Fluorescence-lifetime imaging microscopy
فلوروسینس-لائف ٹائم امیجنگ مائکروسکوپی یا ایف ایل آئی ایم ایک امیجنگ تکنیک ہے جو نمونے سے فلوروفور کے فوٹون کے اخراج کی تیز رفتار انحطاط کی شرح میں فرق پر مبنی ہے۔ اسے کنفوکل مائکروسکوپی، ٹو فوٹن ایکسائٹیشن مائکروسکوپی، اور ملٹی فوٹن ٹومگرافی میں امیجنگ تکنیک کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ فلورفور کی فلوروسینس لائف ٹائم (ایف ایل ٹی)، اس کی شدت کے بجائے، ایف ایل آئی ایم میں تصویر بنانے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ فلوروسینس کی زندگی کا انحصار فلوروفور کے مقامی مائیکرو ماحول پر ہوتا ہے، اس طرح روشنی کے منبع کی چمک میں تبدیلی، پس منظر کی روشنی کی شدت یا محدود فوٹو بلیچنگ کی وجہ سے فلوروسینس کی شدت میں کسی بھی غلط پیمائش کو روکتا ہے۔ اس تکنیک میں نمونے کی موٹی تہوں میں فوٹون بکھرنے کے اثر کو کم سے کم کرنے کا فائدہ بھی ہے۔ مائیکرو ماحولیات پر منحصر ہونے کی وجہ سے، زندگی کی پیمائش کو پی ایچ، چپچپا اور کیمیائی پرجاتیوں کے ارتکاز کے اشارے کے طور پر استعمال کیا گیا ہے۔ فلوروسینس لائف ٹائمز ایک فلوروفور جو فوٹون کے ذریعے پرجوش ہوتا ہے، کئی مختلف (تابکاری اور/یا غیر تابکاری) انحطاط کے راستوں کے ذریعے انحطاط کی شرحوں کی بنیاد پر ایک خاص امکان کے ساتھ زمینی حالت میں گر جائے گا۔ فلوروسینس کا مشاہدہ کرنے کے لیے، ان راستوں میں سے ایک فوٹون کے بے ساختہ اخراج سے ہونا چاہیے۔ اینسمبل کی تفصیل میں، خارج ہونے والا فلوروسینس وقت کے ساتھ ساتھ کہاں کے مطابق ختم ہو جائے گا۔ مذکورہ بالا میں، وقت ہے، فلوروسینس کی زندگی ہے، ابتدائی فلوروسینس ہے، اور ہر انحطاط کے راستے کی شرح ہے، جن میں سے کم از کم ایک فلوروسینس کے انحطاط کی شرح ہونی چاہیے۔ اس سے بھی اہم بات یہ ہے کہ زندگی، ابتدائی شدت اور خارج ہونے والی روشنی سے آزاد ہے۔ اس کا استعمال کیمیائی سینسنگ میں غیر شدت پر مبنی پیمائش کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ پیمائش فلوروسینس-لائف ٹائم امیجنگ سے ہر پکسل کی شدت کے ساتھ تصاویر حاصل ہوتی ہیں، جو کسی کو مختلف فلوروسینس ڈیک کی شرحوں والے مواد کے درمیان تضاد دیکھنے کی اجازت دیتی ہے (چاہے وہ مواد بالکل ایک ہی طول موج پر فلوروسینس کریں)، اور ایسی تصاویر بھی تیار کرتی ہیں جو دیگر ڈیک کے راستوں میں تبدیلیاں ظاہر کرتی ہیں، جیسے کہ ایف آر ای ٹی امیجنگ میں۔ پلسڈ ایلیومینیشن فلوروسینس لائف ٹائم کا تعین ٹائم ڈومین میں پلسڈ سورس کا استعمال کرکے کیا جا سکتا ہے۔ جب فلوروفورز کی آبادی روشنی کی الٹرا شارٹ یا ڈیلٹا پلس سے پرجوش ہوتی ہے، تو وقت سے حل شدہ فلوروسینس تیزی سے ختم ہو جائے گا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ تاہم، اگر محرک نبض یا پتہ لگانے کا ردعمل وسیع ہے، تو ماپا ہوا فلوروسینس، d (t)، خالصتا ایکسپونینشل نہیں ہوگا۔ آلہ رسپانس فنکشن، آئی آر ایف (ٹی) کو ڈیک فنکشن، ایف (ٹی) کے ساتھ مربوط یا ملایا جائے گا۔ ماخذ، ڈٹیکٹر، اور الیکٹرانکس کے ساز رسپانس کو ماپا جا سکتا ہے، عام طور پر بکھرے ہوئے ایکسائٹیشن لائٹ سے۔ ڈیک فنکشن (اور متعلقہ لائف ٹائمز) کی بازیابی اضافی چیلنجز کا باعث بنتی ہے کیونکہ فریکوئنسی ڈومین میں تقسیم اس وقت زیادہ شور پیدا کرتی ہے جب ڈینومینیٹر صفر کے قریب ہوتا ہے۔ ٹی سی ایس پی سی ٹائم سے متعلق سنگل فوٹون کاؤنٹنگ (ٹی سی ایس پی سی) عام طور پر استعمال کیا جاتا ہے کیونکہ یہ ماخذ کی شدت اور سنگل فوٹون پلس طول و عرض میں تغیرات کی تلافی کرتا ہے۔ تجارتی ٹی سی ایس پی سی آلات کا استعمال کرتے ہوئے ایک فلوروسینس ڈیک وکر کو 405 ایف ایس تک ٹائم ریزولوشن کے ساتھ ریکارڈ کیا جا سکتا ہے۔ ریکارڈ شدہ فلوروسینس ڈیک ہسٹوگرام پوسن کے اعداد و شمار کی پابندی کرتا ہے جو فٹ ہونے کے دوران فٹ ہونے کی اچھائی کا تعین کرنے میں سمجھا جاتا ہے۔ مزید خاص طور پر، ٹی سی ایس پی سی ان اوقات کو ریکارڈ کرتا ہے جن میں انفرادی فوٹون کا پتہ تیز رفتار سنگل فوٹون ڈٹیکٹر (عام طور پر فوٹو ملٹی پلیئر ٹیوب (پی ایم ٹی) یا سنگل فوٹون ایولانچ فوٹو ڈایڈڈ (ایس پی اے ڈی)) کے ذریعے ایکسائٹیشن لیزر پلس کے حوالے سے لگایا جاتا ہے۔ ریکارڈنگ کو متعدد لیزر دالوں کے لیے دہرایا جاتا ہے اور کافی ریکارڈ شدہ واقعات کے بعد، کوئی بھی ان تمام ریکارڈ شدہ ٹائم پوائنٹس پر واقعات کی تعداد کا ہسٹوگرام بنانے کے قابل ہوتا ہے۔ اس کے بعد یہ ہسٹوگرام ایک ایکسپونینشیل فنکشن کے لیے فٹ ہو سکتا ہے جس میں دلچسپی کی ایکسپونینشیل لائف ٹائم ڈیک فنکشن ہوتی ہے، اور اس کے مطابق لائف ٹائم پیرامیٹر نکالا جا سکتا ہے۔ 16 سے 64 عناصر کے ساتھ ملٹی چینل پی ایم ٹی سسٹم تجارتی طور پر دستیاب ہیں، جبکہ حال ہی میں مظاہرہ کردہ سی ایم او ایس سنگل فوٹون ایولانچ ڈایڈڈ (ایس پی اے ڈی)-ٹی سی ایس پی سی ایف ایل آئی ایم سسٹم پتہ لگانے والے چینلز کی زیادہ تعداد اور اضافی کم لاگت کے اختیارات پیش کر سکتے ہیں۔ گیٹنگ طریقہ پلس ایکسائٹیشن اب بھی اس طریقہ میں استعمال ہوتا ہے۔ پلس کے نمونے تک پہنچنے سے پہلے، کچھ روشنی ڈائکروک آئینے سے جھلکتی ہے اور فوٹوڈیوڈ کے ذریعے پتہ چل جاتا ہے جو سی سی ڈی ڈٹیکٹر کے سامنے بیٹھے گیٹیڈ آپٹیکل انٹیسیفایر (جی او آئی) کو کنٹرول کرنے والے تاخیر جنریٹر کو چالو کرتا ہے۔ جی او آئی صرف اس وقت کے حصے کا پتہ لگانے کی اجازت دیتا ہے جب یہ تاخیر کے بعد کھلا ہو۔ اس طرح، ایک سایڈست تاخیر جنریٹر کے ساتھ، نمونے کے فلوروسینس ڈیک کی ٹائم رینج کو گھیرے ہوئے متعدد تاخیر اوقات کے بعد فلوروسینس کا اخراج جمع کرنے کے قابل ہوتا ہے۔ حالیہ برسوں میں مربوط تیز سی سی ڈی کیمرے بازار میں داخل ہوئے۔ یہ کیمرے ایک امیج انٹینسیفائر، سی سی ڈی سینسر اور ایک مربوط تاخیر جنریٹر پر مشتمل ہوتے ہیں۔ آئی سی سی ڈی کیمرے 200 پی ایس تک کے مختصر ترین گیٹنگ ٹائم اور 10 پی ایس کے تاخیر کے اقدامات کے ساتھ ذیلی نینو سیکنڈ ریزولوشن ایف ایل آئی ایم کی اجازت دیتے ہیں۔ اینڈوسکوپ کے ساتھ مل کر یہ تکنیک دماغی ٹیومر کی انٹراآپریٹو تشخیص کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ فیز ماڈیولیشن فلوریسنس لائف ٹائمز کا تعین فریکوئنسی ڈومین میں فیز ماڈیولیشن طریقہ سے کیا جا سکتا ہے۔ یہ طریقہ ایک ایسے روشنی کے منبع کا استعمال کرتا ہے جسے تیز تعدد (500 میگاہرٹز تک) پر پلس یا ماڈیول کیا جاتا ہے جیسے کہ ایل ای ڈی، ڈایڈڈ لیزر یا الیکٹرو آپٹک ماڈیولٹر یا ایکوسٹو آپٹک ماڈیولٹر کے ساتھ مل کر ایک مسلسل لہر کا منبع۔ فلوروسینس ہے (a.) ڈیموڈولیٹڈ اور (ب۔) مرحلہ منتقل ؛ دونوں مقداروں کا تعلق فلوروفور کی خصوصیت کے گرنے کے اوقات سے ہے۔ نیز، محرک اور فلوروسینس سائن لہروں کے Y-اجزاء کو ماڈیول کیا جائے گا، اور ان Y-اجزاء کے ماڈیول تناسب سے زندگی کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ لہذا، فیز ماڈیولیشن طریقہ سے زندگی بھر کے لیے 2 اقدار کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ زندگی کا تعین ان تجرباتی پیرامیٹرز کے فٹنگ طریقہ کار کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ پی ایم ٹی پر مبنی یا کیمرے پر مبنی فریکوئنسی ڈومین ایف ایل آئی ایم کا ایک فائدہ اس کا تیز لائف ٹائم امیج حصول ہے جو اسے لائیو سیل ریسرچ جیسی ایپلی کیشنز کے لیے موزوں بناتا ہے۔ تجزیہ تجزیاتی الگورتھم کا مقصد پیمائش شدہ انحطاط سے خالص انحطاط کے منحنی خطوط کو نکالنا اور زندگی کا تخمینہ لگانا ہے۔ مؤخر الذکر عام طور پر سنگل یا ملٹی ایکسپونینشل افعال کو فٹ کرکے پورا کیا جاتا ہے۔ اس مسئلے کو حل کرنے کے لیے مختلف طریقے تیار کیے گئے ہیں۔ سب سے زیادہ وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والی تکنیک سب سے کم مربع تکراری دوبارہ ارتقاء ہے جو بقایا جات کے وزن کے مجموعے کو کم سے کم کرنے پر مبنی ہے۔ اس تکنیک میں نظریاتی ایکسپونینشل ڈیک منحنی خطوط کو آلے کے رسپانس فنکشن کے ساتھ جوڑ دیا جاتا ہے، جسے الگ سے ماپا جاتا ہے، اور بہترین فٹ مختلف ان پٹ کے لیے بقایا جات کے تکراری حساب سے پایا جاتا ہے جب تک کہ کم سے کم نہ مل جائے۔ وقت بن i میں فلوروسینس سگنل کے مشاہدات کے ایک سیٹ کے لیے، زندگی کا تخمینہ کم سے کم کرکے کیا جاتا ہے: تجرباتی مشکلات کے علاوہ، بشمول طول موج پر منحصر آلہ رسپانس فنکشن، تکراری ڈی ارتقاء کے مسئلے کا ریاضیاتی علاج سیدھا آگے نہیں ہے اور یہ ایک سست عمل ہے جس نے FLIM کے ابتدائی دنوں میں پکسل بہ پکسل تجزیہ کے لیے اسے ناقابل عمل بنا دیا تھا۔ غیر فٹنگ طریقے پرکشش ہوتے ہیں کیونکہ وہ زندگی بھر کے تخمینے کا بہت تیز حل پیش کرتے ہیں۔ اس زمرے کی بڑی اور سیدھی سیدھی تکنیکوں میں سے ایک ریپڈ لائف ٹائم ڈیٹرمینشن (آر ایل ڈی) طریقہ ہے۔ آر ایل ڈی انحطاط کے منحنی خطوط کو مساوی چوڑائی t کے دو حصوں میں تقسیم کرکے براہ راست عمر اور ان کے طول و عرض کا حساب لگاتا ہے۔ تجزیہ انحطاط کے منحنی خطوط کو مساوی وقت کے وقفوں t میں ضم کرکے کیا جاتا ہے: آئی آئی آئی-th چینل میں ریکارڈ شدہ سگنل ہے اور کے چینلز کی تعداد ہے۔ زندگی کا تخمینہ اس کا استعمال کرتے ہوئے لگایا جا سکتا ہے: ملٹی ایکسپونینشل ڈیکوں کے لیے یہ مساوات اوسط زندگی فراہم کرتی ہے۔ اس طریقہ کار کو دو جہتی انحطاط کا تجزیہ کرنے کے لیے بڑھایا جا سکتا ہے۔ اس طریقہ کار کی ایک بڑی خرابی یہ ہے کہ یہ آلہ کے ردعمل کے اثر کو مدنظر نہیں رکھ سکتا اور اس وجہ سے تجزیہ میں ناپی گئی انحطاط منحنی خطوط کے ابتدائی حصے کو نظر انداز کیا جانا چاہیے۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ سگنل کا کچھ حصہ ضائع ہو جاتا ہے اور مختصر عمر کا اندازہ لگانے کی درستگی کم ہو جاتی ہے۔ کنولیوشن تھیوریم کی دلچسپ خصوصیات میں سے ایک یہ ہے کہ کنولیوشن کا انٹیگرل ان عوامل کا پروڈکٹ ہے جو انٹیگرل بناتے ہیں۔ کچھ ایسی تکنیکیں ہیں جو تبدیل شدہ جگہ میں کام کرتی ہیں جو پیمائش شدہ منحنی خطوط سے خالص سڑنے والے منحنی خطوط کو بازیافت کرنے کے لیے اس خاصیت کا استحصال کرتی ہیں۔ لیپلیس اور فورئیر ٹرانسفارمیشن کے ساتھ ساتھ لیگیورے گاؤس کی توسیع کو تبدیل شدہ خلا میں زندگی کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ یہ نقطہ نظر ڈیکونولوشن پر مبنی طریقوں سے زیادہ تیز ہیں لیکن وہ کٹوتی اور نمونے لینے کے مسائل کا شکار ہیں۔ مزید برآں، Laguerre gaus توسیع جیسے طریقوں کا اطلاق ریاضیاتی طور پر پیچیدہ ہے۔ فورئیر طریقوں میں ایک واحد ایکسپونینشل ڈیک وکر کی عمر اس طرح دی جاتی ہے: جہاں: اور n ہارمونک نمبر ہے اور T پتہ لگانے کی کل وقت کی حد ہے۔ ایپلی کیشنز FLIM بنیادی طور پر حیاتیات میں خلیوں اور ٹیومر میں فوٹوسنٹائزرز کے ساتھ ساتھ ایسی صورتوں میں FRET کا پتہ لگانے کے طریقہ کار کے طور پر استعمال کیا گیا ہے جہاں ریٹومیٹرک امیجنگ مشکل ہے۔ یہ تکنیک 1980 کی دہائی کے آخر اور 1990 کی دہائی کے اوائل میں تیار کی گئی تھی (گیٹنگ کا طریقہ: Bugiel et al. 1989 میں۔ کونگ 1989, فیز ماڈیولیشن: Lakowicz at al. 1992،) 1990 کی دہائی کے آخر میں زیادہ وسیع پیمانے پر لاگو ہونے سے پہلے۔ سیل کلچر میں، اس کا استعمال ای جی ایف رسیپٹر سگنلنگ اور اسمگلنگ کا مطالعہ کرنے کے لیے کیا گیا ہے۔ ٹائم ڈومین ایف ایل آئی ایم (ٹی ڈی ایف ایل آئی ایم) کو جوہری لفافے پر الگ الگ ہومو پولیمرز میں دونوں قسم کے نیوکلیئر انٹرمیڈیٹ فلامینٹ پروٹینز لیمینز اے اور بی 1 کے تعامل کو ظاہر کرنے کے لیے بھی استعمال کیا گیا ہے، جو اعلی ترتیب کے ڈھانچوں میں ایک دوسرے کے ساتھ مزید تعامل کرتے ہیں۔ ایف ایل آئی ایم امیجنگ خاص طور پر نیوران میں مفید ہے، جہاں دماغ کے بافتوں کے ذریعے روشنی کا بکھرنا ریٹومیٹرک امیجنگ کے لیے پریشانی کا باعث ہے۔ نیوران میں، پلسڈ ایلیومینیشن کا استعمال کرتے ہوئے ایف ایل آئی ایم امیجنگ کا استعمال راس، سی اے ایم کے آئی آئی، ریک، اور رن فیملی پروٹین کا مطالعہ کرنے کے لیے کیا گیا ہے۔ ایف ایل آئی ایم کا استعمال کلینیکل ملٹی فوٹن ٹومیگرافی میں انٹراڈرمل کینسر کے خلیوں کے ساتھ ساتھ دواسازی اور کاسمیٹک مرکبات کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا ہے۔ حال ہی میں ایف ایل آئی ایم کا استعمال پودوں کے خلیوں میں فلاونولز کا پتہ لگانے کے لیے بھی کیا گیا ہے۔ آٹوفلوریسنٹ کوینزیمز این اے ڈی (پی) ایچ اور ایف اے ڈی ملٹی فوٹون ایف ایل آئی ایم کا استعمال ممالیہ میٹابولزم میں تبدیلیوں کے مارکر کے طور پر کوینزیمز سے آٹو فلوریسنس کا پتہ لگانے کے لیے تیزی سے کیا جاتا ہے۔ ایف آر ای ٹی امیجنگ چونکہ فلوروفور کی فلوروسینس لائف ٹائم دونوں ریڈی ایٹو پر منحصر ہوتی ہے (یعنی۔ فلوروسینس) اور غیر تابکاری (یعنی۔ بجھانا، ایف آر ای ٹی) عمل، ڈونر مالیکیول سے قبولیت مالیکیول میں توانائی کی منتقلی سے ڈونر کی زندگی میں کمی آئے گی۔ اس طرح، FLIM کا استعمال کرتے ہوئے FRET پیمائش فلوروفور کی حالتوں/ماحول کے درمیان امتیاز کرنے کا ایک طریقہ فراہم کر سکتی ہے۔ شدت پر مبنی ایف آر ای ٹی پیمائشوں کے برعکس، ایف ایل آئی ایم پر مبنی ایف آر ای ٹی پیمائش بھی فلوروفورز کے ارتکاز کے لیے غیر حساس ہیں اور اس طرح نمونے میں ارتکاز اور اخراج کی شدت میں تغیرات کے ذریعے متعارف کرائے گئے نمونوں کو فلٹر کر سکتے ہیں۔ یہ بھی دیکھیں کہ فلوروسینس لائف ٹائم اور سپیکٹرم امیجنگ کے لیے فیزر اپروچ حوالہ جات بیرونی روابط فلوروسینس ایکسائٹیڈ-اسٹیٹ لائف ٹائم امیجنگ لائف ٹائم اور سپیکٹرم تجزیہ ٹولز امیج جے میں: http://spechron.com فلوروسینس لائف ٹائم امیجنگ مائکروسکوپی اصول ٹی سی ایس پی سی FLIM (بیکر اور ہکل GmbH) فلوروسینس تکنیک آپٹیکل مائکروسکوپی تکنیک