Interference reflection microscopy
انٹرفیرنس ریفلیکشن مائکروسکوپی (آئی آر ایم)، جسے ریفلیکشن انٹرفیرنس کنٹریسٹ مائکروسکوپی (آر آئی سی ایم) یا ریفلیکشن کنٹریسٹ مائکروسکوپی (آر سی ایم) بھی کہا جاتا ہے، سیاق و سباق پر منحصر ہے، ایک آپٹیکل مائکروسکوپی تکنیک ہے جو شیشے کی سطح پر کسی شے کی شبیہہ بنانے کے لیے مداخلت کے اثرات کا فائدہ اٹھاتی ہے۔ سگنل کی شدت شیشے کی سطح سے شے کی قربت کی پیمائش ہے۔ اس تکنیک کو (فلوروسینٹ) لیبل کے استعمال کے بغیر خلیے کی جھلی میں ہونے والے واقعات کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جیسا کہ ٹی آئی آر ایف خوردبین کے معاملے میں ہوتا ہے۔ تاریخ اور نام 1964 میں، ایڈم ایس جی کرٹس نے انٹرفیرنس ریفلیکشن مائکروسکوپی (آئی آر ایم) کی اصطلاح تیار کی، جس کا استعمال سیل بائیولوجی کے میدان میں جنین چکن ہارٹ فائبر بلاسٹ کا مطالعہ کرنے کے لیے کیا گیا۔ انہوں نے چپکنے والی جگہوں اور فائبر بلاسٹ کے فاصلے کو دیکھنے کے لیے آئی آر ایم کا استعمال کیا، اس بات کو نوٹ کرتے ہوئے کہ شیشے کے ساتھ رابطہ زیادہ تر سیل کے دائرے اور سڈوپوڈیا تک محدود تھا۔ 1975 میں، جوہان سیبسٹین پلوم نے آئی آر ایم (ایک کتابی باب میں شائع) میں بہتری متعارف کرائی، جسے انہوں نے ریفلیکشن کانٹریسٹ مائکروسکوپی (آر سی ایم) کہا۔ بہتری یہ ہے کہ آپٹیکل سسٹم میں آوارہ روشنی کو مزید کم کرنے کے لیے نام نہاد اینٹی فلیکس آبجیکٹ اور کراسڈ پولرائزرز کا استعمال کیا جائے۔ آج، اس اسکیم کو بنیادی طور پر ریفلیکشن انٹرفیرنس کانٹریسٹ مائکروسکوپی (آر آئی سی ایم) کہا جاتا ہے، جس کا نام بریٹر ہان اور کونراڈ بیک نے 1979 میں متعارف کرایا تھا۔ تاہم، اصطلاح IRM بعض اوقات RICM سیٹ اپ کو بیان کرنے کے لیے ہوتی ہے۔ اس تکنیک کو بیان کرنے کے لیے استعمال ہونے والے ناموں کی کثرت نے کچھ الجھن پیدا کی ہے، اور اس پر 1985 کے اوائل میں ورشورین نے تبادلہ خیال کیا تھا۔ بیریٹر-ہان اور کونراڈ بیک نے اس تکنیک کو الیکٹران مائکروسکوپی کے ساتھ مربوط کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مختلف ممالیہ سیل لائنیں مخصوص فوکل چپکنے والی جگہوں میں شیشے کے سبسٹریٹ پر قائم رہتی ہیں۔ نظریہ منسلک خلیے کی تصویر بنانے کے لیے، ایک مخصوص طول موج کی روشنی پولرائزر سے گزرتی ہے۔ یہ لکیری پولرائزڈ روشنی ایک بیم اسپلٹر کے ذریعے مقصد کی طرف جھلکتی ہے، جو روشنی کو نمونے پر مرکوز کرتی ہے۔ شیشے کی سطح ایک خاص حد تک عکاسی کرتی ہے اور پولرائزڈ روشنی کی عکاسی کرے گی۔ جو روشنی شیشے سے جھلکتی نہیں ہے وہ خلیے میں داخل ہوگی اور خلیے کی جھلی سے جھلکتی ہے۔ تین حالات پیدا ہو سکتے ہیں۔ سب سے پہلے، جب جھلی شیشے کے قریب ہوتی ہے، تو شیشے سے جھلکنے والی روشنی کو طول موج کے آدھے حصے میں منتقل کیا جاتا ہے، تاکہ جھلی سے جھلکنے والی روشنی شیشے کے مراحل سے جھلکنے والی روشنی کے مقابلے میں فیز شفٹ کرے اور اس وجہ سے ایک دوسرے کو منسوخ کر دے (مداخلت)۔ اس مداخلت کے نتیجے میں حتمی تصویر میں ایک سیاہ پکسل (شکل میں بائیں کیس) ہوتا ہے۔ دوسرا، جب جھلی شیشے سے منسلک نہیں ہوتی ہے، تو شیشے سے عکاسی ہونے والی روشنی کے مقابلے میں جھلی سے عکاسی میں ایک چھوٹی فیز شفٹ ہوتی ہے، اور اس وجہ سے وہ ایک دوسرے کو منسوخ نہیں کریں گے، جس کے نتیجے میں تصویر میں ایک روشن پکسل (شکل میں صحیح صورت) ہوتا ہے۔ تیسرا، جب کوئی نمونہ نہیں ہوتا ہے، تو شیشے سے صرف عکاسی شدہ روشنی کا پتہ چلتا ہے اور حتمی تصویر میں روشن پکسلز کے طور پر ظاہر ہوگا۔ عکاسی شدہ روشنی بیم اسپلٹر پر واپس سفر کرے گی اور دوسرے پولرائزر سے گزرے گی، جو حتمی تصویر بنانے کے لیے ڈٹیکٹر (عام طور پر سی سی ڈی کیمرا) تک پہنچنے سے پہلے بکھری ہوئی روشنی کو ختم کرتی ہے۔ پولرائزر بکھرے ہوئے روشنی کو کم کرکے کارکردگی میں اضافہ کر سکتے ہیں ؛ تاہم حساس ڈیجیٹل کیمرے کے ساتھ جدید سیٹ اپ میں، ان کی ضرورت نہیں ہے۔ نظریہ عکاسی اضطراب اشاریہ میں تبدیلی کی وجہ سے ہوتی ہے، اس لیے ہر حد پر روشنی کا ایک حصہ جھلکتا ہے۔ عکاسی کی مقدار عکاسی گتانک کے ذریعہ دی جاتی ہے، مندرجہ ذیل اصول کے مطابق: عکاسی عکاسی شدہ روشنی کی شدت () اور آنے والی روشنی کی شدت () کا تناسب ہے: شیشے (1.50-1.54، فہرست دیکھیں)، پانی (1.31، فہرست دیکھیں)، خلیے کی جھلی (1.48) اور سائٹوسول (1.35) کے لیے عام اضطراری اشاریوں کا استعمال کرتے ہوئے، ہر انٹرفیس کے ذریعے عکاسی ہونے والی روشنی کے حصے کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔ اضطراری اشاریہ جات کے درمیان فرق بڑھنے کے ساتھ عکاسی کی مقدار میں اضافہ ہوتا ہے، جس کے نتیجے میں شیشے کی سطح اور کلچر میڈیم کے درمیان انٹرفیس سے ایک بڑی عکاسی ہوتی ہے (تقریبا پانی کے برابر: 1.31-1.33)۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ خلیے کے بغیر تصویر روشن ہوگی، جبکہ جب خلیہ منسلک ہوتا ہے تو درمیانے اور جھلی کے درمیان فرق ایک بڑی عکاسی کا سبب بنتا ہے جو مرحلے میں قدرے منتقل ہوتا ہے، جس کی وجہ سے شیشے کی طرف سے عکاسی ہونے والی روشنی میں مداخلت ہوتی ہے۔ چونکہ درمیانے میمبرین انٹرفیس سے جھلکنے والی روشنی کا طول و عرض بکھرنے کی وجہ سے کم ہو جاتا ہے، اس لیے منسلک علاقہ گہرا نظر آئے گا لیکن مکمل طور پر سیاہ نہیں ہوگا۔ چونکہ نمونے پر مرکوز روشنی کا شنک واقع روشنی کے مختلف زاویوں کو جنم دیتا ہے، اس لیے مداخلت کے نمونوں کی ایک وسیع رینج ہے۔ جب نمونوں میں 1 سے کم طول موج (صفر آرڈر فرنج) سے فرق ہوتا ہے، تو نمونے یکجا ہوتے ہیں، جس کے نتیجے میں شدت میں اضافہ ہوتا ہے۔ یہ 1 سے زیادہ عددی یپرچر والے مقصد کا استعمال کرکے حاصل کیا جا سکتا ہے۔ ضروریات آئی آر ایم کا استعمال کرتے ہوئے خلیوں کی تصویر لینے کے لیے خوردبین کو کم از کم درج ذیل عناصر کی ضرورت ہوتی ہے: 1) روشنی کا ذریعہ، جیسے ہیلوجن لیمپ، 2) آپٹیکل فلٹر (جو طول موج کی ایک چھوٹی سی حد سے گزرتا ہے)، اور 3) بیم اسپلٹر (جو 50 فیصد کی عکاسی کرتا ہے اور منتخب کردہ طول موج کا 50 فیصد منتقل کرتا ہے)۔ روشنی کے منبع کو زیادہ شدت والی روشنی پیدا کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، کیونکہ بیم اسپلٹر اور نمونے سے ہی بہت زیادہ روشنی ختم ہو جائے گی۔ مختلف طول موج کے نتیجے میں مختلف آئی آر ایم تصاویر سامنے آتی ہیں۔ بیریٹر-ہان اور ان کے ساتھیوں نے دکھایا کہ ان کے پی ٹی کے 2 خلیوں کے لیے، 546 این ایم کی طول موج والی روشنی کے نتیجے میں 436 این ایم کی طول موج والی نیلی روشنی سے بہتر تضاد ہوتا ہے۔ آئی آر ایم کے بنیادی نظریہ میں بہت سی اصلاحات کی گئی ہیں، جن میں سے زیادہ تر تصویر کی تشکیل کی کارکردگی اور پیداوار میں اضافہ کرتی ہیں۔ بیم اسپلٹر اور نمونے کے درمیان پولرائزر اور ایک چوتھائی لہر پلیٹ رکھ کر، لکیری پولرائزڈ روشنی کو سرکلر پولرائزڈ روشنی میں تبدیل کیا جا سکتا ہے اور بعد میں اسے لکیری پولرائزڈ روشنی میں تبدیل کیا جا سکتا ہے، جس سے نظام کی کارکردگی میں اضافہ ہوتا ہے۔ سرکلر پولرائزر مضمون اس عمل پر تفصیل سے بحث کرتا ہے۔ مزید برآں، دوسرے پولرائزر کو شامل کرکے، جو پہلے پولرائزر کے مقابلے میں 90 ڈگری گھمایا جاتا ہے، آوارہ روشنی کو ڈٹیکٹر تک پہنچنے سے روکا جا سکتا ہے، جس سے سگنل اور شور کا تناسب بڑھتا ہے (ورسچیورین کی شکل 2 دیکھیں)۔ حیاتیاتی ایپلی کیشنز حیاتیاتی نمونوں کا مطالعہ کرنے کے لیے آئی آر ایم کو استعمال کرنے کے کئی طریقے ہیں۔ خلیوں کے چپکنے اور خلیوں کی منتقلی پر مرکوز تکنیک کے استعمال کی ابتدائی مثالیں۔ ویسیکل فیوژن مزید حال ہی میں، اس تکنیک کو کرومفین خلیوں میں ایکسوائٹوسس کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ جب ڈی آئی سی کا استعمال کرتے ہوئے تصویر کشی کی جاتی ہے تو کرومافین کے خلیات چھوٹے پروٹریشن کے ساتھ گول خلیوں کے طور پر ظاہر ہوتے ہیں۔ جب اسی خلیے کی آئی آر ایم کا استعمال کرتے ہوئے تصویر کشی کی جاتی ہے، تو شیشے پر موجود خلیے کے نقوش کو واضح طور پر چھوٹے پروٹریشن کے ساتھ ایک تاریک علاقے کے طور پر دیکھا جا سکتا ہے۔ جب پھپھوندی جھلی کے ساتھ ضم ہو جاتی ہیں، تو وہ سیاہ نقش کے اندر چھوٹے ہلکے حلقوں کے طور پر ظاہر ہوتے ہیں (دائیں پینل میں اوپری خلیے میں روشن دھبے)۔ آئی آر ایم کا استعمال کرتے ہوئے کرومفین خلیوں میں ویسیکل فیوژن کی ایک مثال فلم 1 میں دکھائی گئی ہے۔ 60 ایم ایم پوٹاشیم کے ساتھ محرک ہونے پر، گھنے کور گرینیولز کے ایکسوائٹوسس کے نتیجے میں کرومافین سیل کے سیاہ نقش کے اندر متعدد روشن دھبے ظاہر ہونے لگتے ہیں۔ چونکہ آئی آر ایم کو فلوروسینٹ لیبل کی ضرورت نہیں ہے، اس لیے اسے امیجنگ کی دیگر تکنیکوں، جیسے ایپی فلوریسنس اور ٹی آئی آر ایف مائکروسکوپی کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے تاکہ پروٹین کی حرکیات کا مطالعہ ویسیکل ایکسوائٹوسس اور اینڈوسیٹوسس کے ساتھ کیا جا سکے۔ فلوروسینٹ لیبلز کی کمی کا ایک اور فائدہ فوٹوٹوکسائٹی کو کم کرنا ہے۔ مزید پڑھنے کے لیے حوالہ جات کوانٹیٹیو ریفلیکشن انٹرفیرنس کانٹریسٹ مائکروسکوپی (آر آئی سی ایم) ان سافٹ میٹر اینڈ سیل اڈیژن، لورنٹ لیموزین اور خیا سینگپتا، کیم فزچیم 2009، 10، 2752-2768۔ بیرونی روابط البرٹ آئن سٹائن کالج آف میڈیسن آن آئی آر ایم ریفلیکٹڈ کنفوکل مائکروسکوپی آن نیکون مائکروسکوپی یو آپٹیکل مائکروسکوپی تکنیک ویڈیو کلپس پر مشتمل مضامین