Polony sequencing
پولونی سیکوینسنگ ایک سستی لیکن انتہائی درست ملٹی پلیکس سیکوینسنگ تکنیک ہے جسے متوازی طور پر لاکھوں غیر متحرک ڈی این اے سیکوینس کو "پڑھنے" کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ تکنیک سب سے پہلے ہارورڈ میڈیکل اسکول میں ڈاکٹر جارج چرچ کے گروپ نے تیار کی تھی۔ ترتیب کی دیگر تکنیکوں کے برعکس، پولونی ترتیب کی ٹیکنالوجی آزادانہ طور پر ڈاؤن لوڈ کرنے کے قابل، اوپن سورس سافٹ ویئر اور پروٹوکول کے ساتھ ایک کھلا پلیٹ فارم ہے۔ اس کے علاوہ، اس تکنیک کے ہارڈ ویئر کو عام طور پر دستیاب ایپی فلوریسنس مائکروسکوپی اور کمپیوٹر کے زیر کنٹرول فلو سیل/فلوڈکس سسٹم کے ساتھ آسانی سے ترتیب دیا جا سکتا ہے۔ پولونی سیکوینسنگ عام طور پر پیئرڈ اینڈ ٹیگز لائبریری پر کی جاتی ہے کہ ڈی این اے ٹیمپلیٹ کا ہر مالیکیول لمبائی میں 135 بی پی کا ہوتا ہے جس میں دو 17-18 بی پی پیئرڈ جینومک ٹیگز الگ ہوتے ہیں اور عام سیکوینس کے ساتھ ہوتے ہیں۔ اس تکنیک کی موجودہ پڑھنے کی لمبائی 26 بیس فی ایمپلیکن اور 13 بیس فی ٹیگ ہے، جس سے ہر ٹیگ میں 4 سے 5 بیس کا فرق رہ جاتا ہے۔ ورک فلو پولونی سیکوینسنگ کے پروٹوکول کو تین اہم حصوں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے، جو جوڑی بند اینڈ ٹیگ لائبریری کی تعمیر، ٹیمپلیٹ ایمپلیفیکیشن اور ڈی این اے سیکوینسنگ ہیں۔ پیئرڈ اینڈ ٹیگ لائبریری کی تعمیر یہ پروٹوکول بے ترتیب طور پر تجربہ شدہ جینومک ڈی این اے کو تنگ سائز کی تقسیم میں کاٹنے سے شروع ہوتا ہے۔ اس کے بعد کٹے ہوئے ڈی این اے مالیکیولز کو آخری مرمت اور اے-دم کے علاج کے لیے زیر کیا جاتا ہے۔ اختتامی مرمت کا علاج ڈی این اے کے کسی بھی خراب یا مطابقت نہ رکھنے والے سرے کو 5 '-فاسفوریلیٹڈ اور بلٹ اینڈ ڈی این اے میں تبدیل کر دیتا ہے، جس سے فوری طور پر بلٹ اینڈ لائیگیشن ممکن ہو جاتا ہے، جبکہ اے-ٹیلنگ کا علاج کٹے ہوئے ڈی این اے کے 3' سرے میں اے کا اضافہ کرتا ہے۔ 1 کے بی کی لمبائی والے ڈی این اے مالیکیولز کو 6 فیصد ٹی بی ای پیج جیل پر لوڈ کرکے منتخب کیا جاتا ہے۔ اگلے مرحلے میں، ڈی این اے مالیکیولز کو ٹی-ٹیلڈ 30 بی پی لمبے مصنوعی اولیگونیوکلیوٹائڈز (ٹی 30) کے ساتھ سرکلرائز کیا جاتا ہے، جس میں دو بیرونی رخ والے ایم ایم ای آئی شناخت کے مقامات ہوتے ہیں، اور اس کے نتیجے میں سرکلرائزڈ ڈی این اے رولنگ سرکل ریپلیکیشن سے گزرتا ہے۔ ایمپلیفائیڈ سرکلرائزڈ ڈی این اے مالیکیولز کو پھر ایم ایم ای آئی (ٹائپ II کی پابندی اینڈو نیوکلیز) کے ساتھ ہضم کیا جاتا ہے جو اس کی شناخت کی جگہ سے فاصلے پر کٹ جائے گا، اور T30 ٹکڑے کو 17-18 bp ٹیگز (≈ 70 bp لمبائی) کے ساتھ جاری کرے گا۔ پیئرڈ-ٹیگ مالیکیولز کو ان کے دونوں سروں پر ای پی سی آر (ایملشن پی سی آر) پرائمر اولیگونیوکلیوٹائڈز (ایف ڈی وی 2 اور آر ڈی وی 2) کے لائیگیشن سے پہلے آخر میں مرمت کرنے کی ضرورت ہے۔ نتیجے میں آنے والے 135 بی پی لائبریری مالیکیولز کو سائز کے لحاظ سے منتخب کیا جاتا ہے اور نک کا ترجمہ کیا جاتا ہے۔ آخر میں، لائبریری کے مواد کی مقدار کو بڑھانے اور ایک ہی مرحلے میں غیر معمولی لائیگیشن مصنوعات کو ختم کرنے کے لیے پی سی آر کے ساتھ 135 بی پی جوڑے والے اینڈ ٹیگ لائبریری مالیکیولز کو بڑھائیں۔ نتیجے میں ڈی این اے ٹیمپلیٹ 44 بی پی ایف ڈی وی ترتیب، ایک 17-18 بی پی پراکسیمل ٹیگ، ٹی 30 ترتیب، ایک 17-18 بی پی ڈسٹل ٹیگ، اور 25 بی پی آر ڈی وی ترتیب پر مشتمل ہوتا ہے۔ ٹیمپلیٹ امپلیفکیشن ایملشن پی سی آر مونو سائز، پیرامیگنیٹک اسٹریپٹا ویڈن لیپت موتیوں کو ڈوئل بائیوٹن فارورڈ پرائمر کے ساتھ پہلے سے لوڈ کیا جاتا ہے۔ سٹریپٹا ویڈن کا بائیوٹن کے لیے بہت مضبوط تعلق ہے، اس طرح اگلا پرائمر موتیوں کی سطح پر مضبوطی سے جڑا رہے گا۔ اگلا، پہلے سے بھری ہوئی موتیوں، پی سی آر مکسچر، فارورڈ اور ریورس پرائمرز، اور پیئرڈ اینڈ ٹیگ لائبریری کے ساتھ ایک آبی مرحلہ تیار کیا جاتا ہے۔ ایملشن بنانے کے لیے اسے ملایا جاتا ہے اور تیل کے مرحلے کے ساتھ بھنور لگایا جاتا ہے۔ مثالی طور پر، تیل کے ایملشن میں پانی کی ہر بوند میں ایک مالا اور ٹیمپلیٹ ڈی این اے کا ایک مالیکیول ہوتا ہے، جو پی سی آر انجام دے کر ملی لیٹر پیمانے کے حجم کے اندر لاکھوں غیر تعامل کی توسیع کی اجازت دیتا ہے۔ ایملشن توڑنے کے بعد، پچھلے مرحلے سے ایملشن کو آئسوپروپینول اور ڈٹرجنٹ بفر (10 ایم ایم ٹرس پی ایچ 7.5، 1 ایم ایم ای ڈی ٹی اے پی ایچ 8.0، 100 ایم ایم این اے سی ایل، 1 فیصد (وی/وی) ٹریٹن ایکس-100، 1 فیصد (ڈبلیو/وی) ایس ڈی ایس) کا استعمال کرتے ہوئے توڑا جاتا ہے، جس کے بعد وورٹیکسنگ، سینٹری فیوجنگ اور مقناطیسی علیحدگی کا ایک سلسلہ ہوتا ہے۔ نتیجے میں حل خالی، کلونل اور غیر کلونل موتیوں کی معطلی ہے، جو ایملشن بوندوں سے پیدا ہوتے ہیں جن میں ابتدائی طور پر بالترتیب صفر، ایک یا متعدد ڈی این اے ٹیمپلیٹ مالیکیول ہوتے ہیں۔ بڑھے ہوئے مالا کو اگلے مرحلے میں افزودہ کیا جا سکتا ہے۔ مالا کی افزودگی امپلیفائیڈ موتیوں کی افزودگی ہائبرڈائزیشن کے ذریعے ایک بڑے، کم کثافت، غیر مقناطیسی پولی سٹیرائن موتیوں میں حاصل کی جاتی ہے جو بائیوٹینیلیٹڈ کیپچر اولیگونیوکلیوٹائڈز (ڈی این اے ترتیب جو ای پی سی آر ایمپلیکن ترتیب کی تکمیل کرتی ہے) سے پہلے سے بھری ہوتی ہے۔ اس کے بعد مرکب کو سینٹرفیوج کیا جاتا ہے تاکہ امپلیفائیڈ اور کیپچر موتیوں کے کمپلیکس کو غیر امپلیفائیڈ موتیوں سے الگ کیا جا سکے۔ امپلیفائیڈ، کیپچر بیڈ کمپلیکس کی کثافت کم ہوتی ہے اور اس طرح سپر نیٹنٹ میں رہے گی جبکہ غیر امپلیفائیڈ موتیوں سے گولی بنتی ہے۔ سپر نیٹنٹ کو بازیافت کیا جاتا ہے اور NaOH کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے جو کمپلیکس کو توڑ دے گا۔ پیرا میگنیٹک ایمپلیفائیڈ موتیوں کو مقناطیسی علیحدگی کے ذریعے غیر مقناطیسی کیپچر موتیوں سے الگ کیا جاتا ہے۔ افزودگی کا یہ پروٹوکول پانچ گنا بڑھے ہوئے موتیوں کو افزودہ کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ مالا کیپنگ مالا کیپنگ کا مقصد غیر توسیع شدہ فارورڈ ای پی سی آر پرائمرز اور ٹیمپلیٹ ڈی این اے کے آر ڈی وی حصے دونوں کے 3 'سرے پر "کیپنگ" اولیگونیوکلیوٹائڈ لگانا ہے۔ جو ٹوپی استعمال کی جا رہی ہے وہ ایک امینو گروپ ہے جو فلوروسینٹ تحقیقات کو ان سروں پر اور ایک ہی وقت میں منسلک ہونے سے روکتا ہے، جس سے ٹیمپلیٹ ڈی این اے کو امینوسیلینیٹڈ فلو سیل کور سلپ میں جوڑنے میں مدد ملتی ہے۔ کور سلپ کی صف بندی سب سے پہلے، کور سلپس کو دھویا جاتا ہے اور امینوسیلین کا علاج کیا جاتا ہے، جس سے اس پر ٹیمپلیٹ ڈی این اے کے بعد کے کوولینٹ جوڑے کو فعال کیا جاتا ہے اور کسی بھی فلوروسینٹ آلودگی کو ختم کیا جاتا ہے۔ بڑھے ہوئے، افزودہ موتیوں کو ایکریلامائڈ کے ساتھ ملایا جاتا ہے اور ٹیفلون ماسک مائکروسکوپ سلائیڈ کے ذریعے بنائے گئے اتلی مولڈ میں ڈالا جاتا ہے۔ فوری طور پر، امینوسیلین سے علاج شدہ کور سلپ کو ایکریلامائڈ جیل کے اوپر رکھیں اور 45 منٹ کے لیے پولیمرائز ہونے دیں۔ اگلا، سلائیڈ/کور سلپ اسٹیک کو الٹ دیں اور جیل سے خوردبین سلائیڈ کو ہٹا دیں۔ سائلن سے علاج شدہ کور سلپس جیل سے ہم آہنگی سے جڑیں گے جبکہ خوردبین سلائیڈ کی سطح پر موجود ٹیفلون ایکریلامائیڈ جیل سے سلائیڈ کو بہتر طریقے سے ہٹانے کے قابل بنائے گا۔ کور سلپس پھر فلو سیل باڈی سے جڑے ہوتے ہیں اور کسی بھی غیر منسلک موتیوں کو ہٹا دیا جاتا ہے۔ ڈی این اے سیکوینسنگ پولونی سیکوینسنگ کی بائیو کیمسٹری بنیادی طور پر لگازس اور پولیمریز کی امتیازی صلاحیتوں پر منحصر ہے۔ سب سے پہلے، اینکر پرائمرز کا ایک سلسلہ خلیوں کے ذریعے بہتا ہے اور 17-18 bp پراکسیمل یا ڈسٹل جینومک ڈی این اے ٹیگز کے فوری 3 'یا 5' سرے پر مصنوعی اولیگونیوکلیوٹائڈ کے سلسلے میں ہائبرڈائز ہوتا ہے۔ اگلا، ڈیجینریٹ نانمرز کی آبادی کے لیے اینکر پرائمر کا ایک انزیمیٹک لائیگیشن رد عمل انجام دیا جاتا ہے جن پر فلوروسینٹ رنگوں کا لیبل لگایا جاتا ہے۔ مختلف لیبل والے نان ایمرس: 5 'Cy5-NNNNNNT 5' Cy3-NNNNNNNA 5 'ٹیکساس ریڈ-NNNNNNC 5' 6FAM-NNNNNNG فلورفور ٹیگ شدہ نان ایمرس ڈیجینریٹ پرائمرز جیسی حکمت عملی کے مطابق ٹیگ کے سلسلے میں تفریق کامیابی کے ساتھ اینیل ہوتے ہیں، لیکن پولی میریزز کو جمع کرنے کے بجائے، نان ایمرس کو منتخب طور پر ملحقہ ڈی این اے-اینکر پرائمر پر لگا دیا جاتا ہے۔ فلوروفور مالیکیول کا فکسشن ایک فلوروسینٹ سگنل فراہم کرتا ہے جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ جینومک ڈی این اے ٹیگ پر استفسار کی پوزیشن پر اے، سی، جی، یا ٹی موجود ہے یا نہیں۔ چار رنگوں کی امیجنگ کے بعد، اینکر پرائمر/نان امیر کمپلیکس کو ہٹا دیا جاتا ہے اور اینکر پرائمر کو تبدیل کرکے ایک نیا سلسلہ شروع کیا جاتا ہے۔ فلوروسینٹ ٹیگ کیے گئے نان ایمروں کا ایک نیا مرکب متعارف کرایا گیا ہے، جس کے لیے استفسار کی پوزیشن کو جینومک ڈی این اے ٹیگ میں مزید ایک بیس منتقل کیا جاتا ہے۔ 5 'سائ 5-این این این این این این ٹی این 5' سائ 3-این این این این این این این این 5 'ٹیکساس ریڈ-این این این این این این این این این 5' 6 ایف اے ایم-این این این این این این این این این 5 'سے 3' سمت کے سات اڈوں اور 3 'سرے سے چھ اڈوں سے اس انداز میں پوچھ گچھ کی جا سکتی ہے۔ حتمی نتیجہ ہر ٹیگ کے وسط میں 4 بیس سے 5 بیس کے فرق کے ساتھ فی رن 26 بیسز (جوڑے والے ٹیگز میں سے ہر ایک سے 13 بیسز) کی پڑھنے کی لمبائی ہے۔ تجزیہ اور سافٹ ویئر پولونی سیکوینسنگ فی رن لاکھوں 26 ریڈز پیدا کرتی ہے اور اس معلومات کو معمول پر لانے اور ترتیب میں تبدیل کرنے کی ضرورت ہے۔ یہ کام چرچ لیب کے تیار کردہ سافٹ ویئر کے ذریعے کیا جا سکتا ہے۔ تمام سافٹ ویئر مفت ہیں اور ویب سائٹ سے ڈاؤن لوڈ کیے جا سکتے ہیں۔ آلات اس تکنیک میں استعمال ہونے والے ترتیب کے آلے کو عام طور پر دستیاب فلوروسینس خوردبین اور کمپیوٹر کے زیر کنٹرول فلو سیل کے ذریعے ترتیب دیا جا سکتا ہے۔ 2005 میں مطلوبہ آلات کی قیمت تقریبا 130,000 امریکی ڈالر تھی۔ ایک وقف شدہ پولونی سیکوینسنگ مشین، پولونیٹر، 2009 میں تیار کی گئی تھی اور ڈوور نے اسے 170,000 امریکی ڈالر میں فروخت کیا تھا۔ اس میں اوپن سورس سافٹ ویئر، ریجینٹ اور پروٹوکول شامل تھے اور اس کا مقصد پرسنل جینوم پروجیکٹ میں استعمال کرنا تھا۔ طاقت اور کمزوری پولونی سیکوینسنگ عام طور پر دستیاب، سستے آلے کی بنیاد پر ڈی این اے سیکوینسنگ کی اعلی تھرو پٹ اور اعلی اتفاق رائے کی درستگی کی اجازت دیتی ہے۔ نیز، یہ ایک بہت ہی لچکدار تکنیک ہے جو بی اے سی (بیکٹیریل مصنوعی کروموسوم) اور بیکٹیریل جینوم ریکوینسنگ کے ساتھ ساتھ ایس اے جی ای (جین کے اظہار کا سیریل تجزیہ) ٹیگ اور بارکوڈ سیکوینسنگ سمیت متغیر استعمال کو قابل بناتی ہے۔ مزید برآں، پولونی سیکوینسنگ تکنیک پر ایک کھلے نظام کے طور پر زور دیا جاتا ہے جو تیار کردہ سافٹ ویئر، پروٹوکول اور ریجینٹس سمیت ہر چیز کا اشتراک کرتا ہے۔ تاہم، اگرچہ خام ڈیٹا کا حصول 786 گیگا بائٹس تک حاصل کیا جا سکتا ہے لیکن جمع کردہ 10,000 بٹس میں سے صرف 1 بٹ معلومات مفید ہے۔ اس تکنیک کا ایک اور چیلنج انفرادی اہداف کی نسبتا وسعت کی یکسانیت ہے۔ غیر یکساں اضافہ ترتیب کی کارکردگی کو کم کر سکتا ہے اور اس تکنیک میں سب سے بڑی رکاوٹ کے طور پر پیش کیا جا سکتا ہے۔ ہسٹری پولونی سیکوینسنگ 1990 اور 2000 کی دہائی کے آخر سے پولونی ٹیکنالوجی کی ترقی ہے۔ سنگل بیس ایکسٹینشن کا استعمال کرتے ہوئے سیٹو پولونیوں میں ترتیب دینے کے لیے 2003 میں طریقے تیار کیے گئے تھے جو 5 سے 6 بیس ریڈز حاصل کر سکتے تھے۔ 2005 تک، موجودہ پولونی سیکوینسنگ ٹیکنالوجی کو تیار کرنے کے لیے ان ابتدائی کوششوں پر نظر ثانی کی گئی تھی۔ پولونی سیکوینسنگ کے انتہائی متوازی سیکوینسنگ بہ لائیگیشن تصورات نے بعد میں سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز جیسے اے بی آئی سالڈ سیکوینسنگ کی بنیاد رکھی ہے۔ حوالہ جات بیرونی روابط ڈی این اے ترتیب کے طریقے جینیاتی تکنیک