Massive parallel sequencing
بڑے پیمانے پر متوازی ترتیب یا بڑے پیمانے پر متوازی ترتیب بڑے پیمانے پر متوازی پروسیسنگ کے تصور کا استعمال کرتے ہوئے ڈی این اے ترتیب کے لیے کئی ہائی تھرو پٹ طریقوں میں سے کوئی بھی ہے۔ اسے اگلی نسل کی ترتیب (این جی ایس) یا دوسری نسل کی ترتیب بھی کہا جاتا ہے۔ ان میں سے کچھ ٹیکنالوجیز 1993 اور 1998 کے درمیان ابھری ہیں اور 2005 سے تجارتی طور پر دستیاب ہیں۔ یہ ٹیکنالوجیز فی انسٹرومنٹ رن 1 ملین سے 43 بلین شارٹ ریڈز (50 سے 400 بیسز) کی ترتیب کے لیے چھوٹے اور متوازی پلیٹ فارمز کا استعمال کرتی ہیں۔ بہت سے این جی ایس پلیٹ فارم انجینئرنگ کی ترتیب اور ترتیب کی کیمسٹری میں مختلف ہیں۔ وہ ایک فلو سیل میں مقامی طور پر الگ، کلونلی امپلیفائیڈ ڈی این اے ٹیمپلیٹس یا سنگل ڈی این اے مالیکیولز کے ذریعے بڑے پیمانے پر متوازی ترتیب کے تکنیکی نمونے کا اشتراک کرتے ہیں۔ یہ ڈیزائن سینگر سیکوینسنگ سے بہت مختلف ہے-جسے کیپلری سیکوینسنگ یا پہلی نسل کی سیکوینسنگ بھی کہا جاتا ہے-جو انفرادی سیکوینسنگ رد عمل میں پیدا ہونے والی چین ٹرمینیشن مصنوعات کی الیکٹروفوریٹک علیحدگی پر مبنی ہے۔ یہ طریقہ کار ترتیب کو بڑے پیمانے پر مکمل کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ تجارتی طور پر دستیاب این جی ایس پلیٹ فارمز کے ساتھ این جی ایس پلیٹ فارمز ڈی این اے سیکوینسنگ عام طور پر درج ذیل مراحل کے ساتھ کی جاتی ہے۔ سب سے پہلے، ڈی این اے سیکوینسنگ لائبریریاں پی سی آر ان وٹرو کے ذریعے کلونل امپلیفکیشن کے ذریعے تیار کی جاتی ہیں۔ دوسرا، ڈی این اے کی ترتیب ترکیب کے ذریعے کی جاتی ہے، اس طرح کہ ڈی این اے کی ترتیب کا تعین زنجیر کو ختم کرنے والی کیمسٹری کے بجائے تکمیلی اسٹرینڈ میں نیوکلیوٹائڈز کے اضافے سے ہوتا ہے۔ تیسرا، مقامی طور پر الگ، امپلیفائیڈ ڈی این اے ٹیمپلیٹس کو جسمانی علیحدگی کے مرحلے کی ضرورت کے بغیر بڑے پیمانے پر متوازی انداز میں بیک وقت ترتیب دیا جاتا ہے۔ زیادہ تر این جی ایس پلیٹ فارمز میں ان اقدامات کی پیروی کی جاتی ہے، لیکن ہر ایک مختلف حکمت عملی کا استعمال کرتا ہے۔ ترتیب کے رد عمل کی این جی ایس متوازی ایک ہی آلے میں سیکڑوں میگا بیسز کو نیوکلیوٹائڈ ترتیب کے گیگا بیسز کے لیے پیدا کرتی ہے۔ اس سے دستیاب ترتیب کے اعداد و شمار میں زبردست اضافہ ہوا ہے اور بائیو میڈیکل سائنسز میں بنیادی طور پر جینوم ترتیب کے طریقوں کو تبدیل کیا گیا ہے۔ نئی ابھرتی ہوئی این جی ایس ٹیکنالوجیز اور آلات نے فی جینوم سیکوینسنگ $1000 کے نشان کے قریب سیکوینسنگ کی لاگت میں نمایاں کمی میں مزید تعاون کیا ہے۔ 2014 تک، بڑے پیمانے پر متوازی ترتیب کے پلیٹ فارم تجارتی طور پر دستیاب ہیں اور ان کی خصوصیات کا خلاصہ میز میں کیا گیا ہے۔ جیسے جیسے این جی ایس ٹیکنالوجیز کی رفتار تیزی سے بڑھ رہی ہے، تکنیکی وضاحتیں اور قیمتوں میں اتار چڑھاؤ آ رہا ہے۔ سنگل اینڈ سیکوینسنگ کے لیے رن ٹائمز اور گیگا بیس (جی بی) آؤٹ پٹ فی رن نوٹ کیے گئے ہیں۔ پیئرڈ اینڈ سیکوینسنگ انجام دیتے وقت رن ٹائمز اور آؤٹ پٹ تقریبا دوگنا ہوتے ہیں۔ ‡ روچے 454 اور ہیلیکوس بائیو سائنسز پلیٹ فارمز کے لیے اوسط پڑھنے کی لمبائی۔ این جی ایس کے لیے ٹیمپلیٹ کی تیاری کے طریقے این جی ایس رد عمل کے لیے ٹیمپلیٹس تیار کرنے میں دو طریقے استعمال کیے جاتے ہیں: ایک ڈی این اے مالیکیول سے پیدا ہونے والے ایمپلیفائیڈ ٹیمپلیٹس، اور ایک ڈی این اے مالیکیول ٹیمپلیٹس۔ امیجنگ سسٹمز کے لیے جو واحد فلوروسینس کے واقعات کا پتہ نہیں لگا سکتے، ڈی این اے ٹیمپلیٹس کی وسعت کی ضرورت ہے۔ امپلیفیکیشن کے تین سب سے عام طریقے ایملشن پی سی آر (ایم پی سی آر)، رولنگ سرکل اور سالڈ فیز ایمپلیفیکیشن ہیں۔ ٹیمپلیٹس کی حتمی تقسیم مقامی طور پر بے ترتیب یا گرڈ پر ہو سکتی ہے۔ ایملشن پی سی آر طریقوں میں، ڈی این اے لائبریری سب سے پہلے جینومک ڈی این اے کے بے ترتیب ٹکڑے ٹکڑے کے ذریعے تیار کی جاتی ہے۔ سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کے ٹکڑے (ٹیمپلیٹس) موتیوں کی سطح سے اڈاپٹرز یا لنکرز کے ساتھ منسلک ہوتے ہیں، اور ایک مالا ڈی این اے لائبریری کے ایک ڈی این اے ٹکڑے سے منسلک ہوتا ہے۔ موتیوں کی سطح پر اولیگونیوکلیوٹائڈ تحقیقات ہوتی ہیں جن کے سلسلے ڈی این اے کے ٹکڑوں کو باندھنے والے اڈاپٹرز کی تکمیل کرتے ہیں۔ اس کے بعد موتیوں کو پانی کے تیل کی ایملشن بوندوں میں تقسیم کیا جاتا ہے۔ آبی پانی کے تیل کے ایملشن میں، ایک مالا پر قبضہ کرنے والی ہر بوندیں پی سی آر مائکرو ری ایکٹر ہوتی ہیں جو واحد ڈی این اے ٹیمپلیٹ کی بڑھی ہوئی کاپیاں تیار کرتی ہیں۔ گرڈڈ رولنگ سرکل نینو بالز حل میں دائرے کی توسیع کے ذریعے واحد ڈی این اے مالیکیولز کی آبادی کو بڑھانے کے بعد ڈی این اے سے چھوٹے سائز کے دھبوں کے گرڈ پر قبضہ کیا جاتا ہے۔ ڈی این اے کالونی جنریشن (برج ایمپلیفکیشن) فارورڈ اور ریورس پرائمرز فلو سیل میں سلائیڈ سے زیادہ کثافت پر مشترکہ طور پر منسلک ہوتے ہیں۔ سپورٹ پر موجود ٹیمپلیٹ کے ساتھ پرائمرز کا تناسب امپلیفائیڈ کلسٹرز کی سطح کی کثافت کی وضاحت کرتا ہے۔ فلو سیل پولیمریز پر مبنی توسیع کے لیے ریجینٹس کے سامنے آتا ہے، اور پرائمنگ سطح پر ایک تکمیلی اولیگو کے لیے ایک جڑے ہوئے ٹکڑے "پلوں" کے آزاد/دور سرے کے طور پر ہوتی ہے۔ بار بار انحطاط اور توسیع کے نتیجے میں بہاؤ سیل کی سطح پر لاکھوں الگ الگ مقامات پر ڈی این اے کے ٹکڑوں کی مقامی وسعت ہوتی ہے۔ سالڈ فیز ایمپلیفکیشن سے 100-200 ملین مقامی طور پر الگ کیے گئے ٹیمپلیٹ کلسٹرز پیدا ہوتے ہیں، جو آزاد سرے فراہم کرتے ہیں جس کے بعد ایک یونیورسل سیکوینسنگ پرائمر کو ہائبرڈائز کیا جاتا ہے تاکہ سیکوینسنگ ری ایکشن شروع کیا جا سکے۔ یہ ٹیکنالوجی 1997 میں گلیکسو ویلکم کے جینیوا بائیو میڈیکل ریسرچ انسٹی ٹیوٹ (جی بی آر آئی) سے پاسکل میئر، ایرک کاوشیما، اور لارنٹ فرینیلی کے ذریعے پیٹنٹ کے لیے دائر کی گئی تھی، اور اسے پہلی بار 1998 میں عوامی طور پر پیش کیا گیا تھا۔ 1994 میں کرس ایڈمز اور اسٹیو کرون نے اسی طرح کے، لیکن غیر کلونل، سطح کی وسعت کے طریقہ کار پر ایک پیٹنٹ دائر کیا، جسے چرچ اور مترا نے 1997 میں کلونل توسیع کے لیے ڈھال لیا تھا۔ سنگل مالیکیول ٹیمپلیٹس پروٹوکول جن میں ڈی این اے امپلیفیکیشن کی ضرورت ہوتی ہے اکثر ان پر عمل درآمد کرنا مشکل ہوتا ہے اور ترتیب کی غلطیاں متعارف کراسکتے ہیں۔ سنگل مالیکیول ٹیمپلیٹس کی تیاری زیادہ سیدھی ہوتی ہے اور اس میں پی سی آر کی ضرورت نہیں ہوتی، جو امپلیفائیڈ ٹیمپلیٹس میں غلطیاں متعارف کراسکتی ہے۔ اے ٹی سے بھرپور اور جی سی سے بھرپور ہدف کے سلسلے اکثر امپلیفکیشن بائیس ظاہر کرتے ہیں، جس کے نتیجے میں جینوم صف بندی اور اسمبلیوں میں ان کی کم نمائندگی ہوتی ہے۔ سنگل مالیکیول ٹیمپلیٹس کو عام طور پر کم از کم تین مختلف طریقوں میں سے ایک کا استعمال کرتے ہوئے ٹھوس سپورٹ پر متحرک کیا جاتا ہے۔ پہلے نقطہ نظر میں، مقامی طور پر تقسیم شدہ انفرادی پرائمر مالیکیول ٹھوس سپورٹ سے ہم آہنگی سے منسلک ہوتے ہیں۔ ٹیمپلیٹ، جو ابتدائی مواد کو تصادفی طور پر چھوٹے سائز میں ٹکڑے ٹکڑے کرکے تیار کیا جاتا ہے (مثال کے طور پر، ~ 200-250 bp) اور ٹکڑے کے سروں میں عام اڈاپٹر شامل کرکے، پھر متحرک پرائمر میں ہائبرڈائز کیا جاتا ہے۔ دوسرے نقطہ نظر میں، مقامی طور پر تقسیم شدہ سنگل مالیکیول ٹیمپلیٹس مستحکم پرائمرز سے سنگل اسٹرینڈڈ، سنگل مالیکیول ٹیمپلیٹس کو پرائمنگ اور توسیع دے کر ٹھوس سپورٹ سے مربوط ہوتے ہیں۔ ایک عام پرائمر کو پھر ٹیمپلیٹ میں ہائبرڈائز کیا جاتا ہے۔ کسی بھی نقطہ نظر میں، ڈی این اے پولیمریز این جی ایس رد عمل کو شروع کرنے کے لیے متحرک پرائمیڈ ٹیمپلیٹ کی ترتیب سے منسلک ہو سکتا ہے۔ مذکورہ بالا دونوں طریقوں کو ہیلیکوس بائیو سائنسز استعمال کرتا ہے۔ تیسرے نقطہ نظر میں، مقامی طور پر تقسیم شدہ واحد پولیمرس مالیکیول ٹھوس سپورٹ سے منسلک ہوتے ہیں، جس سے ایک بنیادی ٹیمپلیٹ مالیکیول جڑا ہوتا ہے۔ یہ نقطہ نظر پیسیفک بائیو سائنسز کے ذریعے استعمال کیا جاتا ہے۔ اس تکنیک کے ساتھ بڑے ڈی این اے مالیکیولز (دسیوں ہزار بیس جوڑوں تک) استعمال کیے جا سکتے ہیں اور، پہلے دو طریقوں کے برعکس، تیسرا طریقہ حقیقی وقت کے طریقوں کے ساتھ استعمال کیا جا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں ممکنہ طور پر پڑھنے کی لمبائی زیادہ ہوتی ہے۔ ترتیب کے نقطہ نظر ترتیب بذریعہ ترکیب ترتیب ترتیب بذریعہ ترکیب (ایس بی ایس) کا مقصد ڈی این اے پولیمرس کے ذریعے نیوکلیوٹائڈ کی شمولیت کا پتہ لگا کر ڈی این اے نمونے کی ترتیب کا تعین کرنا ہے۔ ایک انجینیئرڈ پولیمرس کا استعمال ڈی این اے کے ایک اسٹرینڈ کی کاپی کی ترکیب کے لیے کیا جاتا ہے اور ہر نیوکلیوٹائڈ کو شامل کرنے کی نگرانی کی جاتی ہے۔ ترکیب کے ذریعے ترتیب کے اصول کو پہلی بار 1993 میں بیان کیا گیا تھا جس میں بہتری کچھ سال بعد شائع ہوئی تھی۔ ایس بی ایس کے تمام مجسموں کے لیے کلیدی حصے انتہائی ملتے جلتے ہیں اور ان میں شامل ہیں (1) بعد کے سگنل کو بڑھانے اور ڈی این اے کو ٹھوس سپورٹ سے منسلک کرنے کے لیے ڈی این اے کی وسعت، (2) ٹھوس سپورٹ پر سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کی نسل، (3) انجینئرڈ پولیمرس کا استعمال کرتے ہوئے نیوکلیوٹائڈز کو شامل کرنا اور (4) نیوکلیوٹائڈ کو شامل کرنے کا پتہ لگانا۔ پھر 3-4 مراحل کو دہرایا جاتا ہے اور ترتیب کو مرحلہ 4 میں حاصل کردہ اشاروں سے جمع کیا جاتا ہے۔ ترتیب کے لحاظ سے ترکیب کا یہ اصول تقریبا تمام بڑے متوازی ترتیب کے آلات کے لیے استعمال کیا گیا ہے، جن میں 454، پیک بائیو، آئن ٹورنٹ، الومینا اور ایم جی آئی شامل ہیں۔ پائروسیکوینسنگ کے اصول کو سب سے پہلے 1993 میں ایک ٹھوس سپورٹ کو ایک انجینئرڈ ڈی این اے پولیمریز کے ساتھ جوڑ کر بیان کیا گیا تھا جس میں 3 سے 5 ایکسونوکلیز سرگرمی (پروف ریڈنگ) کی کمی تھی اور فائر فلائی لوسیفریز کا استعمال کرتے ہوئے لومینسینس ریئل ٹائم کا پتہ لگایا گیا تھا۔ ترکیب کے ذریعے ترتیب کے تمام کلیدی تصورات متعارف کرائے گئے، جن میں (1) بعد کے سگنل کو بڑھانے اور ڈی این اے کو ترتیب دینے کے لیے (ٹیمپلیٹ) ٹھوس سپورٹ سے منسلک کرنے کے لیے ڈی این اے کی وسعت، (2) ٹھوس سپورٹ پر سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کی نسل، (3) انجینئرڈ پولیمرس کا استعمال کرتے ہوئے نیوکلیوٹائڈز کو شامل کرنا اور (4) حقیقی وقت میں روشنی کا پتہ لگانے کے ذریعے شامل نیوکلیوٹائڈ کا پتہ لگانا شامل ہیں۔ ایک فالو اپ مضمون میں، تصور کو مزید تیار کیا گیا اور 1998 میں، ایک مضمون شائع کیا گیا جس میں مصنفین نے دکھایا کہ غیر مربوط نیوکلیوٹائڈز کو چوتھے انزائم (ایپیریز) سے ہٹایا جا سکتا ہے جس سے ترکیب کے ذریعے ترتیب کو بغیر دھونے کی ضرورت کے انجام دیا جا سکتا ہے۔ غیر مربوط نیوکلیوٹائڈز۔ ریورسیبل ٹرمینیٹر کیمسٹری کے ذریعے ترتیب یہ نقطہ نظر ایک چکور طریقہ میں ریورسیبل ٹرمینیٹر باؤنڈ ڈی این ٹی پیز کا استعمال کرتا ہے جس میں نیوکلیوٹائڈ شامل کرنا، فلوروسینس امیجنگ اور کلیویج شامل ہوتے ہیں۔ ایک فلوروسینٹ لیبل والے ٹرمینیٹر کی تصویر لی جاتی ہے کیونکہ ہر ڈی این ٹی پی کو شامل کیا جاتا ہے اور پھر اگلے بیس کو شامل کرنے کی اجازت دینے کے لیے کلییو کیا جاتا ہے۔ یہ نیوکلیوٹائڈز کیمیائی طور پر اس طرح بند ہوتے ہیں کہ ہر انضمام ایک منفرد واقعہ ہوتا ہے۔ ایک امیجنگ مرحلہ ہر بیس شامل کرنے کے مرحلے کے بعد ہوتا ہے، پھر بلاک شدہ گروپ کو کیمیائی طور پر ہٹا دیا جاتا ہے تاکہ ڈی این اے پولیمریز کے ذریعے اگلے شامل کرنے کے لیے ہر اسٹرینڈ کو تیار کیا جا سکے۔ مراحل کا یہ سلسلہ مخصوص تعداد میں چکروں کے لیے جاری رہتا ہے، جیسا کہ صارف کی طرف سے متعین کردہ آلہ کی ترتیبات سے طے ہوتا ہے۔ 3 'بلاکنگ گروپوں کو اصل میں یا تو انزیمیٹک یا کیمیائی الٹ کے طور پر تصور کیا گیا تھا۔ کیمیائی طریقہ سلیکسا اور الومینا مشینوں کی بنیاد رہا ہے۔ ریورسیبل ٹرمینیٹر کیمسٹری کے ذریعہ ترتیب چار رنگوں کا چکر ہو سکتا ہے جیسے کہ ایلیومینا/سولیکسا کے ذریعہ استعمال کیا جاتا ہے، یا ایک رنگ کا چکر جیسے کہ ہیلیکوس بائیو سائنسز کے ذریعہ استعمال کیا جاتا ہے۔ ہیلیکوس بائیو سائنسز نے "ورچوئل ٹرمینیٹرز" کا استعمال کیا، جو دوسرے نیوکلیوسائڈ اینالاگ کے ساتھ ان بلاکڈ ٹرمینیٹرز ہیں جو ایک انفیکٹر کے طور پر کام کرتے ہیں۔ ان ٹرمینیٹرز میں گروپوں کو ختم کرنے یا روکنے کے لیے مناسب تبدیلیاں ہوتی ہیں تاکہ ڈی این اے کی ترکیب ایک بیس کے اضافے کے بعد ختم ہو جائے۔ لیگز انزائموں کے ذریعے ترتیب کے لحاظ سے ربط کی ثالثی اس نقطہ نظر میں، ترتیب کی توسیع کا رد عمل پولیمریز کے ذریعے نہیں بلکہ ڈی این اے لیگز اور یا تو ایک بیس انکوڈ شدہ تحقیقات یا دو بیس انکوڈ شدہ تحقیقات کے ذریعے انجام دیا جاتا ہے۔ اپنی آسان ترین شکل میں، ایک فلوروسینٹ لیبل شدہ پروب بنیادی ٹیمپلیٹ سے متصل اپنی تکمیلی ترتیب میں ہائبرڈائز ہوتا ہے۔ اس کے بعد ڈی این اے لیگیز کو شامل کیا جاتا ہے تاکہ ڈائی لیبل والی تحقیقات کو پرائمر میں شامل کیا جا سکے۔ غیر لگٹیڈ تحقیقات کو دھویا جاتا ہے، اس کے بعد لگٹیڈ تحقیقات کی شناخت کا تعین کرنے کے لیے فلوروسینس امیجنگ کی جاتی ہے۔ سائیکل کو یا تو فلوروسینٹ ڈائی کو ہٹانے کے لیے کلییو ایبل پروبز کا استعمال کرتے ہوئے دہرایا جا سکتا ہے اور بعد کے لائیگیشن سائیکلوں (چینڈ لائیگیشن) کے لیے 5′-PO4 گروپ کو دوبارہ پیدا کیا جا سکتا ہے یا ٹیمپلیٹ (غیر چینڈ لائیگیشن) میں ایک نئے پرائمر کو ہٹا کر ہائبرڈائز کیا جا سکتا ہے۔ فاسفولینکڈ فلوروسینٹ نیوکلیوٹائڈز یا ریئل ٹائم سیکوینسنگ پیسیفک بائیو سائنسز فی الحال اس طریقہ کار کی قیادت کر رہے ہیں۔ ریئل ٹائم سیکوینسنگ کے طریقہ کار میں ڈی این اے کی ترکیب کے دوران ڈائی لیبلڈ نیوکلیوٹائڈز کی مسلسل شمولیت کی امیجنگ شامل ہے: واحد ڈی این اے پولیمرس مالیکیول انفرادی زیرو موڈ ویو گائیڈ ڈٹیکٹرز (زیڈ ایم ڈبلیو ڈٹیکٹرز) کی نچلی سطح سے منسلک ہوتے ہیں جو ترتیب کی معلومات حاصل کر سکتے ہیں جبکہ فاسفولینکڈ نیوکلیوٹائڈز کو بڑھتے ہوئے پرائمر اسٹرینڈ میں شامل کیا جا رہا ہے۔ پیسیفک بائیو سائنسز ایک منفرد ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کرتا ہے جو فاسفولینکڈ نیوکلیوٹائڈز کو بہتر طریقے سے شامل کرتا ہے اور بند سرکلر ٹیمپلیٹس کی ترتیب کو قابل بناتا ہے۔ جبکہ ایک بار پڑھنے کی درستگی 87 فیصد ہے، کثیر کلو بیس پڑھنے کی لمبائی کے ساتھ 99.999 ٪ پر اتفاق رائے کی درستگی کا مظاہرہ کیا گیا ہے۔ 2015 میں، پیسیفک بائیو سائنسز نے سیکوئل سسٹم کے نام سے ایک نیا سیکوینسنگ انسٹرومنٹ جاری کیا، جو تقریبا 6.5-fold صلاحیت میں اضافہ کرتا ہے۔ کلینیکل میٹاجنومک سیکوینسنگ فرسٹ جنریشن سیکوینسنگ تھرڈ جنریشن سیکوینسنگ آر این اے ویلوسیٹی حوالہ جات ڈی این اے سیکوینسنگ کے طریقے بھی دیکھیں۔