Optical mapping
آپٹیکل میپنگ ڈی این اے کے واحد، داغدار مالیکیولز سے ترتیب شدہ، جینوم وسیع، ہائی ریزولوشن پابندی نقشے بنانے کی ایک تکنیک ہے، جسے "آپٹیکل میپس" کہا جاتا ہے۔ کسی جاندار کے نامعلوم ڈی این اے کے ساتھ پابندی والے انزائم سائٹس کے مقام کی نقشہ سازی کرکے، نتیجے میں ڈی این اے کے ٹکڑوں کا سپیکٹرم اجتماعی طور پر اس ترتیب کے لیے ایک منفرد "فنگر پرنٹ" یا "بارکوڈ" کے طور پر کام کرتا ہے۔ اصل میں 1990 کی دہائی میں NYU میں ڈاکٹر ڈیوڈ سی شوارٹز اور ان کی لیب کے ذریعہ تیار کیا گیا یہ طریقہ اس کے بعد سے مائکروبیل اور یوکرائیوٹک جینوم دونوں کے لیے بہت سے بڑے پیمانے پر ترتیب کے منصوبوں کے اسمبلی کے عمل کا لازمی حصہ رہا ہے۔ بعد کی ٹیکنالوجیز آپٹیکل میپنگ بنانے کے لیے ڈی این اے پگھلنے، ڈی این اے مسابقتی بائنڈنگ یا انزیمیٹک لیبلنگ کا استعمال کرتی ہیں۔ ٹیکنالوجی جدید آپٹیکل میپنگ پلیٹ فارم مندرجہ ذیل کام کرتا ہے: جینومک ڈی این اے لیسیڈ خلیوں سے حاصل کیا جاتا ہے، اور آپٹیکل میپنگ کے لیے بڑے جینومک مالیکیولز کی "لائبریری" تیار کرنے کے لیے تصادفی طور پر کاٹا جاتا ہے۔ ڈی این اے کے ایک واحد مالیکیول کو بڑھایا جاتا ہے (یا لمبا کیا جاتا ہے) اور چارج کے تعاملات کی وجہ سے فلوروسینٹ خوردبین کے نیچے سلائیڈ پر رکھا جاتا ہے۔ ڈی این اے مالیکیول اضافی پابندی والے انزائموں کے ذریعے ہضم ہوتا ہے، جو ہاضمے کے مخصوص مقامات پر پھٹ جاتے ہیں۔ نتیجے میں بننے والے مالیکیول کے ٹکڑے سطح سے جڑے رہتے ہیں۔ پھٹنے والی جگہوں پر ٹکڑے کے سروں کو پیچھے کھینچ لیا جاتا ہے (لکیری ڈی این اے کی لچک کی وجہ سے)، جس سے خلاء رہ جاتے ہیں جو خوردبین کے نیچے قابل شناخت ہوتے ہیں۔ انٹرکالیٹنگ ڈائی کے ساتھ داغدار ڈی این اے کے ٹکڑوں کو فلوروسینس مائکروسکوپی کے ذریعے دیکھا جاتا ہے اور ان کا سائز مربوط فلوروسینس کی شدت کی پیمائش کرکے کیا جاتا ہے۔ یہ واحد مالیکیول کا آپٹیکل نقشہ تیار کرتا ہے۔ انفرادی نظری نقشوں کو ایک اتفاق رائے، جینومک نظری نقشہ تیار کرنے کے لیے ملایا جاتا ہے۔ آپٹیکل میپنگ پلیٹ فارم کی تاریخ ابتدائی نظام ڈی این اے مالیکیولز کو ایک کور سلپ اور خوردبین سلائیڈ کے درمیان تیار شدہ پگھلی ہوئی ایگروز پر فکس کیا گیا تھا۔ ڈی این اے لگانے سے پہلے ریسٹریکشن انزائم کو پگھلی ہوئی ایگروز کے ساتھ پہلے سے ملایا گیا تھا اور میگنیشیم کے اضافے سے کلیویج شروع ہوا تھا۔ چارج شدہ سطحوں کا استعمال کرتے ہوئے جیل میٹرکس کے اندر متحرک ہونے کے بجائے، ڈی این اے مالیکیولز کو مثبت طور پر چارج شدہ سطح پر الیکٹروسٹیٹک تعاملات کے ذریعے اپنی جگہ پر رکھا جاتا تھا۔ ریزولوشن میں اس طرح بہتری آئی کہ ~ 30 کے بی سے لے کر 800 بی پی تک کے چھوٹے ٹکڑے سائز کے ہو سکتے ہیں۔ خودکار نظام اس میں متوازی انزیمیٹک پروسیسنگ کے لیے سلائیڈ پر متعدد واحد مالیکیولز (جیسے مائیکرو ایری) کو تلاش کرنے کے لیے ایک خودکار اسپاٹنگ سسٹم کی ترقی اور انضمام، امیج کے حصول کے لیے خودکار فلوروسینس مائکروسکوپی، امیجز کو سنبھالنے کے لیے امیج جلوس وژن، آپٹیکل میپ کی تعمیر کے لیے الگورتھم، بڑی مقدار میں ڈیٹا کی پروسیسنگ کے لیے کلسٹر کمپیوٹنگ مائیکرو فلوئڈکس کا استعمال کرتے ہوئے ہائی تھرو پٹ سسٹم مشاہدہ کیا گیا کہ واحد مالیکیولز کے ساتھ پائے جانے والے مائیکرو ایری بڑے جینومک ڈی این اے مالیکیولز کے لیے اچھی طرح سے کام نہیں کرتے، مائیکرو فلوئڈک ڈیوائسز جو متوازی مائیکرو چینلز کی سیریز رکھنے والی سافٹ لیتھوگرافی کا استعمال کرتے ہیں تیار کیے گئے۔ نینو کوڈنگ ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے اگلی نسل کا نظام آپٹیکل میپنگ میں بہتری، جسے "نینو کوڈنگ" کہا جاتا ہے، نینو کنفائنمنٹ میں لمبے ڈی این اے مالیکیولز کو پھنس کر تھرو پٹ کو فروغ دینے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ نقشہ سازی کی دیگر تکنیکیں نقشہ سازی کی روایتی تکنیکوں کے مقابلے میں او ایم کا فائدہ یہ ہے کہ یہ ڈی این اے کے ٹکڑے کی ترتیب کو محفوظ رکھتا ہے، جبکہ پابندی کی نقشہ سازی کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب کو دوبارہ تعمیر کرنے کی ضرورت ہے۔ اس کے علاوہ، چونکہ نقشے براہ راست جینومک ڈی این اے مالیکیولز سے بنائے جاتے ہیں، اس لیے کلوننگ یا پی سی آر نمونوں سے گریز کیا جاتا ہے۔ تاہم، ہر OM عمل اب بھی غلط مثبت اور منفی سائٹس سے متاثر ہوتا ہے کیونکہ ہر مالیکیول میں تمام پابندی والی سائٹس کو الگ نہیں کیا جاتا ہے اور کچھ سائٹس کو غلط طریقے سے کاٹا جا سکتا ہے۔ عملی طور پر، ایک ہی جینومک خطے کے مالیکیولز سے متعدد نظری نقشے بنائے جاتے ہیں، اور بہترین اتفاق رائے کے نقشے کا تعین کرنے کے لیے ایک الگورتھم استعمال کیا جاتا ہے۔ جینوم تجزیہ کے دیگر طریقے جینوم کے درمیان بڑے پیمانے پر جینومک تغیرات (جیسے انڈلز، ڈپلیکیشنز، انورژنز، ٹرانسلوکیشنز) کی شناخت کے لیے مختلف طریقے ہیں۔ طریقوں کے دیگر زمروں میں مائیکرو ارے، پلسڈ فیلڈ جیل الیکٹروفورسس، سائٹوجینیٹکس اور پیئرڈ اینڈ ٹیگز کا استعمال شامل ہے۔ استعمال ابتدائی طور پر آپٹیکل میپنگ سسٹم کا استعمال بیکٹیریا، پرجیویوں اور فنگی کے مکمل جینوم پابندی نقشے بنانے کے لیے کیا گیا ہے۔ یہ بیکٹیریل جینوم کو سکافولڈ اور تصدیق کرنے کے لیے بھی استعمال کیا گیا ہے۔ اسمبلی کے لیے سہاروں کے طور پر کام کرنے کے لیے، معروف ترتیب کے ڈیٹا کا استعمال کرتے ہوئے سلیکو میں پابندی والی جگہوں کے لیے جمع شدہ ترتیب کے کونٹگس کو اسکین کیا جا سکتا ہے اور انہیں جمع شدہ جینومک آپٹیکل نقشے سے ہم آہنگ کیا جا سکتا ہے۔ تجارتی کمپنی، اوپجن نے مائکروبیل جینومز کے لیے آپٹیکل میپنگ فراہم کی ہے۔ بڑے یوکرائیوٹک جینومز کے لیے، صرف ڈیوڈ سی شوارٹز لیب (جو اب میڈیسن-وسکونسن میں ہے) نے چوہے، انسان، چاول اور مکئی کے لیے نظری نقشے تیار کیے ہیں۔ آپٹیکل سیکوینسنگ آپٹیکل سیکوینسنگ ایک واحد مالیکیول ڈی این اے سیکوینسنگ تکنیک ہے جو ترتیب بہ ترکیب کی پیروی کرتی ہے اور آپٹیکل میپنگ ٹیکنالوجی کا استعمال کرتی ہے۔ ایس ایم آر ٹی سیکوینسنگ جیسے دیگر واحد سالماتی ترتیب کے طریقوں کی طرح، یہ تکنیک ڈی این اے کے ابتدائی نمونے کو بڑھانے اور ڈی این اے کی متعدد کاپیوں کو ترتیب دینے کے بجائے ایک واحد ڈی این اے مالیکیول کا تجزیہ کرتی ہے۔ ترکیب کے دوران، فلورکروم-لیبلڈ نیوکلیوٹائڈز کو ڈی این اے پولیمریز کے استعمال کے ذریعے شامل کیا جاتا ہے اور فلوروسینس مائکروسکوپی کے ذریعے ٹریک کیا جاتا ہے۔ یہ تکنیک اصل میں 2003 میں ڈیوڈ سی شوارٹز اور اروند رامناتھن نے تجویز کی تھی۔ آپٹیکل سیکوینسنگ سائیکل آپٹیکل سیکوینسنگ کے عمل میں ہر سائیکل کا ایک جائزہ درج ذیل ہے۔ مرحلہ 1: ڈی این اے بارکوڈنگ خلیوں کو جینومک ڈی این اے جاری کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ یہ ڈی این اے مالیکیول غیر متزلزل ہوتے ہیں، مائیکرو فلوڈک چینلز پر مشتمل آپٹیکل میپنگ کی سطح پر رکھے جاتے ہیں اور ڈی این اے کو چینلز سے گزرنے دیا جاتا ہے۔ اس کے بعد ان مالیکیولز کو پابندی والے انزائموں کے ذریعے بارکوڈ کیا جاتا ہے تاکہ آپٹیکل میپنگ کی تکنیک کے ذریعے جینومک لوکلائزیشن کی اجازت دی جا سکے۔ ان مراحل کے لیے "ٹیکنالوجی" پر اوپر کا سیکشن دیکھیں۔ مرحلہ 2: ٹیمپلیٹ نکنگ ڈی این ایز I کو نصب ڈی این اے مالیکیولز کو تصادفی طور پر نک کرنے کے لیے شامل کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد ڈی این ایز I کو ہٹانے کے لیے دھویا جاتا ہے۔ فی ٹیمپلیٹ ہونے والی نکس کی اوسط تعداد ڈی این ایز I کے ارتکاز کے ساتھ ساتھ انکیوبیشن کے وقت پر بھی منحصر ہے۔ مرحلہ 3: گیپ فارمیشن T7 ایکسونکلیز کو شامل کیا جاتا ہے جو ڈی این اے مالیکیولز میں موجود نک کا استعمال کرتے ہوئے 5 '-3' کی سمت میں گیپس کو بڑھاتا ہے۔ ڈبل اسٹرینڈڈ بریکس کی حد سے زیادہ سطح سے بچنے کے لیے T7 ایکسونکیولیز کی مقدار کو احتیاط سے کنٹرول کیا جانا چاہیے۔ مرحلہ 4: فلورکروم انضمام ڈی این اے پولیمرس کا استعمال ہر ڈی این اے مالیکیول کے ساتھ متعدد گیپڈ سائٹس میں فلورکروم لیبلڈ نیوکلیوٹائڈز (ایف ڈی این ٹی پیز) کو شامل کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ ہر چکر کے دوران، رد عمل کا مرکب ایک ہی قسم کے ایف ڈی این ٹی پی پر مشتمل ہوتا ہے اور اس نیوکلیوٹائڈ قسم کے متعدد اضافے کی اجازت دیتا ہے۔ اس کے بعد امیجنگ اور ایف ڈی این ٹی پی کے اضافے کے اگلے دور کی تیاری میں غیر مربوط ایف ڈی این ٹی پیز کو ہٹانے کے لیے مختلف دھوئیں انجام دی جاتی ہیں۔ مرحلہ 5: امیجنگ یہ مرحلہ فلوروسینس مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے خلا کے علاقوں میں شامل فلورکروم لیبلڈ نیوکلیوٹائڈز کی تعداد کو شمار کرتا ہے۔ مرحلہ 6: فوٹو بلیچنگ لیزر کی روشنی جو فلورکروم کو متحرک کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے یہاں فلورکروم سگنل کو تباہ کرنے کے لیے بھی استعمال ہوتی ہے۔ یہ بنیادی طور پر فلورکروم کاؤنٹر کو ری سیٹ کرتا ہے، اور کاؤنٹر کو اگلے سائیکل کے لیے تیار کرتا ہے۔ یہ مرحلہ نظری ترتیب کا ایک منفرد پہلو ہے کیونکہ یہ اصل میں نیوکلیوٹائڈ کے فلورکروم لیبل کو اس کے شامل ہونے کے بعد نہیں ہٹاتا ہے۔ فلورکروم لیبل کو نہ ہٹانا ترتیب کو زیادہ کفایتی بناتا ہے، لیکن اس کے نتیجے میں فلورکروم لیبلز کو لگاتار شامل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے جس کے نتیجے میں لیبلز کی بڑی تعداد کی وجہ سے مسائل پیدا ہو سکتے ہیں۔ مرحلہ 7: مراحل کو دہرائیں 4-6 مراحل کو مرحلہ 4 کے ساتھ ایک رد عمل کے مرکب کا استعمال کرتے ہوئے دہرایا جاتا ہے جس میں ہر بار ایک مختلف فلورکروم لیبلڈ نیوکلیوٹائڈ (ایف ڈی این ٹی پی) ہوتا ہے۔ یہ اس وقت تک دہرایا جاتا ہے جب تک کہ مطلوبہ علاقے کی ترتیب نہ ہو جائے۔ اصلاح کی حکمت عملی ایک مناسب ڈی این اے پولیمرس کا انتخاب بنیادی اضافے کے مرحلے کی کارکردگی کے لیے اہم ہے اور اسے کئی معیارات پر پورا اترنا چاہیے: مسلسل پوزیشنوں پر ایف ڈی این ٹی پی کو مؤثر طریقے سے شامل کرنے کی صلاحیت 3 '-5' ایکسونیوکلیز کی کمی اور نئے شامل کردہ ایف ڈی این ٹی پی کو ہٹانے سے روکنے کے لیے پروف ریڈنگ سرگرمی کی کمی غلط انضمام کو کم کرنے کے لیے اعلی وفاداری ٹیمپلیٹس پر اچھی سرگرمی جو سطحوں پر نصب ہیں (جیسے۔ آپٹیکل میپنگ سرفیس) اس کے علاوہ، مختلف فلورکرومز کے لیے مختلف پولیمریز کی ترجیح، فلورکروم-نیوکلیوٹائڈز پر لنکر کی لمبائی، اور بفر کمپوزیشن بھی اہم عوامل ہیں جن پر بنیادی اضافے کے عمل کو بہتر بنانے اور مسلسل ایف ڈی این ٹی پی کے انضمام کی تعداد کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے غور کیا جانا چاہیے۔ فوائد سنگل مالیکیول تجزیہ چونکہ کم سے کم ڈی این اے نمونے کی ضرورت ہوتی ہے، نمونے کی تیاری کے عمل کو ہموار کرنے کے لیے وقت طلب اور مہنگے امپلیفکیشن مرحلے سے گریز کیا جاتا ہے۔ بڑے ڈی این اے مالیکیول ٹیمپلیٹس (~ 500 کے بی) بمقابلہ مختصر ڈی این اے مالیکیول ٹیمپلیٹس (<1 کے بی) اگرچہ اگلی نسل کی زیادہ تر سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کا مقصد بڑی مقدار میں چھوٹے سیکوینس ریڈز ہیں، لیکن یہ چھوٹے سیکوینس ریڈز ڈی نووو سیکوینسنگ کی کوششوں اور جینوم کے دہرائے جانے والے علاقوں کو سمجھنا مشکل بناتے ہیں۔ آپٹیکل سیکوینسنگ ترتیب کے لیے بڑے ڈی این اے مالیکیول ٹیمپلیٹس (~ 500 کے بی) کا استعمال کرتی ہے اور یہ چھوٹے ٹیمپلیٹس کے مقابلے میں کئی فوائد پیش کرتے ہیں: ان بڑے ڈی این اے ٹیمپلیٹس کو اعتماد کے ساتھ ان کی جینومک لوکلائزیشن کا تعین کرنے کے لیے "ڈی این اے بارکوڈڈ" کیا جا سکتا ہے۔ لہذا، کسی بھی ترتیب کو جو بڑے ٹیمپلیٹ سے لیا جاتا ہے اسے اعلی درجے کے اعتماد کے ساتھ جینوم پر نقشہ بنایا جا سکتا ہے۔ اس سے بھی اہم بات یہ ہے کہ زیادہ تکرار والے علاقوں سے سیکوینس ریڈز کو زیادہ اعتماد کے ساتھ رکھا جا سکتا ہے جبکہ مختصر ریڈز زیادہ تکرار والے علاقوں میں نقشہ سازی کی غیر یقینی صورتحال کا شکار ہوتے ہیں۔ خصوصی الگورتھم اور سافٹ ویئر جیسے آپٹیکل میپنگ اور نینو کوڈنگ کو حوالہ جینوم کے ساتھ سنگل مالیکیول بارکوڈز کو سیدھ میں لانے کے لیے تیار کیا گیا ہے۔ ایک سے زیادہ ترتیب ایک ہی بڑے ٹیمپلیٹ مالیکیول سے پڑھتی ہے۔ یہ متعدد سیکوینس ریڈز ڈی نووو اسمبلی کی پیچیدگی کو کم کرتے ہیں، جینومک دوبارہ ترتیب کے علاقوں کو غیر واضح کرتے ہیں، اور "کسی بھی اسمبلی کی غلطیوں سے اندرونی طور پر آزاد" ہوتے ہیں۔ سیکوینس کے حصول کے ساتھ بڑے ڈی این اے مالیکیولر ٹیمپلیٹس کی مالیکیولر بارکوڈنگ وسیع اور مخصوص جینومک تجزیے فراہم کرتی ہے۔ نقصانات سنگل مالیکیول ڈی این اے سیکوینسنگ کو موجودہ اگلی نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے ذریعہ فراہم کردہ بے کار ریڈ کوریج سے اعتماد سے ملنے کے لیے اعلی سطح کی درستگی کی ضرورت ہوتی ہے۔ دونوں تاروں پر ایک جیسی پوزیشنوں پر نکلتا ہے جس کے نتیجے میں ترتیب بہ ترکیب کے دوران ٹیمپلیٹ کم ہوتا ہے۔ فلورکروم لیبل والے نیوکلیوٹائڈز کو شامل کرنے کے بعد نہیں ہٹایا جاتا ہے اور ان بڑے لیبلز کی وجہ سے، متعدد شامل کرنا مشکل ہو سکتا ہے۔ حوالہ جات بیرونی روابط اوپ جین آپٹیکل میپنگ سولیوشنز ڈاکٹر ڈیوڈ سی شوارٹز لیب بائیو فزکس جینومکس تکنیک خوردبین سالماتی حیاتیات