Transmission electron microscopy DNA sequencing
ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ ایک واحد سالماتی ترتیب کی ٹیکنالوجی ہے جو ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی تکنیک کا استعمال کرتی ہے۔ اس طریقہ کار کا تصور اور ترقی 1960 اور 70 کی دہائی میں کی گئی تھی، لیکن جب نمونے کو پہنچنے والے نقصان کی حد کو پہچانا گیا تو اس نے مقبولیت کھو دی۔ الیکٹران خوردبین کے تحت ڈی این اے کو واضح طور پر دیکھنے کے لیے، اس پر بھاری ایٹموں کا لیبل لگانا ضروری ہے۔ اس کے علاوہ، خصوصی امیجنگ تکنیک اور انحراف درست شدہ آپٹکس لیبل شدہ ڈی این اے مالیکیول کی تصویر لینے کے لیے درکار ریزولوشن حاصل کرنے کے لیے فائدہ مند ہیں۔ نظریہ طور پر، ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ انتہائی طویل پڑھنے کی لمبائی فراہم کر سکتی ہے، لیکن الیکٹران بیم کے نقصان کا مسئلہ اب بھی باقی رہ سکتا ہے اور ٹیکنالوجی ابھی تک تجارتی طور پر تیار نہیں ہوئی ہے۔ جیمز واٹسن اور فرانسس کرک کے ڈی این اے کی ساخت کا اندازہ لگانے کے چند سال بعد، اور فریڈرک سینگر کے تیزی سے ڈی این اے کی ترتیب کے لیے پہلا طریقہ شائع کرنے سے تقریبا دو دہائیاں پہلے، ایک امریکی طبیعیات دان، رچرڈ فین مین نے الیکٹران خوردبین کو ایک ایسے آلے کے طور پر تصور کیا جو ایک دن ماہرین حیاتیات کو "ڈی این اے چین میں اڈوں کی ترتیب کو دیکھنے" کی اجازت دے گا۔ فین مین کا خیال تھا کہ اگر الیکٹران خوردبین کو کافی طاقتور بنایا جا سکتا ہے، تو ڈی این اے سمیت کسی بھی اور تمام کیمیائی مرکبات کی جوہری ساخت کا تصور کرنا ممکن ہو جائے گا۔ 1970 میں، البرٹ کرو نے اسکیننگ ٹرانسمیشن الیکٹران خوردبین میں ہائی اینگل اینولر ڈارک فیلڈ امیجنگ (ایچ اے اے ڈی ایف) امیجنگ تکنیک تیار کی۔ اس تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے، انہوں نے پتلی بے ساختہ کاربن فلموں پر انفرادی بھاری ایٹموں کا تصور کیا۔ 2010 میں کروانیک اور ان کے ساتھیوں نے ایچ اے اے ڈی ایف طریقہ کار میں کئی تکنیکی بہتریوں کی اطلاع دی، جس میں انحراف درست الیکٹران آپٹکس اور کم تیز رفتار وولٹیج کا مجموعہ شامل ہے۔ مؤخر الذکر حیاتیاتی اشیاء کی امیجنگ کے لیے اہم ہے، کیونکہ یہ بیم سے ہونے والے نقصان کو کم کرنے اور ہلکے ایٹموں کے لیے امیج کے برعکس کو بڑھانے کی اجازت دیتا ہے۔ نتیجے کے طور پر، بوران نائٹرائڈ مونو لیئر میں واحد ایٹم کے متبادل کی تصویر لی جا سکتی ہے۔ کیمیائی اور فلوروسینٹ سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کی ایک بڑی تعداد کی ایجاد کے باوجود، الیکٹران مائکروسکوپی کو اب بھی واحد سالماتی ڈی این اے سیکوینسنگ انجام دینے کے ایک ذریعہ کے طور پر تلاش کیا جا رہا ہے۔ مثال کے طور پر، 2012 میں ہارورڈ یونیورسٹی، یونیورسٹی آف نیو ہیمپشائر اور زیڈ ایس جینیٹکس کے سائنسدانوں کے درمیان تعاون نے اس تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے ڈی این اے کے لمبے سلسلے کو پڑھنے کی صلاحیت کا مظاہرہ کیا، تاہم ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجی اب بھی تجارتی طور پر دستیاب نہیں ہے۔ اصول الیکٹران خوردبین میں 100 پی ایم تک ریزولوشن حاصل کرنے کی صلاحیت ہوتی ہے، جس کے ذریعے خوردبین حیاتیاتی سالمے اور ڈھانچے جیسے وائرس، رائبوسوم، پروٹین، لپڈ، چھوٹے سالمے اور یہاں تک کہ ایک ایٹم کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے۔ اگرچہ الیکٹران خوردبین سے مشاہدہ کرنے پر ڈی این اے نظر آتا ہے، لیکن حاصل کردہ تصویر کا ریزولوشن اتنا زیادہ نہیں ہوتا ہے کہ انفرادی اڈوں کی ترتیب کو سمجھنے کی اجازت دی جا سکے، یعنی ڈی این اے کی ترتیب۔ تاہم، بھاری ایٹموں یا دھاتوں کے ساتھ ڈی این اے اڈوں کی تفریقی لیبلنگ پر، انفرادی اڈوں کے درمیان تصور اور فرق دونوں کرنا ممکن ہے۔ لہذا، الیکٹران مائکروسکوپی کو تفریق بھاری ایٹم ڈی این اے لیبلنگ کے ساتھ مل کر ڈی این اے کی ترتیب کا تعین کرنے کے لیے براہ راست تصویر لینے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ورک فلو مرحلہ 1-ڈی این اے ڈینیچوریشن جیسا کہ ایک معیاری پولیمریز چین ری ایکشن (پی سی آر) میں، ڈبل اسٹرینڈڈ ڈی این اے مالیکیولز کو ترتیب دینے کے لیے ڈی نیچرڈ ہونا ضروری ہے اس سے پہلے کہ دوسرے اسٹرینڈ کو لیبلڈ نیوکلیوٹائڈز کے ساتھ ترکیب کیا جا سکے۔ مرحلہ 2-بھاری ایٹم لیبلنگ وہ عناصر جو حیاتیاتی مالیکیولز (C, H, N, O, P, S) بناتے ہیں وہ بہت ہلکے (کم جوہری نمبر، Z) ہوتے ہیں جنہیں ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی کے ذریعے انفرادی ایٹموں کے طور پر واضح طور پر دیکھا نہیں جا سکتا۔ اس مسئلے کو روکنے کے لیے، ڈی این اے بیس کو بھاری ایٹموں (اعلی زیڈ) کے ساتھ لیبل کیا جا سکتا ہے۔ ہر نیوکلیوٹائڈ کو ایک خاص بھاری لیبل کے ساتھ ٹیگ کیا جاتا ہے، تاکہ انہیں ٹرانسمیشن الیکٹران مائکرو گراف میں ممتاز کیا جا سکے۔ زیڈ ایس جینیٹکس تین بھاری لیبل استعمال کرنے کی تجویز کرتا ہے: برومین (زیڈ = 35)، آیوڈین (زیڈ = 53)، اور ٹرائکلورومیتھین (کل زیڈ = 63)۔ یہ مائیکرو گراف پر تفریق سیاہ اور ہلکے دھبوں کے طور پر ظاہر ہوں گے، اور چوتھا ڈی این اے بیس غیر لیبل شدہ رہے گا۔ ہیلسیون مالیکیولر، ٹوسٹ گروپ کے تعاون سے، تجویز کرتا ہے کہ پیورین اور پائریمائڈائن بیسز کو بالترتیب پلاٹینم ڈائمائن یا اوسمیم ٹیٹرا آکسائیڈ بائیپیریڈائن کے ساتھ فعال کیا جا سکتا ہے۔ بھاری دھات کے ایٹم جیسے اوسمیم (Z = 76)، اریڈیم (Z = 77)، سونا (Z = 79)، یا یورینیم (Z = 92) پھر انفرادی اڈوں کو لیبل کرنے کے لیے ان فعال گروپوں کے ساتھ دھات-دھاتی بند بنا سکتے ہیں۔ مرحلہ 3-سبسٹریٹ پر ڈی این اے کی صف بندی ڈی این اے کے مالیکیولز کو ایک پتلی، ٹھوس سبسٹریٹ پر پھیلایا جانا چاہیے تاکہ الیکٹران مائیکرو گراف پر لیبل شدہ اڈوں کی ترتیب واضح طور پر نظر آئے۔ مالیکیولر کومبنگ ایک ایسی تکنیک ہے جو ڈی این اے مالیکیولز کو بڑھانے کے لیے گھٹتے ہوئے ہوا کے پانی کے انٹرفیس کی قوت کا استعمال کرتی ہے، جس سے وہ خشک ہونے کے بعد ناقابل واپسی طور پر سائلن پرت سے جڑے رہتے ہیں۔ یہ ایک ایسا ذریعہ ہے جس کے ذریعے ٹھوس سبسٹریٹ پر ڈی این اے کی صف بندی حاصل کی جا سکتی ہے۔ مرحلہ 4-ٹی ای ایم امیجنگ ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (ٹی ای ایم) بہت پتلی نمونے کے ذریعے الیکٹرانوں کی بیم کو پاس کرکے ہائی میگنیفیکیشن، ہائی ریزولوشن امیجز تیار کرتی ہے۔ جبکہ روایتی ٹی ای ایم کے ساتھ جوہری ریزولوشن کا مظاہرہ کیا گیا ہے، مقامی ریزولوشن میں مزید بہتری کے لیے خوردبین لینس کے کروی اور رنگین انحراف کو درست کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔ یہ صرف اسکیننگ ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی میں ممکن ہوا ہے جہاں تصویر ایک باریک مرکوز الیکٹران بیم کے ساتھ شے کو اسکین کرکے حاصل کی جاتی ہے، جس طرح سے کیتھوڈ رے ٹیوب کی طرح ہے۔ تاہم، ریزولوشن میں حاصل شدہ بہتری بہت زیادہ بیم کی شدت، ہم آہنگ نمونے کے نقصان اور متعلقہ امیجنگ نوادرات کے ذریعہ مطالعہ شدہ شے کی تابکاری کے ساتھ مل کر آتی ہے۔ امیجنگ کی مختلف تکنیکیں اس بات پر منحصر ہوتی ہیں کہ نمونے میں بھاری یا ہلکے ایٹم ہوتے ہیں: اینولر ڈارک فیلڈ امیجنگ الیکٹرانوں کے بکھرنے کی پیمائش کرتی ہے جب وہ ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی نمونے میں ایٹموں کے مرکزے کو موڑ دیتے ہیں۔ یہ بھاری ایٹموں پر مشتمل نمونوں کے لیے بہترین موزوں ہے، کیونکہ وہ الیکٹرانوں کے زیادہ بکھرنے کا سبب بنتے ہیں۔ یہ تکنیک ایٹموں کو بوران، نائٹروجن اور کاربن کی طرح ہلکے تصور کرنے کے لیے استعمال کی گئی ہے ؛ تاہم، ایسے ہلکے ایٹموں کے لیے سگنل بہت کمزور ہے۔ اگر اینولر ڈارک فیلڈ مائکروسکوپی کو ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، تو یقینی طور پر ڈی این اے بیس کو بھاری ایٹموں سے لیبل کرنا ضروری ہوگا تاکہ ایک مضبوط سگنل کا پتہ لگایا جا سکے۔ اینولر برائٹ فیلڈ امیجنگ نمونے کے ذریعے براہ راست منتقل ہونے والے الیکٹرانوں کا پتہ لگاتا ہے، اور جوہری مرکزوں کے ساتھ ان کے تعاملات سے پیدا ہونے والی لہر کی مداخلت کی پیمائش کرتا ہے۔ یہ تکنیک اینولر ڈارک فیلڈ امیجنگ کے طریقوں سے زیادہ حساسیت والے ہلکے ایٹموں کا پتہ لگا سکتی ہے۔ درحقیقت، کرسٹل ٹھوسوں میں آکسیجن، نائٹروجن، لیتھیم اور ہائیڈروجن کی تصویر اینولر برائٹ فیلڈ الیکٹران مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے لی گئی ہے۔ اس طرح، ڈی این اے سلسلہ میں ایٹموں کی براہ راست تصاویر حاصل کرنا نظریاتی طور پر ممکن ہے ؛ تاہم، ڈی این اے کی ساخت کرسٹل ٹھوس مادوں کے مقابلے میں بہت کم ہندسی ہے، اس لیے پیشگی لیبلنگ کے بغیر براہ راست امیجنگ ممکن نہیں ہو سکتی۔ مرحلہ 5-ڈیٹا تجزیہ الیکٹران مائکرو گراف پر سیاہ اور روشن دھبوں، جو کہ مختلف لیبل والے ڈی این اے اڈوں سے مطابقت رکھتے ہیں، کا تجزیہ کمپیوٹر سافٹ ویئر کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ ایپلی کیشنز ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ ابھی تک تجارتی طور پر دستیاب نہیں ہے، لیکن طویل پڑھنے کی لمبائی جو یہ ٹیکنالوجی ایک دن فراہم کر سکتی ہے اسے مختلف سیاق و سباق میں مفید بنائے گی۔ ڈی نووو جینوم اسمبلی جب کسی جینوم کی ترتیب دی جاتی ہے، تو اسے ایسے ٹکڑوں میں تقسیم کیا جانا چاہیے جو اتنے چھوٹے ہوں کہ ایک ہی پڑھنے میں ترتیب دی جا سکے۔ ان ریڈز کو پھر ریڈز کے درمیان اوورلیپ ہونے والے علاقوں کو صف بندی کرکے جگا پہیلی کی طرح دوبارہ اکٹھا کیا جانا چاہیے۔ اس عمل کو ڈی نووو جینوم اسمبلی کہا جاتا ہے۔ سیکوینسنگ پلیٹ فارم جتنا لمبا پڑھنے کی لمبائی فراہم کرتا ہے، اوور لیپنگ کے علاقے اتنے ہی لمبے ہوتے ہیں، اور جینوم کو جمع کرنا اتنا ہی آسان ہوتا ہے۔ کمپیوٹیشنل نقطہ نظر سے، مائیکرو فلوئڈک سینگر سیکوینسنگ اب بھی جینومز کو ترتیب دینے اور جمع کرنے کا سب سے مؤثر طریقہ ہے جس کے لیے کوئی حوالہ جینوم ترتیب موجود نہیں ہے۔ نسبتا طویل پڑھنے کی لمبائی انفرادی ترتیب پڑھنے کے درمیان کافی حد تک اوورلیپ فراہم کرتی ہے، جو اسمبلی میں زیادہ شماریاتی اعتماد کی اجازت دیتی ہے۔ اس کے علاوہ، لانگ سینگر ریڈز تکراری ڈی این اے سیکوینس کے زیادہ تر علاقوں کو پھیلانے کے قابل ہوتے ہیں جو بصورت دیگر غلط صف بندی کا سبب بن کر سیکوینس اسمبلی کو الجھاتے ہیں۔ تاہم، سینگر سیکوینسنگ کے ذریعے ڈی نووو جینوم اسمبلی انتہائی مہنگی اور وقت طلب ہے۔ دوسری نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز، اگرچہ کم مہنگی ہیں، لیکن مختصر پڑھنے کی لمبائی کی وجہ سے عام طور پر ڈی نووو جینوم اسمبلی کے لیے نااہل ہیں۔ عام طور پر، ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ سمیت تیسری نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کا مقصد کم سیکوینسنگ لاگت کو برقرار رکھتے ہوئے پڑھنے کی لمبائی کو بہتر بنانا ہے۔ اس طرح، جیسے جیسے تیسری نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز میں بہتری آئے گی، تیز رفتار اور سستی ڈی نووو جینوم اسمبلی ایک حقیقت بن جائے گی۔ مکمل ہیپلوٹائپ ایک ہیپلوٹائپ منسلک ایلیلز کا ایک سلسلہ ہے جو ایک ہی کروموسوم پر ایک ساتھ وراثت میں ملتا ہے۔ ڈی این اے کی ترتیب کو تمام واحد نیوکلیوٹائڈ پولیمورفزم (ایس این پیز) کو جینو ٹائپ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جو ایک ہیپلوٹائپ تشکیل دیتے ہیں۔ تاہم، مختصر ڈی این اے سیکوینسنگ ریڈز کو اکثر مرحلہ وار نہیں کیا جا سکتا ؛ یعنی، ہیٹروزائگس متغیرات کو اعتماد کے ساتھ صحیح ہیپلوٹائپ کو تفویض نہیں کیا جا سکتا۔ درحقیقت، شارٹ ریڈ ڈی این اے سیکوینسنگ ڈیٹا کے ساتھ ہیپلوٹائپنگ کے لیے ایس این پیز کی درست شناخت کے لیے بہت زیادہ کوریج (ہر ڈی این اے بیس کی اوسط> 50x کوریج) کے ساتھ ساتھ والدین سے اضافی سیکوینس ڈیٹا کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ مینڈیلین ٹرانسمیشن کو ہیپلوٹائپز کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکے۔ سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز جو لانگ ریڈز پیدا کرتی ہیں، بشمول ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ، ایک ہی ریڈ میں پورے ہیپلو بلاکس کو پکڑ سکتی ہیں۔ یعنی، ہیپلوٹائپز کو متعدد ریڈز کے درمیان تقسیم نہیں کیا جاتا ہے، اور جینیاتی طور پر منسلک ایلیلز ترتیب کے اعداد و شمار میں ایک ساتھ رہتے ہیں۔ لہذا، لانگ ریڈز ہیپلوٹائپنگ کو آسان اور زیادہ درست بناتے ہیں، جو آبادی جینیات کے شعبے کے لیے فائدہ مند ہے۔ کاپی نمبر متغیرات جین عام طور پر ڈپلوئڈ انسانی جینوم میں دو کاپیوں میں موجود ہوتے ہیں۔ جو جین اس معیاری کاپی نمبر سے ہٹ جاتے ہیں انہیں کاپی نمبر متغیرات (CNVs) کہا جاتا ہے۔ کاپی نمبر کی تغیرات سودمند ہو سکتی ہیں (یہ عام طور پر عام تغیرات ہیں، جنہیں کاپی نمبر پولیمورفزم کہا جاتا ہے) یا پیتھوجینک۔ سی این وی کا پتہ فلوریسنس ان سیٹو ہائبرڈائزیشن (ایف آئی ایس ایچ) یا تقابلی جینومک ہائبرڈائزیشن (سی جی ایچ) کے ذریعے لگایا جاتا ہے۔ ان مخصوص بریک پوائنٹس کا پتہ لگانے کے لیے جن پر حذف ہوتا ہے، یا ڈپلیکیشن یا ایمپلیفیکیشن ایونٹ کے ذریعے متعارف کرائے گئے جینومک زخموں کا پتہ لگانے کے لیے، سی جی ایچ کو ٹائلنگ ایرے (ایرے سی جی ایچ) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جا سکتا ہے، یا مختلف خطے کی ترتیب دی جا سکتی ہے۔ لمبی سیکوینسنگ ریڈز خاص طور پر نقلوں یا امپلیفکیشنز کا تجزیہ کرنے کے لیے مفید ہیں، کیونکہ اگر ان کو ایک ہی سیکوینسنگ ریڈ میں پکڑا جائے تو امپلیفائیڈ سیگمنٹس کی واقفیت کا تجزیہ کرنا ممکن ہے۔ کینسر کینسر جینومکس، یا آنکوجینومکس، ایک ابھرتا ہوا شعبہ ہے جس میں ہائی تھرو پٹ، دوسری نسل کی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجی کا اطلاق پورے کینسر جینوم کی ترتیب کے لیے کیا جا رہا ہے۔ اس مختصر پڑھنے کی ترتیب کے اعداد و شمار کا تجزیہ کرنے میں مختصر پڑھنے کے اعداد و شمار کا استعمال کرتے ہوئے ڈی نووو جینوم اسمبلی سے وابستہ تمام مسائل شامل ہیں۔ مزید برآں، کینسر کے جینوم اکثر انیوپلوئڈ ہوتے ہیں۔ یہ انحراف، جو بنیادی طور پر بڑے پیمانے پر کاپی نمبر کی مختلف قسمیں ہیں، کاپی نمبر کا اندازہ لگانے کے لیے ریڈ فریکوئنسی کا استعمال کرتے ہوئے دوسری نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے ذریعے تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، لمبے ریڈز کاپی نمبر، بڑھے ہوئے علاقوں کی واقفیت، اور کینسر جینوم میں موجود ایس این پیز کی زیادہ درست تصویر فراہم کریں گے۔ مائکرو بایوم کی ترتیب مائکرو بایوم سے مراد مائکرو ماحولیات اور ان کے متعلقہ جینوم میں موجود جرثوموں کا کل مجموعہ ہے۔ مثال کے طور پر، ایک اندازے کے مطابق 100 ٹریلین مائکروبیل خلیات کسی بھی وقت انسانی جسم میں آباد ہوتے ہیں۔ انسانی مائکرو بایوم خاص دلچسپی کا حامل ہے، کیونکہ یہ عام بیکٹیریا انسانی صحت اور قوت مدافعت کے لیے اہم ہیں۔ زمین کے زیادہ تر بیکٹیریل جینومز کو ابھی ترتیب نہیں دیا گیا ہے۔ مائیکرو بایوم سیکوینسنگ پروجیکٹ شروع کرنے کے لیے وسیع ڈی نووو جینوم اسمبلی کی ضرورت ہوگی، ایک ایسا امکان جو مختصر پڑھنے والی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے ساتھ مشکل ہے۔ لمبے پڑھنے سے نئے مائکروبیل جینوموں کی اسمبلی میں بہت آسانی ہوگی۔ طاقت اور کمزوریاں دوسری اور تیسری نسل کی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے مقابلے میں، ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ میں متعدد ممکنہ کلیدی طاقت اور کمزوریاں ہیں، جو بالآخر مستقبل کی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجی کے طور پر اس کی افادیت اور اہمیت کا تعین کریں گی۔ طاقت طویل پڑھنے کی لمبائی: زیڈ ایس جینیٹکس نے ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ کی ممکنہ پڑھنے کی لمبائی کا تخمینہ لگایا ہے جو روزانہ 1.7 بلین بیس جوڑوں کی شرح کے ساتھ 10,000 سے 20,000 بیس جوڑے ہیں۔ اس طرح کی طویل پڑھنے کی لمبائی دیگر ایپلی کیشنز کے علاوہ آسان ڈی نووو جینوم اسمبلی اور ہیپلوٹائپز کا براہ راست پتہ لگانے کی اجازت دے گی۔ کم لاگت: ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ کی لاگت کا تخمینہ زیادہ مہنگے دوسری نسل کے ڈی این اے سیکوینسنگ متبادل کے مقابلے میں فی انسانی جینوم صرف 5,000-10,000 امریکی ڈالر ہے۔ کوئی انحطاط نہیں: ترکیب کے دوران مطابقت پذیری میں کمی کی وجہ سے ڈی این اے اسٹرینڈز کا انحطاط دوسری نسل کی ترتیب کی ٹیکنالوجیز کا ایک بڑا مسئلہ ہے۔ ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ اور کئی دیگر تیسری نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے لیے، ریڈز کی مطابقت پذیری غیر ضروری ہے کیونکہ ایک وقت میں صرف ایک مالیکیول پڑھا جا رہا ہے۔ مختصر ٹرن اراؤنڈ ٹائم: ڈی این اے کے مقامی ٹکڑوں کو پڑھنے کی صلاحیت پیچیدہ ٹیمپلیٹ کی تیاری کو پورے جینوم کی ترتیب کے عمومی ورک فلو میں ایک غیر ضروری قدم بناتی ہے۔ نتیجتا، کم ٹرن اراؤنڈ ٹائم ممکن ہیں۔ کمزوریاں اعلی سرمایہ کی لاگت: ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ کے لیے درکار کافی ریزولوشن کے ساتھ ایک ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ کی لاگت تقریبا US $1,000,000 ہے، اس لیے اس طریقہ سے ڈی این اے سیکوینسنگ کو آگے بڑھانے کے لیے کافی سرمایہ کاری کی ضرورت ہوتی ہے۔ تکنیکی طور پر چیلنج: سلیکٹو ہیوی ایٹم لیبلنگ اور لیبل شدہ ڈی این اے کو سبسٹریٹ سے جوڑنا اور سیدھا کرنا ایک سنگین تکنیکی چیلنج ہے۔ مزید برآں، ڈی این اے کا نمونہ الیکٹران خوردبین کے ہائی ویکیوم اور ہائی انرجی الیکٹرانوں کے فوکسڈ بیم کے ذریعے تابکاری کے لیے مستحکم ہونا چاہیے۔ ممکنہ پی سی آر تعصب اور نوادرات: اگرچہ پی سی آر کو صرف ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی ڈی این اے سیکوینسنگ میں استعمال کیا جا رہا ہے تاکہ ڈی این اے اسٹرینڈ کو بھاری ایٹموں یا دھاتوں سے لیبل کیا جا سکے، لیکن واحد امپلیفکیشن کے دوران ٹیمپلیٹ کی نمائندگی یا غلطیوں میں تعصب متعارف کرانے کا امکان ہو سکتا ہے۔ سیکوینسنگ کی دیگر ٹیکنالوجیز سے موازنہ بہت سی غیر سینجر دوسری اور تیسری نسل کی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز تھرو پٹ بڑھانے اور لاگت کو کم کرنے کے مشترکہ مقصد کے ساتھ تیار کی گئی ہیں یا فی الحال تیار کی جا رہی ہیں تاکہ ذاتی نوعیت کی جینیاتی ادویات کو مکمل طور پر محسوس کیا جا سکے۔ ایکس پرائز فاؤنڈیشن (سانتا مونیکا، سی اے، یو ایس اے) کے تعاون سے جینومکس کے لیے 10 ملین امریکی ڈالر کا آرکن ایکس انعام اور نیشنل ہیومن جینوم ریسرچ انسٹی ٹیوٹ آف نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ (این آئی ایچ-این ایچ جی آر آئی) کے تعاون سے 70 ملین امریکی ڈالر کے گرانٹ ایوارڈز دونوں ہی نئی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کی ترقی میں تحقیقی سرگرمیوں کے تیزی سے پھٹنے کو ہوا دے رہے ہیں۔ چونکہ مختلف نقطہ نظر، تکنیک اور حکمت عملی وہ ہیں جو ہر ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجی کی وضاحت کرتی ہیں، اس لیے ہر ایک کی اپنی طاقت اور کمزوریاں ہیں۔ دوسری اور تیسری نسل کی ڈی این اے سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے درمیان اہم پیرامیٹرز کا موازنہ ٹیبل 1 میں پیش کیا گیا ہے۔ حوالہ جات ڈی این اے سیکوینسنگ الیکٹران مائکروسکوپی لیبارٹری تکنیک مائکروبیولوجی تکنیک سالماتی حیاتیات تکنیک سائنسی تکنیک