Hot start PCR
ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر روایتی پولیمریز چین ری ایکشن (پی سی آر) کی ایک ترمیم شدہ شکل ہے جو کمرے (یا ٹھنڈے) درجہ حرارت پر غیر مخصوص ڈی این اے امپلیفکیشن کی وجہ سے ناپسندیدہ مصنوعات اور پرائمر ڈائمرز کی موجودگی کو کم کرتی ہے۔ زیادہ پیداوار حاصل کرنے کے لیے پی سی آر طریقہ کار میں بہت سی تغیرات اور ترامیم تیار کی گئی ہیں ؛ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر ان میں سے ایک ہے۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر روایتی پی سی آر جیسے ہی اصولوں کی پیروی کرتا ہے-اس میں یہ ایک ہی پھنسے ہوئے ٹیمپلیٹ سے ڈی این اے کی ترکیب کے لیے ڈی این اے پولیمرس کا استعمال کرتا ہے۔ تاہم، یہ اضافی حرارتی اور علیحدگی کے طریقوں کا استعمال کرتا ہے، جیسے کہ مصنوعات کی پیداوار کو بڑھانے کے ساتھ ساتھ اعلی خاصیت اور حساسیت فراہم کرنے کے لیے تک پولیمریز کے پابند ہونے اور تک پولیمریز کے دیر سے اضافے کو غیر فعال یا روکنا۔ غیر مخصوص بائنڈنگ اور پرائمر ڈائمرز کی پرائمنگ یا تشکیل کو ڈی نیچوریشن کے بعد ری ایکشن مکس کو مکمل کرکے کم سے کم کیا جاتا ہے۔ اعلی درجہ حرارت پر رد عمل کے مرکب کو مکمل کرنے کے کچھ طریقوں میں ایسی ترامیم شامل ہیں جو کم درجہ حرارت میں ڈی این اے پولیمریز کی سرگرمی کو روکتی ہیں، ترمیم شدہ ڈی آکسی ریبونوکلیوٹائڈ ٹرائی فاسفیٹس (ڈی این ٹی پیز) کا استعمال، اور انحطاط کے بعد ضروری ریجینٹس میں سے ایک کا جسمانی اضافہ۔ ان اضافی طریقوں کے ذریعے، ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر غیر مخصوص امپلیفکیشن کی مقدار کو کم کرنے کے قابل ہے جو قدرتی طور پر کم درجہ حرارت کے دوران ہوتی ہے-جو روایتی پی سی آر کے لیے ایک مسئلہ بنی ہوئی ہے۔ یہ تبدیلیاں مجموعی طور پر اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کام کرتی ہیں کہ محلول میں موجود مخصوص انزائم غیر فعال رہیں گے یا اس وقت تک روکے جائیں گے جب تک کہ بہترین اینیلنگ درجہ حرارت تک نہ پہنچ جائے۔ غیر مخصوص پی سی آر مصنوعات کی تشکیل کو روکنا، خاص طور پر ابتدائی چکروں میں، پی سی آر کے ذریعے امپلیفیکیشن کی حساسیت میں خاطر خواہ اضافہ ہوتا ہے۔ پی سی آر یا آر ٹی-پی سی آر کی تشخیصی ایپلی کیشنز میں یہ انتہائی اہمیت کا حامل ہے۔ بیک گراؤنڈ پولیمیرس چین ری ایکشن (پی سی آر) ایک سالماتی حیاتیات کی تکنیک ہے جو ڈی این اے کے مخصوص حصوں کو شدت کے کئی آرڈرز سے بڑھانے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ ڈی این اے کے مخصوص حصوں کو تین عملوں، ڈی نیچوریشن، اینیلنگ اور ایکسٹینشن پر بڑھایا جاتا ہے-جہاں ڈی این اے اسٹرینڈز کو کمرے کے درجہ حرارت سے زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت تک بڑھا کر الگ کیا جاتا ہے اس سے پہلے کہ پرائمرز نیوکلیوٹائڈز کو ٹیمپلیٹ اسٹرینڈ سے جوڑتے ہیں۔ یہ ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کرتا ہے، جو کم درجہ حرارت پر قدرے فعال ہوتا ہے۔ روایتی پی سی آر میں، رد عمل کا مرکب کمرے کے درجہ حرارت پر مکمل ہوتا ہے، اور ڈی این اے پولیمریز سرگرمی کی وجہ سے، پرائمر غیر مخصوص طور پر پرائمر ڈائمر یا اینیل سے ڈی این اے بنا سکتے ہیں۔ پی سی آر طریقہ کار کے دوران، ڈی این اے پولیمریز ڈی این اے کے کسی بھی ٹکڑے کو باؤنڈ پرائمرز کے ساتھ بڑھا دے گا، جس سے ٹارگٹ پروڈکٹس پیدا ہوں گی بلکہ غیر مخصوص مصنوعات بھی پیدا ہوں گی جو پیداوار کو کم کرتی ہیں۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر میں، کچھ ریجینٹس کو اس وقت تک الگ رکھا جاتا ہے جب تک کہ مرکب کو مخصوص اینیلنگ درجہ حرارت پر گرم نہ کیا جائے۔ اس سے اینیلنگ کا وقت کم ہو جاتا ہے، جس کے نتیجے میں غیر مخصوص ڈی این اے کی توسیع کا امکان اور ڈی نیچرشن سے پہلے غیر مخصوص پرائمر بائنڈنگ کا اثر کم ہو جاتا ہے۔ روایتی پی سی آر میں، زیادہ سے زیادہ اینیلنگ درجہ حرارت (50-65 °C) سے نیچے کم درجہ حرارت کے نتیجے میں ہدف میں تبدیلیاں ہوتی ہیں جیسے کہ غیر مخصوص امپلیفکیشن جہاں پرائمر غیر خاص طور پر نیوکلک ایسڈ سے جڑے ہوں گے۔ یہ غیر مخصوص پرائمر کمپلیکس، جو مرکب میں زیادہ ہوتے ہیں، پرائمر ڈائمر اور غلط پرائمنگ جیسے ضمنی مصنوعات کی ترکیب کی وجہ ہیں۔ غلط پرائمنگ امپلیفکیشن کے لیے ہدف کے سلسلے کے ساتھ فعال طور پر مقابلہ کرنے کے ذریعے پی سی آر امپلیفکیشن کی کارکردگی کو بہت زیادہ روکتی ہے اور کم کرتی ہے۔ اسی طرح، پرائمر ڈائمر کمپلیکس بناتے ہیں جو حاصل شدہ کاپی نمبر امپلیفکیشن کی مقدار کو کم کرتے ہیں۔ اسے ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر کو نافذ کرکے کنٹرول کیا جا سکتا ہے جو زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت کو پورا کرنے تک پرائمر ایکسٹینشنز کو بلاک کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر میں، اہم ریجینٹس (جیسے ڈی این اے پولیمریز اور میگنیشیم کوفیکٹر) کو پی سی آر مرکب میں رد عمل ظاہر کرنے سے روکا جاتا ہے جب تک کہ جسمانی علیحدگی یا کیمیائی تبدیلیوں کے ذریعے زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت پورا نہ ہو جائے۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر اس وقت بھی ہو سکتا ہے جب ٹاک پولیمریز کو روکا/غیر فعال کیا جاتا ہے یا اس کے اضافے میں زیادہ سے زیادہ اینیلنگ درجہ حرارت تک تاخیر ہوتی ہے، ڈی آکسیریبونیوکلیوٹائڈ ٹرائی فاسفیٹ ترمیم کے ذریعے یا کیجنگ اور ثانوی ڈھانچے میں ہیرا پھیری کے ذریعے پرائمرز میں ترمیم کرکے۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر اکثر ایسے حالات میں روایتی پی سی آر کے برخلاف ایک بہتر نقطہ نظر ہے جہاں رد عمل کے مرکب میں ڈی این اے کی کم حراستی ہوتی ہے، ڈی این اے ٹیمپلیٹ انتہائی پیچیدہ ہوتا ہے، یا اگر پی سی آر میں اولیگونیوکلیوٹائڈ پرائمر کے کئی جوڑے ہوتے ہیں۔ طریقہ کار ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر ایک ایسا طریقہ ہے جو پیداوار کے نقصان کو کم سے کم کرنے کے لیے غیر مخصوص بائنڈنگ کو روکنے کے لیے کم درجہ حرارت پر ڈی این اے پولیمریز کی توسیع کو روکتا ہے۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر ریجینٹس کو محدود کرنے کے ذریعے غیر مخصوص بائنڈنگ کی مقدار کو پی سی آر کے حرارتی مراحل تک کم کرتا ہے-رد عمل میں تک ڈی این اے پولیمرس کو محدود کرکے رد عمل کو جلد محدود کرتا ہے۔ غیر مخصوص بائنڈنگ اکثر پرائمر ڈائمرز اور غلط پرائمیڈ/غلط پرائمیڈ اہداف کی طرف لے جاتی ہے۔ ان کو ترمیم شدہ طریقوں کے ذریعے درست کیا جا سکتا ہے جیسے: ٹاک ڈی این اے پولیمریز انزیم سے منسلک اینٹی باڈیز/ٹاک ڈی این اے پولیمریز اینٹی باڈیز کے ساتھ پیچیدہ ٹاک ڈی این اے پولیمریز کی غیر فعالیت/روک تھام: انزیم سے منسلک اینٹی باڈیز ٹاک ڈی این اے پولیمریز کو غیر فعال کر دیتی ہیں۔ اینٹی باڈیز پولیمرس سے جڑتی اور جڑی ہوتی ہیں، جو ڈی این اے کی ابتدائی وسعت کو روکتی ہیں جو کم درجہ حرارت پر ہو سکتی ہے۔ ایک بار جب زیادہ سے زیادہ اینیلنگ درجہ حرارت پورا ہو جائے تو، اینٹی باڈیز انحطاط اور الگ ہونا شروع ہو جائیں گی، تاق ڈی این اے پولیمرس کو رد عمل میں جاری کرے گی اور امپلیفیکیشن کے عمل کو شروع کرنے کی اجازت دے گی۔ پلاٹینم ٹاک ڈی این اے پولیمرس اور ایکیو اسٹارٹ ٹاک ڈی این اے پولیمرس (دونوں بالترتیب لائف ٹیکنالوجیز اور کوانٹا بائیو سائنسز میں ایوب راشچیان کے ذریعہ تیار کردہ) تجارتی طور پر دستیاب اینٹی باڈی پر مبنی ہاٹ اسٹارٹ ٹاک ڈی این اے پولیمرس کی مثالیں ہیں۔ یہ ٹاک ڈی این اے پولیمرس ٹاک ڈی این اے پولیمرس کے لیے مخصوص مونوکلونل اینٹی باڈیز کے مرکب کے ساتھ پہلے سے پیچیدہ ہیں۔ موم کے موتیوں: موم کے موتیوں کے ذریعے تاق ڈی این اے پولیمریز اور پی سی آر کے بقیہ اجزاء کے درمیان ایک جسمانی رکاوٹ پیدا ہوتی ہے جو درجہ حرارت پر منحصر ہوتی ہے۔ ایک بار جب درجہ حرارت 70 ڈگری سیلسیس سے زیادہ بڑھ جاتا ہے، تو پہلے چکر میں ڈی نیچوریشن مرحلے کے دوران، موم کا مالا پگھل جاتا ہے، جس سے تک ڈی این اے پولیمرس رکاوٹ سے بچ کر رد عمل میں چھوڑ دیا جاتا ہے-یمپلیفکیشن کا عمل شروع ہوتا ہے۔ موم کی پرت پھر توسیعی مرحلے کے دوران رد عمل کے مرکب کے اوپری حصے میں چلی جاتی ہے اور بعد میں بخارات کی رکاوٹ کے طور پر کام کرتی ہے۔ انتہائی مخصوص اولیگونیوکلیوٹائڈز: اولیگونیوکلیوٹائڈز نیوکلک ایسڈ کے مختصر پولیمر ہوتے ہیں جو آسانی سے جڑے ہوتے ہیں۔ انتہائی مخصوص اولیگونیوکلیوٹائڈز، جیسے کہ اپٹیمرز، کم درجہ حرارت پر ٹاک ڈی این اے پولیمرس سے جڑے ہوتے ہیں جو اسے مرکب میں غیر فعال بنا دیتے ہیں۔ صرف زیادہ درجہ حرارت پر اولیگونیوکلیوٹائڈز ٹاک سے الگ ہو جائیں گے جس سے یہ رد عمل ظاہر کر سکے گا۔ یہ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر کے لیے سب سے مؤثر طریقے ہیں، خاص طور پر انزائم سے منسلک اینٹی باڈیز اور انتہائی مخصوص اولیگونیوکلیوٹائڈز کے طریقے ان طریقہ کار کے دوران سب سے زیادہ موزوں ہیں جن میں غیر فعال ہونے کے لیے کم وقت درکار ہوتا ہے۔ تاہم، دوسرے طریقوں کو نافذ کرنے کے لیے جانا جاتا ہے جیسے: تک ڈی این اے پولیمرس پری ہیٹنگ کا دیر سے اضافہ: پی سی آر مشین کو پہلے سے گرم کیا جاتا ہے جبکہ اجزاء کو برف کے اوپر ملایا جاتا ہے اور پھر زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد فوری طور پر پی سی آر مشین میں ڈال دیا جاتا ہے۔ یہ ضروری وارم اپ کے عمل کو ختم کر دے گا، پرائمرز کی غیر مخصوص اینیلنگ کو کم کرے گا اور اس بات کو یقینی بنائے گا کہ مکسچر میں موجود کسی بھی مس پیئرڈ پرائمرز کو الگ کر دیا جائے۔ منجمد کرنا: منجمد کرنا موم کے موتیوں کی طرح جسمانی علیحدگی کی ایک شکل کے طور پر کام کرتا ہے۔ پرائمرز، ٹیمپلیٹ اسٹرینڈ، پانی اور ڈی آکسی ریبونوکلیوٹائڈ ٹرائی فاسفیٹ (ڈی این ٹی پی) پر مشتمل رد عمل کا مرکب ٹاک پولیمریز سے پہلے منجمد کیا جاتا ہے اور باقی پی سی آر اجزاء کو منجمد مرکب کے اوپر شامل کیا جاتا ہے۔ یہ غیر مخصوص پابند کو روکنے کے لیے کام کرتا ہے۔ ٹاک کا بعد میں اضافہ: رد عمل کے مرکب میں پی سی آر کے اجزاء کو ٹاک کے اضافے کے بغیر تیار اور گرم کیا جاتا ہے۔ زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد ہی تک کو بعد میں مرکب میں شامل کیا جاتا ہے۔ تاہم، یہ طریقہ سب سے کم قابل اعتماد ہے اور اجزاء کی آلودگی کا باعث بن سکتا ہے۔ ایک اور طریقہ ڈی آکسی ریبونوکلیوٹائڈ ٹرائی فاسفیٹ میڈیٹڈ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر کے ذریعے ہے جو ایک حفاظتی گروپ کے ذریعے نیوکلیوٹائڈ کے اڈوں کو تبدیل کرتا ہے۔ ہاٹ اسٹارٹ ڈی این ٹی پی کو کیمیائی طور پر تبدیل کیا جا سکتا ہے تاکہ 3 پرائم ٹرمینس پر حرارت کے حساس حفاظتی گروپ کو شامل کیا جا سکے۔ یہ ترمیم نیوکلیوٹائڈز کو ٹیمپلیٹ اسٹرینڈ سے جڑے رہنے کے لیے ٹاک پولیمریز کے ساتھ تعامل کرنے سے روکے گی جب تک کہ زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد، حفاظتی گروپ کو ہیٹ ایکٹیویشن مرحلے کے دوران ہٹا دیا جائے گا۔ ہاٹ اسٹارٹ ڈی این ٹی پی، ڈی اے، ڈی ٹی، ڈی سی اور ڈی جی قدرتی نیوکلیوٹائڈز کی جگہ لے لیتے ہیں۔ تمام چار ترمیم شدہ نیوکلیوٹائڈز کا استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے، تاہم، پچھلی تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ قدرتی نیوکلیوٹائڈز میں سے ایک یا دو کو ترمیم شدہ ڈی این ٹی پیز سے تبدیل کرنا اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کافی ہوگا کہ غیر مخصوص اضافہ نہ ہو۔ نیوکلک ایسڈ کی ایک اور کیمیائی ترمیم حرارت سے واپسی کے قابل کوولینٹ ترمیم کے ذریعے ہوتی ہے جو دلچسپی کے ٹیمپلیٹ پر پرائمرز کی ہائبرڈائزیشن میں رکاوٹ ڈالنے کا کام کرتی ہے۔ گوانوسین امینو گروپ ڈی جی بنانے کے لیے گلائی آکسل کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔ تبدیل شدہ پرائمر ثانوی ڈھانچہ: کچھ ثانوی ڈھانچہ پرائمر کے افعال میں رکاوٹ ڈال سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، ہیئر پن ڈھانچے والے اولیگونیوکلیوٹائڈز پرائمر کے طور پر مؤثر طریقے سے کام نہیں کر سکتے۔ تاہم، رد عمل کے مرکب کو اینیلنگ درجہ حرارت پر گرم کرنے کے بعد پرائمر ایک موافقت کی تبدیلی سے گزرے گا جس سے پرائمر اس کے بجائے ایک لکیری ڈھانچہ تشکیل دے گا، جو پرائمر کو ہدف کے حصے سے منسلک کرنے اور پی سی آر شروع کرنے کے قابل بناتا ہے۔ دراصل، ہیئر پن پرائمرز کے لیے ایک زیادہ مستحکم ترتیب ہے جسے 'ڈبل ببل' پرائمرز کہا جاتا ہے، جو ہیڈ ٹو ٹیل ہوموڈیمر ترتیب بناتے ہیں جسے ریورس ٹرانسکرپشن اور ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر دونوں کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ فوٹو کیمیکل طور پر ہٹنے کے قابل پنجرے: ایک کیجنگ گروپ جو ایک حفاظتی گروپ ہے جو فوٹو کیمیکل طور پر ہٹنے کے قابل ہے، جیسے کیجڈ تھائمیڈائن فاسفورامائٹس، کو اولیگونیوکلیوٹائڈ پرائمر میں شامل کیا جاتا ہے۔ یہ یووی تابکاری (365 این ایم) کے استعمال کے ذریعے پرائمر کے فنکشن کو چالو اور غیر فعال کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ لہذا، اینیلنگ درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد پرائمرز کو چالو کیا جا سکتا ہے۔ پی سی آر میں میگنیشیم میگنیشیم کے کنٹرول شدہ اضافے کی ضرورت ہوتی ہے اور یہ ایک شریک عنصر کے طور پر کام کرتا ہے کیونکہ ٹاک پولیمرس میگنیشیم پر منحصر ہے۔ میگنیشیم اور فاسفیٹ کے ارتکاز کو معیاری بفر ریجینٹس میں بڑھانے سے میگنیشیم کا اگنا پیدا ہوتا ہے، جو رد عمل کے لیے ایک گرم آغاز فراہم کرتا ہے کیونکہ تھرمل سائیکلنگ مرحلے تک ڈی این اے پولیمرس کے لیے کوئی میگنیشیم نہیں ہوتا ہے۔ تھرمل سائیکلنگ کے دوران، میگنیشیم دوبارہ محلول میں تحلیل ہو جائے گا اور پولیمرس کے استعمال کے لیے دستیاب ہو جائے گا جس سے یہ عام طور پر کام کر سکے گا۔ فوائد ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر اس لحاظ سے فائدہ مند ہے کہ اسے کم ہینڈلنگ کی ضرورت ہوتی ہے اور آلودگی کے خطرے کو کم کرتا ہے۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر یا تو کیمیائی طور پر تبدیل کیا جا سکتا ہے یا اینٹی باڈی پر مبنی ہو سکتا ہے جو طریقہ کار کو مختلف فوائد فراہم کرتا ہے۔ کیمیائی طور پر ترمیم شدہ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر میں، طریقہ کار کو کمرے کے درجہ حرارت کے تحت لیا جا سکتا ہے اور پی سی آر کے عمل کے شروع ہونے سے پہلے پرائمرز کو ایک دوسرے سے جڑے رہنے سے روکنے کے ساتھ ساتھ غیر مخصوص پرائمنگ کو محدود کرکے پرائمر ڈائمرز کی تشکیل کو نمایاں طور پر کم کر دیتا ہے۔ اسی طرح، ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر ٹیمپلیٹ کے سلسلے میں پرائمرز کے بائنڈنگ کو روکتا ہے جس میں کم ہومیولوجی ہوتی ہے جو غلط پرائمنگ کا باعث بنتی ہے۔ یہ سخت حالات کی وجہ سے خاصیت اور حساسیت کو بھی بہتر بنا سکتا ہے، ساتھ ہی ہدف شدہ ٹکڑے کی مصنوعات کی پیداوار میں اضافہ کر سکتا ہے۔ اینٹی باڈی پر مبنی ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر میں، سائیکلنگ کے عمل کے دوران ابتدائی ڈی نیچوریشن مرحلے کے بعد پولیمریز چالو ہو جاتا ہے، اس لیے مطلوبہ وقت کم ہو جاتا ہے۔ یہ بھی ایک اعلی مخصوصیت کی طرف لے جاتا ہے۔ حدود اس کے فوائد کے ساتھ، ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر کی بھی حدود ہیں جن پر طریقہ کار کو نافذ کرنے سے پہلے غور کیا جانا چاہیے۔ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر میں روایتی پی سی آر کے برخلاف طویل عرصے تک حرارت کے اضافے کی ضرورت ہوتی ہے، لہذا، ٹیمپلیٹ ڈی این اے کو نقصان پہنچنے کا زیادہ خطرہ ہوتا ہے۔ حرارتی وقت میں اضافے کا مطلب یہ بھی ہے کہ یہ طریقہ کار کچھ طریقہ کار جیسے ون ٹیوب، سنگل بفر ریورس ٹرانسکرپشن-پی سی آر طریقہ کار کے لیے مطابقت نہیں رکھتا ہے جس میں ریورس ٹرانسکرپشن مرحلے سے گزرنے کے لیے کم درجہ حرارت کی ضرورت ہوتی ہے۔ کیمیائی طور پر ترمیم شدہ ہاٹ اسٹارٹ پی سی آر میں، ڈی این اے کے امپلیفیکیشن کا عمل منفی طور پر متاثر ہو سکتا ہے، سب سے پہلے پولیمریز کو چالو کرنے کے لیے درکار ری ایکٹیویشن ٹائم میں نمایاں اضافے کی وجہ سے اور دوسرا اگر ٹارگٹ ڈی این اے ٹیمپلیٹ کی لمبائی بہت لمبی ہو۔ اینٹی باڈی پر مبنی طریقہ کار میں، ہر انزائم کو ایک مختلف اینٹی باڈی کی ضرورت ہوتی ہے اور اس لیے طریقہ کار انجام دینے کی لاگت زیادہ ہوتی ہے۔ اس بات کے بھی شواہد موجود ہیں کہ بہت سے تجارتی ہاٹ اسٹارٹ انزائموں میں دراصل ڈی نیچوریشن سے پہلے کچھ حد تک سرگرمی ہوتی ہے، اور بہت کم سپلائرز اس بقایا سرگرمی کی جانچ کے بارے میں کوئی معلومات فراہم کرتے ہیں۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ ہاٹ اسٹارٹ انزائمز سے منسوب فوائد کا احساس نہیں ہو سکتا، یا بہترین طور پر بیچ یا مینوفیکچرر کے درمیان مختلف ہوں گے۔ حوالہ جات پولیمیرس چین ری ایکشن