Cell counting
خلیوں کی گنتی زندگی کے علوم میں خلیوں کی گنتی یا اسی طرح کی مقدار کے لیے مختلف طریقوں میں سے کوئی بھی ہے، بشمول طبی تشخیص اور علاج۔ یہ سائٹومیٹری کا ایک اہم ذیلی مجموعہ ہے، جس کا اطلاق تحقیق اور طبی عمل میں ہوتا ہے۔ مثال کے طور پر، خون کی مکمل گنتی ایک معالج کو اس بات کا تعین کرنے میں مدد کر سکتی ہے کہ مریض بیمار کیوں محسوس کرتا ہے اور مدد کے لیے کیا کرنا چاہیے۔ مائع میڈیا کے اندر خلیوں کی گنتی (جیسے خون، پلازما، لمف، یا لیبارٹری رنسیٹ) عام طور پر حجم کے فی یونٹ خلیوں کی تعداد کے طور پر ظاہر کی جاتی ہے، اس طرح ارتکاز کا اظہار ہوتا ہے (مثال کے طور پر، 5,000 خلیات فی ملی لیٹر)۔ استعمال حیاتیات اور طب میں متعدد طریقہ کار کے لیے خلیوں کی گنتی کی ضرورت ہوتی ہے۔ معلوم چھوٹے حجم میں خلیوں کی گنتی سے، ارتکاز میں ثالثی کی جا سکتی ہے۔ خلیوں کی گنتی کی ضرورت کی مثالوں میں شامل ہیں: طب میں، خون کے مختلف خلیوں کا ارتکاز، جیسے سرخ خون کے خلیات اور سفید خون کے خلیات، کسی شخص کی صحت کی صورتحال کے بارے میں اہم معلومات دے سکتے ہیں (دیکھیں: مکمل خون کی گنتی)۔ سیل تھراپی میں، مریض کو دی جانے والی خلیوں کی خوراک کو کنٹرول کرنے کے لیے۔ اسی طرح، خون یا دیگر جسمانی سیالوں میں بیکٹیریا، وائرس اور دیگر پیتھوجینز کا ارتکاز متعدی بیماری کی پیشرفت اور اس کامیابی کی ڈگری کے بارے میں معلومات ظاہر کر سکتا ہے جس سے مدافعتی نظام انفیکشن سے نمٹ رہا ہے۔ سالماتی حیاتیات میں بہت سے تجربات کے لیے خلیوں کے ارتکاز کو جاننے کی ضرورت ہے، تاکہ تجربے میں استعمال ہونے والے ریجینٹس اور کیمیکلز کی مقدار کو اس کے مطابق ایڈجسٹ کیا جا سکے۔ وہ مطالعات جو مائکروجنزموں کی نشوونما کی شرح کا جائزہ لیتے ہیں (دوسرے لفظوں میں، وہ نئے خلیات بنانے کے لیے کتنی تیزی سے تقسیم ہوتے ہیں) خلیوں کی گنتی کی ضرورت ہوتی ہے۔ خلیے کی عملداری کی پیمائش کے طور پر مردہ سے زندہ خلیوں کے حصے کا حساب لگانا، جیسے کہ زہر کے سامنے آنے والے خلیات۔ دستی سیل گنتی سیل گنتی کے کئی طریقے ہیں۔ کچھ قدیم ہیں اور انہیں خصوصی آلات کی ضرورت نہیں ہے، اس طرح یہ کسی بھی حیاتیاتی لیبارٹری میں کیا جا سکتا ہے، جبکہ دیگر جدید ترین الیکٹرانک آلات پر انحصار کرتے ہیں۔ گنتی چیمبر ایک گنتی چیمبر، ایک خوردبین سلائیڈ ہے جو خاص طور پر خلیوں کی گنتی کو فعال کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ ہیموسیٹومیٹر اور سیڈگویک رافٹر گنتی چیمبر دو قسم کے گنتی چیمبر ہیں۔ ہیموسیٹومیٹر کے بیچ میں دو گرڈ والے چیمبر ہوتے ہیں، جو گنتی کرتے وقت شیشے کی ایک خاص سلائیڈ سے ڈھکے ہوتے ہیں۔ سیل کلچر کا ایک قطرہ چیمبر اور شیشے کے احاطے کے درمیان کی جگہ میں رکھا جاتا ہے، جسے کیپلری ایکشن کے ذریعے بھرا جاتا ہے۔ خوردبین کے نیچے نمونے کو دیکھتے ہوئے، محقق گرڈ کا استعمال کرتے ہوئے معلوم سائز کے ایک مخصوص علاقے میں خلیوں کی تعداد کو دستی طور پر شمار کرتا ہے۔ چیمبر اور کور کے درمیان علیحدگی کا فاصلہ پہلے سے طے شدہ ہے، اس طرح گنے ہوئے کلچر کے حجم اور اس کے ساتھ خلیوں کے ارتکاز کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔ سیل کی عملداری کا تعین بھی کیا جا سکتا ہے اگر عملداری رنگوں کو سیال میں شامل کیا جائے۔ ان کا فائدہ سستا اور تیز ہونا ہے ؛ یہ انہیں تیز حیاتیاتی تجربات میں گنتی کا ترجیحی طریقہ بناتا ہے جہاں صرف اس بات کا تعین کرنا ضروری ہے کہ آیا سیل کلچر توقع کے مطابق بڑھا ہے یا نہیں۔ عام طور پر جانچ شدہ کلچر کو پتلا کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، بصورت دیگر خلیوں کی زیادہ کثافت گنتی کو ناممکن بنا دے گی۔ ڈائلیوشن کی ضرورت ایک نقصان ہے کیونکہ ہر ڈائلیوشن پیمائش میں غلطی کا اضافہ کرتا ہے۔ چڑھانا اور سی ایف یو گنتی کلچر میں خلیوں کی تعداد کی مقدار کے لیے، خلیوں کو آسانی سے پیٹری ڈش پر گروتھ میڈیم کے ساتھ چڑھایا جا سکتا ہے۔ اگر خلیات کو پلیٹ پر مؤثر طریقے سے تقسیم کیا جاتا ہے، تو عام طور پر یہ فرض کیا جا سکتا ہے کہ ہر خلیہ ایک کالونی یا کالونی بنانے والی اکائی (سی ایف یو) کو جنم دے گا۔ کالونیوں کو پھر شمار کیا جا سکتا ہے، اور کلچر کے معلوم حجم کی بنیاد پر جو پلیٹ پر پھیلا ہوا تھا، خلیوں کے ارتکاز کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔ یہ اکثر اے ایس ٹی ایم ڈی 5465 معیار کے مطابق کیا جاتا ہے۔ جیسا کہ گنتی کے چیمبروں کے ساتھ ہوتا ہے، ثقافتوں کو عام طور پر چڑھائی سے پہلے بہت زیادہ پتلا کرنے کی ضرورت ہوتی ہے ؛ بصورت دیگر، واحد کالونیاں حاصل کرنے کے بجائے جن کی گنتی کی جا سکتی ہے، ایک نام نہاد "لان" تشکیل پائے گا: ایک دوسرے کے اوپر ہزاروں کالونیاں پڑی ہوں گی۔ مزید برآں، چڑھانا سب سے سست طریقہ ہے: زیادہ تر مائکروجنزموں کو مرئی کالونیاں بنانے کے لیے کم از کم 12 گھنٹے درکار ہوتے ہیں۔ اگرچہ یہ طریقہ وقت طلب ہو سکتا ہے، لیکن یہ قابل عمل خلیوں کی تعداد کا درست تخمینہ دیتا ہے (کیونکہ صرف وہ ہی ترقی کر سکیں گے اور نظر آنے والی کالونیاں بنا سکیں گے)۔ لہذا یہ بڑے پیمانے پر تجربات میں استعمال ہوتا ہے جس کا مقصد منشیات یا دیگر بیرونی حالات کے خلاف مزاحمت کرنے والے خلیوں کی تعداد کی مقدار طے کرنا ہے (مثال کے طور پر لوریا-ڈیلبرک تجربہ یا جینٹامائسن پروٹیکشن اسیسے)۔ اس کے علاوہ، اگر پلیٹوں پر کالونیوں کی گنتی کو کالونی کاؤنٹرز کا استعمال کرکے بہت آسان بنایا جا سکتا ہے۔ خودکار سیل گنتی برقی مزاحمت کولٹر کاؤنٹر ایک ایسا آلہ ہے جو خلیوں کو گننے کے ساتھ ساتھ ان کے حجم کی پیمائش بھی کر سکتا ہے۔ یہ اس حقیقت پر مبنی ہے کہ خلیات زبردست برقی مزاحمت ظاہر کرتے ہیں ؛ دوسرے لفظوں میں، وہ تقریبا کوئی بجلی نہیں چلاتے ہیں۔ کولٹر کاؤنٹر میں خلیات، جو بجلی چلانے والے محلول میں تیرتے ہیں، ایک ایک کر کے ایک چھوٹے سے خلا میں چوس لیے جاتے ہیں۔ اس خلا کے ساتھ دو الیکٹروڈ ہوتے ہیں جو بجلی چلاتے ہیں۔ جب کوئی خلیہ خلا میں نہیں ہوتا ہے، تو بجلی بلا روک ٹوک بہتی ہے، لیکن جب کوئی خلیہ خلا میں چوس لیا جاتا ہے تو کرنٹ مزاحمت کرتا ہے۔ کولٹر کاؤنٹر اس طرح کے واقعات کی تعداد کو شمار کرتا ہے اور کرنٹ (اور اس وجہ سے مزاحمت) کی پیمائش بھی کرتا ہے، جو براہ راست پھنسے ہوئے خلیے کے حجم سے متعلق ہے۔ اسی طرح کا ایک نظام سی اے ایس وائی سیل کاؤنٹنگ ٹیکنالوجی ہے۔ کولٹر اور سی اے ایس وائی کاؤنٹر فلو سائٹومیٹر کے مقابلے میں بہت سستے ہوتے ہیں، اور ان ایپلی کیشنز کے لیے جن میں سیل نمبروں اور سائز کی ضرورت ہوتی ہے، جیسے سیل سائیکل ریسرچ، وہ انتخاب کا طریقہ ہیں۔ مندرجہ بالا طریقوں پر اس کا فائدہ خلیوں کی بڑی تعداد ہے جن پر مختصر وقت میں کارروائی کی جا سکتی ہے، یعنی: فی سیکنڈ ہزاروں خلیات۔ یہ بڑی درستگی اور شماریاتی اہمیت پیش کرتا ہے۔ فلو سائٹومیٹری فلو سائٹومیٹری سیل گنتی کے لیے اب تک کا سب سے نفیس اور مہنگا طریقہ ہے۔ فلو سائٹومیٹر میں خلیات لیزر بیم کے سامنے ایک تنگ ندی میں بہتے ہیں۔ بیم انہیں ایک ایک کر کے مارتا ہے، اور ایک لائٹ ڈیٹیکٹر خلیوں سے جھلکنے والی روشنی کو اٹھاتا ہے۔ فلو سائٹومیٹرز میں بہت سی دوسری صلاحیتیں ہوتی ہیں، جیسے خلیوں کی شکل اور ان کے اندرونی اور بیرونی ڈھانچوں کا تجزیہ کرنے کے ساتھ ساتھ خلیوں میں مخصوص پروٹین اور دیگر بائیو کیمیکلز کی مقدار کی پیمائش کرنا۔ لہذا، فلو سائٹومیٹر شاذ و نادر ہی خلیوں کی گنتی کے واحد مقصد کے لیے خریدے جاتے ہیں۔ تصویری تجزیہ حالیہ نقطہ نظر اعلی معیار کی خوردبین تصاویر کے استعمال پر غور کرتے ہیں جس پر ایک شماریاتی درجہ بندی الگورتھم کو خودکار سیل کا پتہ لگانے اور گنتی کو تصویری تجزیہ کے کام کے طور پر انجام دینے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ عام طور پر آف لائن (بیچ) قسم کے عمل کے طور پر مستقل غلطی کی شرح کے ساتھ انجام دیتا ہے۔ اس مقصد کے لیے تصویر کی درجہ بندی کی متعدد تکنیکیں استعمال کی جا سکتی ہیں۔ دقیانوسی خلیوں کی گنتی اس وقت، غیر جانبدار دقیانوسی گنتی کے قوانین کے مطابق اشیاء کی شمولیت کے لیے دستی فیصلے کے ساتھ دقیانوسی خلیوں کی گنتی ہسٹولوجک ٹشو حصوں میں غیر جانبدار خلیوں کی مقدار کے لیے واحد مناسب طریقہ ہے، اس طرح یہ مکمل طور پر خودکار ہونے کے لیے کافی نہیں ہے۔ بالواسطہ سیل کاؤنٹنگ سپیکٹروفوٹومیٹری سیل سسپنشن خراب ہوتے ہیں۔ خلیے روشنی کو جذب کرتے ہیں اور منتشر کرتے ہیں۔ خلیے کا ارتکاز جتنا زیادہ ہوگا، گندگی اتنی ہی زیادہ ہوگی۔ سپیکٹرو فوٹو میٹر روشنی کی شدت کو بہت درست طریقے سے ناپ سکتے ہیں۔ سیل کلچر کو ایک شفاف کیویٹ میں رکھا جاتا ہے اور جذب کو صرف درمیانے درجے کے مقابلے میں ماپا جاتا ہے۔ آپٹیکل ڈینسٹی (او ڈی) ایک دی گئی حد میں سیل معطلی میں بائیو ماس کے براہ راست متناسب ہے جو سیل کی قسم کے لیے مخصوص ہے۔ کلچرز کی گندگی کی پیمائش کے لیے سپیکٹروفوٹومیٹری کا استعمال کرنا ٹربیڈومیٹری کے نام سے جانا جاتا ہے۔ اس نے سپیکٹرو فوٹومیٹری کو بیکٹیریا کی نشوونما اور متعلقہ ایپلی کیشنز کی پیمائش کے لیے انتخاب کا طریقہ بنا دیا ہے۔ سپیکٹروفوٹومیٹری کی خرابی اس کی مطلق گنتی فراہم کرنے یا زندہ اور مردہ خلیوں کے درمیان فرق کرنے میں ناکامی ہے۔ امپیڈینس مائکروبیولوجی ایک تیز رفتار مائکروبیولوجیکل تکنیک ہے جو نشوونما کے میڈیم کے برقی پیرامیٹرز کی نگرانی کرکے نمونے کے مائکروبیل ارتکاز (بنیادی طور پر بیکٹیریا بلکہ خمیر بھی) کی پیمائش کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ یہ اس حقیقت پر مبنی ہے کہ بیکٹیریا میٹابولزم غیر چارج شدہ (یا کمزور چارج شدہ) مرکبات کو انتہائی چارج شدہ مرکبات میں تبدیل کر دیتا ہے اس طرح نمو درمیانے درجے کی برقی خصوصیات کو تبدیل کر دیتا ہے۔ مائکروبیل ارتکاز کا تخمینہ اس وقت لگایا جاتا ہے جب نگرانی شدہ برقی پیرامیٹرز ابتدائی بیس لائن ویلیو سے ہٹ جاتے ہیں۔ امپیڈینس مائکروبیولوجی کا استعمال کرتے ہوئے بیکٹیریا کے ارتکاز کی پیمائش کے لیے مختلف آلات (یا تو لیبارٹری میں بنائے گئے یا تجارتی طور پر دستیاب) دستیاب ہیں۔ سیل بائیولوجی مالیکیولر بائیولوجی تکنیک لیبارٹری تکنیک