشن میں خاطر خواہ بہتری لاتے ہیں۔ کنٹرول کے طور پر، لوکلائزیشن امیج میں دریافت شدہ اشیاء کی پوزیشنیں برائٹ فیلڈ امیج سے ملتی جلتی ہیں۔ لیبل فری سپر ریزولوشن مائکروسکوپی کا مظاہرہ بھی انتہائی یکساں پلازمونک میٹا سرفیس پر سطح سے بہتر رمن بکھرنے والے سگنل کے اتار چڑھاؤ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا ہے۔ ڈائریکٹ اسٹوکسٹیل آپٹیکل ری کنسٹرکشن مائکروسکوپی (ڈی ایس ٹی او آر ایم) ڈی ایس ٹی او آر ایم ایک واحد فلوروفور کی فوٹوسوچنگ کا استعمال کرتا ہے۔ ڈی ایس ٹی او آر ایم میں، فلوروفورز کو کم کرنے والے اور آکسیڈائزنگ بفرنگ سسٹم (آر او ایکس ایس) میں سرایت کیا جاتا ہے اور فلوروسینس پرجوش ہوتا ہے۔ بعض اوقات، اسٹاکسٹک طور پر، فلوروفور ٹرپلٹ یا کسی دوسری تاریک حالت میں داخل ہو جائے گا جو بفر کی آکسیکرن حالت کے لیے حساس ہے، جہاں سے انہیں فلوروس بنایا جا سکتا ہے، تاکہ واحد مالیکیول کی پوزیشن ریکارڈ کی جا سکے۔ ڈی ایس ٹی او آر ایم طریقہ کار کی ترقی تقریبا ایک ہی وقت میں 3 آزاد لیبارٹریوں میں ہوئی اور اسے "ریورسیبل فوٹو بلیچنگ مائکروسکوپی" (آر پی ایم)، "گراؤنڈ اسٹیٹ ڈیپلیشن مائکروسکوپی کے بعد انفرادی مالیکیول ریٹرن" (جی ایس ڈی آئی ایم) کے ساتھ ساتھ اب عام طور پر قبول شدہ مانیکر ڈی ایس ٹی او آر ایم بھی کہا جاتا تھا۔ لوکلائزیشن مائکروسکوپی لوکلائزیشن مائکروسکوپی کے لیے سافٹ ویئر کا بہت زیادہ انحصار ایسے سافٹ ویئر پر ہوتا ہے جو چند منٹوں میں فعال فلوروفورز کی لاکھوں تصاویر میں پوائنٹ اسپریڈ فنکشن (پی ایس ایف) کو درست طریقے سے فٹ کر سکتا ہے۔ چونکہ قدرتی علوم میں استعمال ہونے والے کلاسیکی تجزیہ کے طریقے اور سافٹ ویئر سوئٹ ان مسائل کو کمپیوٹیشنل طور پر حل کرنے میں بہت سست ہیں، اس لیے اکثر منٹوں میں ماپا جانے والے ڈیٹا کی پروسیسنگ کے لیے گنتی کے گھنٹوں لگتے ہیں، اس لیے خصوصی سافٹ ویئر پروگرام تیار کیے گئے ہیں۔ ان میں سے بہت سے لوکلائزیشن سافٹ ویئر پیکجز اوپن سورس ہیں۔ وہ ایس ایم ایل ایم سافٹ ویئر بینچ مارک پر درج ہیں۔ ایک بار سالمے کی پوزیشنوں کا تعین ہو جانے کے بعد، مقامات کو ظاہر کرنے کی ضرورت ہے اور ڈسپلے کے لیے کئی الگورتھم تیار کیے گئے ہیں۔ سپر ریزولوشن آپٹیکل فلوکچوایشن امیجنگ (ایس او ایف آئی) پکسلز کے عارضی آٹوکوریلیشن کو براہ راست کمپیوٹ کرکے سنگل مالیکیول لوکلائزیشن مائکروسکوپی (ایس ایم ایل ایم) میں موروثی پی ایس ایف فٹنگ کی ضرورت کو روکنا ممکن ہے۔ اس تکنیک کو سپر ریزولوشن آپٹیکل فلوکچوایشن امیجنگ (ایس او ایف آئی) کہا جاتا ہے اور جب بیک وقت فعال فلوروفورز کی کثافت بہت زیادہ ہوتی ہے تو اسے ایس ایم ایل ایم سے زیادہ درست دکھایا گیا ہے۔ ہمہ گیر لوکلائزیشن مائکروسکوپی (او ایل ایم) ہمہ گیر لوکلائزیشن مائکروسکوپی (او ایل ایم) سنگل مالیکیول مائکروسکوپی (ایس ایم ایل ایم) تکنیکوں کی ایک توسیع ہے جو غیر متزلزل روشنی کے ذریعہ (جیسے مرکری آرک لیمپ) اور روایتی ایپی فلوریسنس مائکروسکوپ سیٹ اپ کے ساتھ ہائی ڈینسٹی سنگل مالیکیول امیجنگ کی اجازت دیتی ہے۔ گہرے نیلے رنگ کے جوش و خروش کا ایک مختصر پھٹ (405 این ایم لیزر کے بجائے 350-380 این ایم کے ساتھ) ٹیسٹ کے نمونوں پر 90 این ایم کے ریزولوشن کے لیے مالیکیولز کو طویل عرصے تک دوبارہ فعال کرنے کے قابل بناتا ہے۔ آخر میں، مربوط ایس ٹی ای ڈی اور ایس ایم ایل ایم امیجنگ کو ایک سادہ امیجنگ میڈیم کا استعمال کرتے ہوئے ایک ہی حیاتیاتی نمونے پر انجام دیا جا سکتا ہے، جو مزید بہتر ریزولوشن کی بنیاد فراہم کر سکتا ہے۔ یہ نتائج سپر ریزولوشن امیجنگ کو جمہوری بنا سکتے ہیں اور کسی بھی سائنسدان کو محدود بجٹ کے ساتھ بھی ہائی ڈینسٹی سنگل مالیکیول امیجز بنانے میں مدد کر سکتے ہیں۔ سیکوینشیل امیجنگ (آر ای ایس آئی) کے ذریعے ریزولوشن میں اضافہ سیکوینشیل امیجنگ (آر ای ایس آئی) کے ذریعے ریزولوشن میں اضافہ ڈی این اے-پینٹ کی توسیع ہے جو نظریاتی طور پر لامحدود ریزولوشن حاصل کر سکتی ہے۔ کسی دی گئی ہدف پرجاتیوں کی شناخت کے لیے ایک لیبل کی قسم کا استعمال کرنے کے بجائے، ایک ہی ہدف کی نقول کو آرتھوگنل ڈی این اے ترتیب کے ساتھ لیبل کیا جاتا ہے۔ ترتیب پر (یعنی۔ علیحدہ) امیجنگ، لوکلائزیشن کلاؤڈز جو روایتی ایس ایم ایل ایم میں اوورلیپ ہوتے ہیں (1) حل کیے جا سکتے ہیں اور (2) ایک واحد "سپر" لوکلائزیشن میں جوڑے جا سکتے ہیں، جس کی درستگی لوکلائزیشن کی بنیادی تعداد کے ساتھ پیمانے پر ہوتی ہے۔ جیسا کہ ڈی این اے-پی اے آئی این ٹی میں قابل حصول لوکلائزیشن کی تعداد لامحدود ہے، اسی طرح آر ای ایس آئی کا نظریاتی حل بھی ہے۔ بنیادی امیجنگ راؤنڈز سے آر ای ایس آئی لوکلائزیشنز کو اوورلے کرنے سے ایک جامع، انتہائی حل شدہ تصویر بنتی ہے۔ 