ELISA
انزائم سے منسلک امیونوسوربنٹ جانچ (ELISA) (،) عام طور پر استعمال ہونے والی تجزیاتی بائیو کیمسٹری جانچ ہے، جسے سب سے پہلے 1971 میں ایوا اینگول اور پیٹر پرلمین نے بیان کیا تھا۔ جانچ میں پیمائش کے لیے پروٹین کے خلاف ہدایت شدہ اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے مائع کے نمونے میں لگینڈ (عام طور پر ایک پروٹین) کی موجودگی کا پتہ لگانے کے لیے ایک ٹھوس مرحلے کی قسم کے انزائم امیونواسے (ای آئی اے) کا استعمال کیا جاتا ہے۔ ایلیسا کو طب، پلانٹ پیتھولوجی، اور بائیوٹیکنالوجی میں تشخیصی آلے کے ساتھ ساتھ مختلف صنعتوں میں کوالٹی کنٹرول چیک کے طور پر استعمال کیا گیا ہے۔ ELISA کی سب سے آسان شکل میں، جانچ کیے جانے والے نمونے سے اینٹی جینز کو سطح سے منسلک کیا جاتا ہے۔ پھر، ایک مماثل اینٹی باڈی کو سطح پر لگایا جاتا ہے تاکہ یہ اینٹیجن کو باندھ سکے۔ یہ اینٹی باڈی ایک انزائم سے منسلک ہوتی ہے اور پھر کسی بھی غیر پابند اینٹی باڈی کو ہٹا دیا جاتا ہے۔ آخری مرحلے میں، انزائم کے سبسٹریٹ پر مشتمل ایک مادہ شامل کیا جاتا ہے۔ اگر پابند تھا، تو اس کے بعد کا رد عمل ایک قابل شناخت سگنل پیدا کرتا ہے، عام طور پر رنگ کی تبدیلی۔ ایلیسا انجام دینے میں کم از کم ایک اینٹی باڈی شامل ہوتی ہے جس میں کسی خاص اینٹیجن کی خاصیت ہوتی ہے۔ اینٹیجن کی نامعلوم مقدار کے ساتھ نمونے کو ٹھوس سپورٹ (عام طور پر ایک پولی سٹیرائن مائکرو ٹائٹر پلیٹ) پر یا تو غیر مخصوص طور پر (سطح پر جذب کے ذریعے) یا خاص طور پر (اسی اینٹیجن کے لیے مخصوص کسی دوسرے اینٹی باڈی کے ذریعے، "سینڈوچ" ELISA میں) متحرک کیا جاتا ہے۔ اینٹیجن کے متحرک ہونے کے بعد، پتہ لگانے والی اینٹی باڈی شامل کی جاتی ہے، جس سے اینٹیجن کے ساتھ ایک کمپلیکس بنتا ہے۔ پتہ لگانے والی اینٹی باڈی کو باہمی طور پر کسی انزائم سے جوڑا جا سکتا ہے یا خود ایک ثانوی اینٹی باڈی کے ذریعے پتہ لگایا جا سکتا ہے جو بائیو کنجگیشن کے ذریعے کسی انزائم سے منسلک ہوتا ہے۔ ہر مرحلے کے درمیان، پلیٹ کو عام طور پر ہلکے ڈٹرجنٹ کے محلول سے دھویا جاتا ہے تاکہ کسی بھی پروٹین یا اینٹی باڈیز کو ہٹایا جا سکے جو غیر مخصوص طور پر بندھے ہوئے ہیں۔ دھونے کے آخری مرحلے کے بعد، پلیٹ کو ایک مرئی سگنل پیدا کرنے کے لیے ایک انزیمیٹک سبسٹریٹ شامل کر کے تیار کیا جاتا ہے، جو نمونے میں اینٹیجن کی مقدار کی نشاندہی کرتا ہے۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ ایلیسا سختی سے "امیونو" جانچ کے بجائے لگینڈ بائنڈنگ جانچ کی دیگر شکلیں انجام دے سکتا ہے، حالانکہ اس طریقہ کار کے عام استعمال اور ترقی کی تاریخ کی وجہ سے اس نام میں اصل "امیونو" تھا۔ اس تکنیک کے لیے بنیادی طور پر کسی بھی لگٹنگ ریجینٹ کی ضرورت ہوتی ہے جسے ٹھوس مرحلے پر ایک پتہ لگانے والے ریجینٹ کے ساتھ متحرک کیا جا سکتا ہے جو خاص طور پر باندھے گا اور ایک سگنل پیدا کرنے کے لیے ایک انزائم کا استعمال کرے گا جس کی مناسب مقدار مقرر کی جا سکتی ہے۔ دھونے کے درمیان، صرف لگینڈ اور اس کے مخصوص بائنڈنگ ہم منصبوں ٹھوس مرحلے میں اینٹیجن-اینٹی باڈی تعاملات کے ذریعے خاص طور پر پابند یا "امیونوسوربیڈ" رہتے ہیں، جبکہ غیر مخصوص یا غیر پابند اجزاء دھل جاتے ہیں۔ دیگر سپیکٹروفوٹومیٹرک ویٹ لیب اسیس فارمیٹس کے برعکس جہاں وہی رد عمل اچھی طرح سے (مثال کے طور پر، ایک کیوویٹ) دھونے کے بعد دوبارہ استعمال کیا جا سکتا ہے، ایلیسا پلیٹوں میں رد عمل کی مصنوعات ٹھوس مرحلے پر امیونوسورڈ ہوتی ہیں، جو پلیٹ کا حصہ ہے، اور اس لیے آسانی سے دوبارہ قابل استعمال نہیں ہوتی ہیں۔ اصول ایک تجزیاتی بائیو کیمسٹری اسیسے اور "ویٹ لیب" تکنیک کے طور پر، ایلیسا میں مائع کے نمونے میں ایک تجزیہ کار (یعنی وہ مخصوص مادہ جس کی موجودگی کا مقداری یا معیاری تجزیہ کیا جا رہا ہے) کا پتہ لگانا شامل ہے جو تجزیہ کے دوران مائع ریجینٹس کا استعمال جاری رکھتا ہے (یعنی بائیو کیمیکل رد عمل کی کنٹرول شدہ ترتیب جو ایک سگنل پیدا کرے گی جس کی آسانی سے مقدار کی جا سکتی ہے اور نمونے میں تجزیہ کار کی مقدار کی پیمائش کے طور پر تشریح کی جا سکتی ہے) جو مائع رہتا ہے اور رد عمل کے چیمبر کے اندر رہتا ہے یا رد عمل کو برقرار رکھنے کے لیے اچھی طرح سے درکار ہوتا ہے۔ یہ "ڈرائی لیب" تکنیکوں کے برعکس ہے جو ڈرائی سٹرپس استعمال کرتی ہیں۔ یہاں تک کہ اگر نمونہ مائع ہے (مثال کے طور پر، ایک ناپا ہوا چھوٹا قطرہ)، "خشک" تجزیہ میں حتمی پتہ لگانے کے مرحلے میں ریفلیکٹومیٹری جیسے طریقوں سے خشک پٹی کو پڑھنا شامل ہے اور اس میں نمونوں کے درمیان پھیلنے یا اختلاط کو روکنے کے لیے ری ایکشن کنٹینمنٹ چیمبر کی ضرورت نہیں ہے۔ ایک متفرق جانچ کے طور پر، ELISA کچھ اجزاء کو ایک ٹھوس مرحلے پر جذب کرکے تجزیاتی رد عمل کے مرکب کے کچھ اجزاء کو الگ کرتا ہے جو جسمانی طور پر متحرک ہوتا ہے۔ ELISA میں، ایک مائع کا نمونہ ایک مستحکم ٹھوس مرحلے میں خصوصی بائنڈنگ خصوصیات کے ساتھ شامل کیا جاتا ہے اور اس کے بعد متعدد مائع ریجینٹ ہوتے ہیں جنہیں ترتیب وار شامل کیا جاتا ہے، انکیوبیٹ کیا جاتا ہے، اور دھویا جاتا ہے، اس کے بعد کنویں میں حتمی مائع میں کچھ نظری تبدیلی (مثال کے طور پر، ایک انزیمیٹک رد عمل کے پروڈکٹ کے ذریعہ رنگ کی نشوونما) ہوتی ہے جس سے تجزیہ کی مقدار کی پیمائش کی جاتی ہے۔ مقداری "ریڈنگ" عام طور پر سپیکٹرو فوٹومیٹری کے ذریعے منتقل شدہ روشنی کی شدت کا پتہ لگانے پر مبنی ہوتی ہے، جس میں مائع کے ذریعے روشنی کی کچھ مخصوص طول موج کی ترسیل کی مقدار شامل ہوتی ہے (نیز کنویں کے شفاف نچلے حصے کو ایک سے زیادہ کنویں والی پلیٹ کی شکل میں)۔ پتہ لگانے کی حساسیت کا انحصار تجزیاتی رد عمل کے دوران سگنل کی وسعت پر ہوتا ہے۔ چونکہ انزائم کے رد عمل بہت معروف امپلیفکیشن کے عمل ہیں، اس لیے سگنل انزائموں کے ذریعے پیدا ہوتا ہے جو درست مقدار کی اجازت دینے کے لیے مقررہ تناسب میں پتہ لگانے والے ریجینٹس سے منسلک ہوتے ہیں، اور اس طرح اس کا نام "انزائم سے منسلک" ہے۔ تجزیہ کار کو لگینڈ بھی کہا جاتا ہے کیونکہ یہ خاص طور پر پتہ لگانے والے ریجینٹ سے جڑا ہوا یا جڑا ہوا ہوتا ہے، اس طرح ELISA لگینڈ بائنڈنگ اسیس کے بڑے زمرے میں آتا ہے۔ لگینڈ کے لیے مخصوص بائنڈنگ ریجینٹ کو "متحرک" کیا جاتا ہے، یعنی، عام طور پر شفاف نچلے حصے پر لیپت اور خشک کیا جاتا ہے اور بعض اوقات کنویں کی سائیڈ وال پر بھی خشک کیا جاتا ہے (یہاں مستحکم "ٹھوس مرحلہ"/"ٹھوس سبسٹریٹ" ٹھوس مائکرو پارٹیکل/موتیوں کے برعکس جسے دھویا جا سکتا ہے)، جسے عام طور پر ایک سے زیادہ کنویں والی پلیٹ کے طور پر بنایا جاتا ہے جسے "ایلیسا پلیٹ" کہا جاتا ہے۔ روایتی طور پر، امیونواسس کی دیگر شکلوں کی طرح، اینٹیجن-اینٹی باڈی قسم کے رد عمل کی خاصیت کا استعمال کیا جاتا ہے کیونکہ اینٹی باڈی کو خاص طور پر اینٹیجن کے خلاف ریجینٹ کے طور پر بڑھانا آسان ہے۔ متبادل طور پر، اگر تجزیہ کار خود ایک اینٹی باڈی ہے، تو اس کے ٹارگٹ اینٹیجن کو بائنڈنگ ریجینٹ کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ELISA کی ترقی سے پہلے، امیونواسے کرنے کا واحد آپشن ریڈیو امیونواسے تھا، جو تابکار طور پر لیبل شدہ اینٹی جینز یا اینٹی باڈیز کا استعمال کرنے والی ایک تکنیک ہے۔ ریڈیو امیونواسے میں، تابکاری سگنل فراہم کرتی ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ نمونے میں کوئی مخصوص اینٹیجن یا اینٹی باڈی موجود ہے یا نہیں۔ ریڈیو امیونواسے کو سب سے پہلے 1960 میں شائع ہونے والے ایک سائنسی مقالے میں روزالن سوسمین یالو اور سولومن برسن نے بیان کیا تھا۔ چونکہ تابکاری سے صحت کو ممکنہ خطرہ لاحق ہے، اس لیے ایک محفوظ متبادل تلاش کیا گیا۔ ریڈیو امیونواسے کا ایک مناسب متبادل تابکار سگنل کی جگہ غیر تابکار سگنل کا متبادل ہوگا۔ جب انزائم (جیسے ہارس ڈیش پیرو آکسائیڈیز) مناسب سبسٹریٹس (جیسے اے بی ٹی ایس یا ٹی ایم بی) کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتے ہیں، تو رنگ میں تبدیلی واقع ہوتی ہے، جسے سگنل کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ تاہم، سگنل کو اینٹی باڈی یا اینٹیجن کی موجودگی سے منسلک ہونا پڑتا ہے، یہی وجہ ہے کہ انزائم کو مناسب اینٹی باڈی سے جوڑنا پڑتا ہے۔ یہ جوڑنے کا عمل آزادانہ طور پر سٹریٹس اورامیس اور جی بی نے تیار کیا تھا۔ پیئرس۔ چونکہ دھونے سے کسی بھی غیر پابند اینٹی باڈی یا اینٹیجن کو ہٹانا ضروری ہے، اس لیے اینٹی باڈی یا اینٹیجن کو کنٹینر کی سطح پر لگانا پڑتا ہے ؛ یعنی امیونوسوربنٹ تیار ہونا چاہیے۔ اس کو پورا کرنے کی ایک تکنیک وائڈ اینڈ جرکر پوراتھ نے 1966 میں شائع کی تھی۔ 1971 میں، سویڈن کی اسٹاک ہوم یونیورسٹی میں پیٹر پرلمین اور ایوا اینگول، اور نیدرلینڈز میں انٹون شورس اور باؤک وین ویمین نے آزادانہ طور پر ایسے مقالے شائع کیے جنہوں نے اس علم کو ای آئی اے/ایلیسا انجام دینے کے طریقوں میں ترکیب کیا۔ روایتی ELISA میں عام طور پر کروموجینک رپورٹرز اور سبسٹریٹس شامل ہوتے ہیں جو اینٹیجن یا اینالیٹ کی موجودگی کی نشاندہی کرنے کے لیے کسی قسم کی قابل مشاہدہ رنگ کی تبدیلی پیدا کرتے ہیں۔ ELISA جیسی نئی تکنیکیں قابل قدر سگنلز بنانے کے لیے فلوروجینک، الیکٹرو کیمیلومینسینٹ، اور مقداری پی سی آر رپورٹرز کا استعمال کرتی ہیں۔ ان نئے نامہ نگاروں کے مختلف فوائد ہو سکتے ہیں، جن میں زیادہ حساسیت اور ملٹی پلیکسنگ شامل ہیں۔ تکنیکی لحاظ سے، اس قسم کے نئے تجزیے سختی سے ELISA نہیں ہیں، کیونکہ وہ "انزائم سے منسلک" نہیں ہیں، بلکہ اس کے بجائے کچھ غیر اینزیمیٹک رپورٹر سے منسلک ہیں۔ تاہم، یہ دیکھتے ہوئے کہ ان جانچوں میں عمومی اصول بڑی حد تک ایک جیسے ہیں، انہیں اکثر اسی زمرے میں گروپ کیا جاتا ہے جس میں ELISAs ہوتے ہیں۔ 2012 میں، کروموجینک رپورٹر کے طور پر نینو پارٹیکلز کا استعمال کرتے ہوئے ایک انتہائی حساس، انزائم پر مبنی ELISA ٹیسٹ اینالیٹ کے محض اٹوگرام کا پتہ لگانے سے ننگی آنکھ کا رنگین سگنل دینے میں کامیاب رہا۔ مثبت نتائج کے لیے نیلا رنگ اور منفی کے لیے سرخ رنگ ظاہر ہوتا ہے۔ نوٹ کریں کہ یہ پتہ صرف تجزیہ کی موجودگی یا عدم موجودگی کی تصدیق کر سکتا ہے، نہ کہ اصل ارتکاز کی۔ اقسام خاص مالیکیولز کے لیے بہت سے ELISA ٹیسٹ ہیں جو مماثل اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہیں۔ ایلیسا ٹیسٹوں کو کئی قسم کے ٹیسٹوں میں تقسیم کیا جاتا ہے جس کی بنیاد پر تجزیہ کاروں اور اینٹی باڈیز کو کس طرح بانڈ اور استعمال کیا جاتا ہے۔ اہم اقسام یہاں بیان کی گئی ہیں۔ براہ راست ایلیسا کے مراحل مندرجہ ذیل طریقہ کار کی پیروی کرتے ہیں: اینٹیجن کا ایک بفرڈ حل جس کی جانچ کی جانی ہے اسے مائیکرو ٹائٹر پلیٹ کے ہر کنویں (عام طور پر 96 کنویں والی پلیٹوں) میں شامل کیا جاتا ہے، جہاں اسے چارج تعاملات کے ذریعے پلاسٹک پر قائم رہنے کا وقت دیا جاتا ہے۔ غیر رد عمل والے پروٹین کا ایک محلول، جیسے مویشیوں کے سیرم البیومین یا کیسین، ہر کنویں میں شامل کیا جاتا ہے تاکہ کنویں میں کسی بھی پلاسٹک کی سطح کو ڈھانپا جا سکے جو اینٹیجن کے بغیر باقی رہتی ہے۔ ایک منسلک (کنجوگیٹڈ) انزائم کے ساتھ بنیادی اینٹی باڈی شامل کی جاتی ہے، جو خاص طور پر کنویں کی کوٹنگ کرنے والے ٹیسٹ اینٹیجن سے جڑی ہوتی ہے۔ اس کے بعد اس انزائم کے لیے ایک سبسٹریٹ شامل کیا جاتا ہے۔ اکثر، یہ سبسٹریٹ انزائم کے ساتھ تعامل پر رنگ بدلتا ہے۔ سیرم میں موجود بنیادی اینٹی باڈی کا ارتکاز جتنا زیادہ ہوگا، رنگ اتنا ہی مضبوط تبدیل ہوتا ہے۔ اکثر، رنگ کی طاقت کے لیے مقداری اقدار دینے کے لیے سپیکٹرومیٹر کا استعمال کیا جاتا ہے۔ انزائم ایک امپلیفائر کے طور پر کام کرتا ہے ؛ یہاں تک کہ اگر صرف چند انزائم سے منسلک اینٹی باڈیز پابند رہیں، تو انزائم کے مالیکیول بہت سے سگنل مالیکیول تیار کریں گے۔ عام فہم کی حدود کے اندر، انزائم غیر معینہ مدت تک رنگ پیدا کرتا رہ سکتا ہے، لیکن جتنا زیادہ اینٹی باڈی بندھی جائے گی، رنگ اتنی ہی تیزی سے تیار ہوگا۔ براہ راست ELISA کا ایک بڑا نقصان یہ ہے کہ اینٹیجن امبوبلائزیشن کا طریقہ مخصوص نہیں ہے۔ جب سیرم کو ٹیسٹ اینٹیجن کے منبع کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، تو نمونے میں موجود تمام پروٹین مائیکرو ٹائٹر پلیٹ سے اچھی طرح چپک سکتے ہیں، اس لیے سیرم میں اینالائٹ کی چھوٹی مقدار کو کنویں کی سطح پر پابند ہونے پر دوسرے سیرم پروٹین کے ساتھ مقابلہ کرنا چاہیے۔ سینڈوچ یا بالواسطہ ELISA اس مسئلے کا حل فراہم کرتا ہے، ٹیسٹ اینٹیجن کے لیے مخصوص "کیپچر" اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے اسے سیرم کے سالماتی مرکب سے باہر نکالتا ہے۔ ایلیسا کو کوالٹی یا مقداری شکل میں چلایا جا سکتا ہے۔ کوالٹیٹو نتائج نمونے کے لیے ایک سادہ مثبت یا منفی نتیجہ (ہاں یا نہیں) فراہم کرتے ہیں۔ مثبت اور منفی کے درمیان کٹوف کا تعین تجزیہ کار کرتا ہے اور یہ شماریاتی ہو سکتا ہے۔ دو یا تین گنا معیاری انحراف (ٹیسٹ میں موروثی غلطی) اکثر مثبت اور منفی نمونوں میں فرق کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ مقداری ELISA میں، نمونے کی نظری کثافت (OD) کا موازنہ ایک معیاری منحنی خطوط سے کیا جاتا ہے، جو عام طور پر ہدف مالیکیول کے معروف ارتکاز حل کا سیریل ڈائلیوشن ہوتا ہے۔ مثال کے طور پر، اگر کوئی ٹیسٹ کا نمونہ 1 کا او ڈی واپس کرتا ہے، تو معیاری منحنی خطوط پر وہ نقطہ جس نے او ڈی = 1 دیا ہے، نمونے کی طرح ہی تجزیاتی ارتکاز کا ہونا چاہیے۔ "بالواسطہ ایلیسا" اور "براہ راست ایلیسا" ناموں کا استعمال اور معنی ادب اور ویب سائٹس پر تجربے کے سیاق و سباق کے لحاظ سے مختلف ہوتے ہیں۔ جب کسی اینٹیجن کی موجودگی کا تجزیہ کیا جاتا ہے، تو نام "ڈائریکٹ ایلیسا" سے مراد ایک ایلیسا ہوتا ہے جس میں صرف ایک لیبل شدہ پرائمری اینٹی باڈی استعمال ہوتی ہے، اور اصطلاح "بالواسطہ ایلیسا" سے مراد ایک ایلیسا ہوتا ہے جس میں اینٹیجن پرائمری اینٹی باڈی سے جڑا ہوتا ہے جس کا پتہ ایک لیبل شدہ سیکنڈری اینٹی باڈی سے لگایا جاتا ہے۔ مؤخر الذکر کے معاملے میں سینڈوچ ایلیسا واضح طور پر بالواسطہ ایلیسا سے الگ ہے۔ جب "پرائمری" اینٹی باڈی دلچسپی کا باعث ہوتی ہے، مثال کے طور پر۔ حفاظتی ٹیکوں کے تجزیے کے معاملے میں، اس اینٹی باڈی کا براہ راست ثانوی اینٹی باڈی کے ذریعے پتہ لگایا جاتا ہے اور "بالواسطہ ELISA" کی اصطلاح دو اینٹی باڈیز والی ترتیب پر لاگو ہوتی ہے۔ سینڈوچ ایلیسا اے "سینڈوچ" ایلیسا کا استعمال نمونہ اینٹیجن کا پتہ لگانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ اقدامات یہ ہیں: ایک سطح کیپچر اینٹی باڈی کی معلوم مقدار کے ساتھ تیار کی جاتی ہے۔ سطح پر کسی بھی غیر مخصوص بائنڈنگ سائٹس کو بلاک کر دیا جاتا ہے۔ اینٹیجن پر مشتمل نمونہ پلیٹ پر لگایا جاتا ہے، اور اینٹی باڈی کے ذریعے پکڑا جاتا ہے۔ پلیٹ کو غیر پابند اینٹیجن کو ہٹانے کے لیے دھویا جاتا ہے۔ ایک مخصوص اینٹی باڈی شامل کی جاتی ہے، اور اینٹیجن سے جڑی ہوتی ہے (اس لیے 'سینڈوچ': اینٹیجن دو اینٹی باڈیز کے درمیان پھنس جاتا ہے)۔ یہ بنیادی اینٹی باڈی عطیہ دہندہ کے سیرم میں ہو سکتی ہے، جس کی جانچ اینٹیجن کی طرف رد عمل کے لیے کی جائے گی۔ انزائم سے منسلک ثانوی اینٹی باڈیز کو پتہ لگانے والے اینٹی باڈیز کے طور پر لگایا جاتا ہے، جو خاص طور پر اینٹی باڈی کے ایف سی ریجن (غیر مخصوص) سے جڑے ہوتے ہیں۔ پلیٹ کو غیر پابند اینٹی باڈی-انزیم کنجوگیٹس کو ہٹانے کے لیے دھویا جاتا ہے۔ انزائم کے ذریعے رنگ، فلوروسینٹ، یا الیکٹرو کیمیکل سگنل میں تبدیل کرنے کے لیے ایک کیمیکل شامل کیا جاتا ہے۔ پلیٹ کے کنوؤں کے جذب، فلوروسینس، یا الیکٹرو کیمیکل سگنل (مثال کے طور پر کرنٹ) کو اینٹیجن کی موجودگی اور مقدار کا تعین کرنے کے لیے ماپا جاتا ہے۔ دائیں طرف کی تصویر میں ایک انزائم سے منسلک ثانوی اینٹی باڈی کا استعمال شامل ہے، حالانکہ تکنیکی لحاظ سے یہ ضروری نہیں ہے اگر بنیادی اینٹی باڈی کو کسی انزائم سے منسلک کیا جائے (جو براہ راست ELISA ہوگا)۔ تاہم، ثانوی اینٹی باڈی کنجوگیٹ کا استعمال ہر اینٹیجن کے لیے انزائم سے منسلک اینٹی باڈیز بنانے کے مہنگے عمل سے بچتا ہے جس کا پتہ لگانا چاہے۔ انزائم سے منسلک اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے جو دیگر اینٹی باڈیز کے ایف سی خطے کو باندھتا ہے، اسی انزائم سے منسلک اینٹی باڈی کو مختلف حالات میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔ "کیپچر" اینٹی باڈی کی پہلی پرت کے بغیر، نمونے میں موجود کوئی بھی پروٹین (بشمول سیرم پروٹین) مسابقتی طور پر پلیٹ کی سطح پر جذب ہو سکتا ہے، جس سے متحرک اینٹیجن کی مقدار کم ہو جاتی ہے۔ اینٹیجن کو پلاسٹک سے جوڑنے کے لیے صاف شدہ مخصوص اینٹی باڈی کا استعمال پیمائش سے پہلے پیچیدہ مرکب سے اینٹیجن کو صاف کرنے کی ضرورت کو ختم کرتا ہے، جانچ کو آسان بناتا ہے، اور جانچ کی خاصیت اور حساسیت کو بڑھاتا ہے۔ لہذا، تحقیق کے لیے استعمال ہونے والے سینڈوچ ELISA کو اکثر توثیق کی ضرورت ہوتی ہے، تاکہ غلط مثبت نتائج کے خطرے کو کم کیا جا سکے۔ مسابقتی ایلیسا ایلیسا کا تیسرا استعمال مسابقتی پابند کے ذریعے ہوتا ہے۔ اس ELISA کے اقدامات پہلی دو مثالوں سے کچھ مختلف ہیں: غیر لیبل شدہ اینٹی باڈی کو اس کے اینٹیجن (نمونے) کی موجودگی میں انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ ان باؤنڈ اینٹی باڈیز/اینٹیجن کمپلیکس کو پھر اینٹیجن لیپت کنویں میں شامل کیا جاتا ہے۔ پلیٹ کو دھویا جاتا ہے، اس لیے غیر پابند اینٹی باڈیز کو ہٹا دیا جاتا ہے۔ (نمونے میں جتنا زیادہ اینٹیجن ہوتا ہے، اتنا ہی زیادہ اے جی-اب کمپلیکس بنتے ہیں اور اس لیے کنویں میں اینٹیجن سے جڑے رہنے کے لیے کم غیر پابند اینٹی باڈیز دستیاب ہوتی ہیں، اس لیے "مقابلہ" ہوتا ہے۔) ثانوی اینٹی باڈی، جو بنیادی اینٹی باڈی کے لیے مخصوص ہوتی ہے، شامل کی جاتی ہے۔ یہ دوسرا اینٹی باڈی انزائم سے جڑا ہوتا ہے۔ ایک سبسٹریٹ شامل کیا جاتا ہے، اور باقی انزائم ایک کروموجینک یا فلوروسینٹ سگنل خارج کرتے ہیں۔ سگنل کی حتمی سیچوریشن کو روکنے کے لیے رد عمل کو روک دیا جاتا ہے۔ کچھ مسابقتی ELISA کٹس میں انزائم سے منسلک اینٹی باڈی کے بجائے انزائم سے منسلک اینٹیجن شامل ہیں۔ لیبل شدہ اینٹیجن نمونہ اینٹیجن (غیر لیبل شدہ) کے ساتھ بنیادی اینٹی باڈی بائنڈنگ سائٹس کے لیے مقابلہ کرتا ہے۔ نمونے میں اینٹیجن جتنا کم ہوتا ہے، اتنا ہی زیادہ لیبل والا اینٹیجن کنویں میں برقرار رہتا ہے اور سگنل اتنا ہی مضبوط ہوتا ہے۔ عام طور پر، اینٹیجن کو پہلے کنویں میں نہیں رکھا جاتا ہے۔ ایچ آئی وی اینٹی باڈیز کا پتہ لگانے کے لیے مائیکرو ٹائٹر پلیٹ کے کنوؤں کو ایچ آئی وی اینٹیجن سے لیپت کیا جاتا ہے۔ دو مخصوص اینٹی باڈیز کا استعمال کیا جاتا ہے، ایک انزائم کے ساتھ منسلک ہوتا ہے اور دوسرا سیرم میں موجود ہوتا ہے (اگر سیرم اینٹی باڈی کے لیے مثبت ہے)۔ ایک ہی اینٹیجن کے لیے دو اینٹی باڈیز کے درمیان مجموعی مقابلہ ہوتا ہے، جس کی وجہ سے ایک مضبوط سگنل دیکھا جاتا ہے۔ جانچنے کے لیے ان کنوؤں میں سیرا ملایا جاتا ہے اور 37 ڈگری سیلسیس پر انکیوبیٹ کیا جاتا ہے، اور پھر دھویا جاتا ہے۔ اگر اینٹی باڈیز موجود ہوں تو اینٹیجن-اینٹی باڈی رد عمل ہوتا ہے۔ انزائم لیبل والے مخصوص ایچ آئی وی اینٹی باڈیز کے لیے کوئی اینٹیجن نہیں بچا ہے۔ یہ اینٹی باڈیز شامل ہونے پر آزاد رہتی ہیں اور دھونے کے دوران دھولی جاتی ہیں۔ سبسٹریٹ شامل کیا جاتا ہے، لیکن اس پر عمل کرنے کے لیے کوئی انزائم نہیں ہوتا ہے، اس لیے مثبت نتیجہ رنگ کی تبدیلی نہیں دکھاتا ہے۔ ریورس ایلیسا (بالواسطہ ایلیسا) ایک چوتھا ایلیسا ٹیسٹ روایتی کنوؤں کا استعمال نہیں کرتا ہے۔ یہ ٹیسٹ اینٹی جینز کو ٹیسٹ فلوئڈ میں معطل کر دیتا ہے۔ غیر لیبل شدہ اینٹی باڈی کو اس کے اینٹیجن (نمونے) کی موجودگی میں انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ اینٹی باڈیز کو اینٹی جینز سے جڑے رہنے کی اجازت دینے کے لیے کافی انکیوبیشن مدت فراہم کی جاتی ہے۔ اس کے بعد نمونے کو سکاوینجر کنٹینر سے گزارا جاتا ہے۔ یہ ایک ٹیسٹ ٹیوب یا چینل کے ذریعے خصوصی طور پر ڈیزائن کردہ بہاؤ ہو سکتا ہے۔ سکاوینجر کنٹینر یا چینل کی سطح پر "سکاوینجر اینٹیجینز" جڑے ہوتے ہیں۔ یہ بنیادی اینٹی جینز سے ملتے جلتے یا کافی حد تک ملتے جلتے ہو سکتے ہیں جنہیں آزاد اینٹی باڈیز باندھ لیں گے۔ صفائی کرنے والے کنٹینر کے پاس کافی سطح کا رقبہ اور کافی وقت ہونا چاہیے تاکہ صفائی کرنے والے اینٹی جینز نمونے میں داخل کیے گئے تمام اضافی اینٹی باڈیز سے جڑے رہیں۔ نمونہ، جس میں اب ٹیگ شدہ اور پابند اینٹی باڈیز ہوتے ہیں، ایک ڈٹیکٹر سے گزرتا ہے۔ یہ آلہ فلو سائٹومیٹر یا دوسرا آلہ ہو سکتا ہے جو ٹیگز کو روشن کرتا ہے اور ردعمل کو رجسٹر کرتا ہے۔ یہ ٹیسٹ ایک ہی وقت میں متعدد اینٹی جینز کو ٹیگ کرنے اور گننے کی اجازت دیتا ہے۔ یہ بیکٹیریا کے مخصوص تناؤ کو دو (یا زیادہ) مختلف رنگوں کے ٹیگز کے ذریعے شناخت کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ اگر دونوں ٹیگز کسی خلیے پر موجود ہیں، تو خلیہ وہ مخصوص تناؤ ہے۔ اگر صرف ایک موجود ہے، تو ایسا نہیں ہے۔ یہ ٹیسٹ عام طور پر ایک وقت میں ایک ٹیسٹ کیا جاتا ہے اور مائیکرو ٹائٹر پلیٹ کے ساتھ نہیں کیا جا سکتا۔ مطلوبہ سامان عام طور پر کم پیچیدہ ہوتا ہے اور اسے کھیت میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔ عام طور پر استعمال ہونے والے انزیمیٹک مارکر درج ذیل جدول میں عام طور پر ELISA جانچ میں استعمال ہونے والے انزیمیٹک مارکر کی فہرست دی گئی ہے، جو جانچ کے نتائج کو تکمیل پر ناپنے کی اجازت دیتے ہیں۔ او پی ڈی (او-فینائلینیڈیمین ڈائیڈروکلورائڈ) ایچ آر پی (ہارسرڈیش پیرو آکسائیڈیز) کا پتہ لگانے کے لیے امبر کا رخ کرتا ہے، جو اکثر ایک مربوط پروٹین کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ ٹی ایم بی (3,3 '، 5,5'-tetramethylbenzidine) ایچ آر پی کا پتہ لگانے پر نیلا ہو جاتا ہے اور سلفورک یا فاسفورک ایسڈ کے اضافے کے بعد پیلا ہو جاتا ہے۔ ایچ آر پی کا پتہ لگانے پر اے بی ٹی ایس (2,2 '-ایزینوبس [3-ایتھائل بینزوتھیازولین-6-سلفونک ایسڈ]-ڈیامونیم سالٹ) سبز ہو جاتا ہے۔ الکلائن فاسفیٹیس کا پتہ لگانے پر پی این پی پی (پی-نائٹروفینائل فاسفیٹ، ڈسوڈیم سالٹ) پیلا ہو جاتا ہے۔ ایپلی کیشنز کیونکہ ELISA کسی نمونے میں اینٹیجن کی موجودگی یا اینٹی باڈی کی موجودگی کا اندازہ کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے، یہ سیرم اینٹی باڈی کے ارتکاز (جیسے ایچ آئی وی ٹیسٹ یا ویسٹ نیل وائرس) کا تعین کرنے کے لیے ایک مفید ٹول ہے۔ اس نے کھانے کی صنعت میں ممکنہ کھانے کی الرجین، جیسے دودھ، مونگ پھلی، اخروٹ، بادام، اور انڈوں کا پتہ لگانے اور سیلیاک بیماری کے لیے خون کے سیرولوجیکل ٹیسٹ کے طور پر بھی استعمال پایا ہے۔ ایلیسا کو ٹاکسیکولوجی میں بعض قسم کی دوائیوں کے لیے تیز رفتار تخیلاتی اسکرین کے طور پر بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ایلیسا پہلا اسکریننگ ٹیسٹ تھا جو ایچ آئی وی کے لیے اس کی اعلی حساسیت کی وجہ سے بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا تھا۔ ایلیسا میں، ایک شخص کے سیرم کو 400 بار پتلا کیا جاتا ہے اور ایک پلیٹ پر لگایا جاتا ہے جس سے ایچ آئی وی اینٹیجن منسلک ہوتے ہیں۔ اگر ایچ آئی وی کے اینٹی باڈیز سیرم میں موجود ہیں، تو وہ ان ایچ آئی وی اینٹی جینز سے منسلک ہو سکتے ہیں۔ اس کے بعد سیرم کے دیگر تمام اجزاء کو ہٹانے کے لیے پلیٹ کو دھویا جاتا ہے۔ ایک خاص طور پر تیار کردہ "ثانوی اینٹی باڈی"-ایک اینٹی باڈی جو دوسرے اینٹی باڈیز سے جڑی ہوتی ہے-پھر پلیٹ پر لگائی جاتی ہے، اس کے بعد دوسرا دھونا ہوتا ہے۔ یہ ثانوی اینٹی باڈی کیمیائی طور پر ایک انزائم سے پہلے سے منسلک ہوتی ہے۔ اس طرح، پلیٹ میں پلیٹ سے منسلک ثانوی اینٹی باڈی کی مقدار کے تناسب سے انزائم ہوگا۔ انزائم کے لیے ایک سبسٹریٹ لگایا جاتا ہے، اور انزائم کے ذریعے اتپریرک رنگ یا فلوروسینس میں تبدیلی کا باعث بنتا ہے۔ ایلیسا کے نتائج کو ایک نمبر کے طور پر رپورٹ کیا جاتا ہے ؛ اس ٹیسٹ کا سب سے متنازعہ پہلو مثبت اور منفی نتائج کے درمیان "کٹ آف" پوائنٹ کا تعین کرنا ہے۔ کٹ آف پوائنٹ کا تعین کسی معروف معیار کے ساتھ موازنہ کرکے کیا جا سکتا ہے۔ اگر کام کی جگہ پر منشیات کی جانچ کے لیے ایلیسا ٹیسٹ استعمال کیا جاتا ہے، تو مثال کے طور پر، ایک کٹ آف کنسنٹریشن، 50 این جی/ملی لیٹر قائم کیا جاتا ہے، اور اینالیٹ کے معیاری کنسنٹریشن پر مشتمل نمونہ تیار کیا جائے گا۔ نامعلوم جو معلوم نمونے سے زیادہ مضبوط سگنل پیدا کرتے ہیں وہ "مثبت" ہوتے ہیں۔ جو کمزور سگنل پیدا کرتے ہیں وہ "منفی" ہوتے ہیں۔ مختلف قسم کی بیماریوں، جیسے ڈینگی، ملیریا، چاگاس بیماری، جوہن کی بیماری، اور دیگر کا پتہ لگانے کے لیے ایلیسا ٹیسٹ ہیں۔ طبی لیبارٹریوں میں ان وٹرو تشخیص کے لیے ایلیسا ٹیسٹ بھی بڑے پیمانے پر استعمال کیے جاتے ہیں۔ ELISA کے دیگر استعمالات میں شامل ہیں: خون کے نمونوں میں SARS-CoV-2 اینٹی باڈیز کا پتہ لگانا بھی دیکھیں۔ میگنیٹک امیونواسے مائیکرو ٹائٹر پلیٹ نیفیلومیٹری پلاک ریڈکشن نیوٹرلائزیشن ٹیسٹ پلیٹ ریڈر سکریشن اسیسے نوٹ اور حوالہ جات بیرونی لنکس "ELISA سرگرمی کا تعارف"-ایچ آئی وی کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہونے والے ELISA کے ابتدائی واک تھرو، بشمول ایریزونا یونیورسٹی میں متحرک تصاویر "ELISA اسیسے اصول"-ELISA کے اصول کا ایک جائزہ اور اسیسے جینی تشخیصی وائرولوجی امیونولوجیک ٹیسٹوں میں تجزیہ کا پتہ لگانے کے لیے ٹولز۔