3 ڈی لائٹ مائکروسکوپیکل نانوسائزنگ (لیمون) مائکروسکوپی لائٹ مائکروسکوپیکل نانوسائزنگ مائکروسکوپی (3 ڈی لیمون) امیجز کا امتزاج، ورٹیکو ایس ایم آئی مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے، ایس ایم آئی اور ایس پی ڈی ایم کے امتزاج سے ممکن ہوتا ہے، جس کے ذریعے پہلے ایس ایم آئی، اور پھر ایس پی ڈی ایم، عمل لاگو ہوتا ہے۔ ایس ایم آئی عمل ذرات کے مرکز اور خوردبین محور کی سمت میں ان کے پھیلاؤ کا تعین کرتا ہے۔ اگرچہ ذرات/مالیکیولز کے مرکز کا تعین 1 سے 2 این ایم کی درستگی کے ساتھ کیا جا سکتا ہے، اس نقطہ کے ارد گرد پھیلاؤ کا تعین تقریبا 30-40 این ایم کے محوری قطر تک کیا جا سکتا ہے۔ اس کے بعد، انفرادی ذرہ/مالیکیول کی پس منظر کی پوزیشن کا تعین ایس پی ڈی ایم کا استعمال کرتے ہوئے کیا جاتا ہے، جس سے چند نینو میٹر کی درستگی حاصل ہوتی ہے۔ تھری ڈی ڈوئل کلر موڈ میں حیاتیاتی استعمال کے طور پر، ہر 2/نیو اور ہر 3 کلسٹرز کے مقامی انتظامات حاصل کیے گئے۔ پروٹین کلسٹرز کی تینوں سمتوں میں پوزیشنوں کا تعین تقریبا 25 این ایم کی درستگی کے ساتھ کیا جا سکتا ہے۔ مربوط ارتباط روشنی اور الیکٹران خوردبین الیکٹران خوردبین کے ساتھ ایک سپر ریزولوشن خوردبین کا امتزاج، فلوروسینس مارکر کے ذریعہ فراہم کردہ لیبلنگ کے ساتھ، سیاق و سباق کی معلومات کو بصری بنانے کے قابل بناتا ہے۔ اس سے سیاہ پس منظر کے مسئلے پر قابو پایا جاتا ہے جو محقق کے پاس صرف ہلکے خوردبین کا استعمال کرتے وقت رہ جاتا ہے۔ ایک مربوط نظام میں، نمونے کو بیک وقت دونوں خوردبین کے ذریعے ماپا جاتا ہے۔ عصبی نیٹ ورک کا استعمال کرتے ہوئے تکنیکوں میں اضافہ حال ہی میں، مصنوعی ذہانت کمپیوٹنگ میں پیشرفت کی وجہ سے، ڈیپ لرننگ نیورل نیٹ ورک (جی اے این) کا استعمال آپٹیکل مائکروسکوپ فوٹو گرافی کی تصاویر کے سپر ریزولوشن کو بڑھانے کے لیے کیا گیا ہے، 40x سے 100x تک، آپٹیکل مائکروسکوپ کے ساتھ 20x سے 1500x تک، اسکیننگ الیکٹران مائکروسکوپ کے مقابلے میں، نیورل لینس کے ذریعے، اور پوزیٹرون اخراج ٹومگرافی اور فلوروسینس مائکروسکوپی کے ساتھ۔ ملٹی فوکل پلین مائکروسکوپی (ایم یو ایم) محرک اخراج کی کمی مائکروسکوپ (ایس ٹی ای ڈی) فوٹو ایکٹیویٹڈ لوکلائزیشن مائکروسکوپی (پی اے ایل ایم) ڈیکونولوشن فوٹو ایکٹیویٹیبل پروبز متعلقہ لائٹ الیکٹران مائکروسکوپی سپر ریزولوشن امیجنگ ویڈیو سپر ریزولوشن حوالہ جات مزید پڑھنا مائکروسکوپی جرمن ایجادات سیل امیجنگ لیبارٹری کا سامان آپٹیکل مائکروسکوپی فلوروسینس تکنیک