Electrophoretic mobility shift assay
الیکٹروفوریٹک موبلٹی شفٹ اسیسے (ای ایم ایس اے) یا موبلٹی شفٹ الیکٹروفورسس، جسے جیل شفٹ اسیسے، جیل موبلٹی شفٹ اسیسے، بینڈ شفٹ اسیسے، یا جیل ریٹرڈیشن اسیسے بھی کہا جاتا ہے، ایک عام وابستگی الیکٹروفورسس تکنیک ہے جو پروٹین-ڈی این اے یا پروٹین-آر این اے تعاملات کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ یہ طریقہ کار اس بات کا تعین کر سکتا ہے کہ آیا پروٹین یا پروٹین کا مرکب کسی دی گئی ڈی این اے یا آر این اے ترتیب کے پابند ہونے کی صلاحیت رکھتا ہے، اور بعض اوقات اس بات کی نشاندہی کر سکتا ہے کہ بائنڈنگ کمپلیکس میں ایک سے زیادہ پروٹین مالیکیول شامل ہیں یا نہیں۔ جیل شفٹ اسیسز اکثر وٹرو میں ڈی این ایز فٹ پرنٹنگ، پرائمر ایکسٹینشن، اور پروموٹر تحقیقات کے تجربات کے ساتھ بیک وقت انجام دی جاتی ہیں جب ٹرانسکرپشن کی شروعات، ڈی این اے گینگ ریپلیکیشن، ڈی این اے مرمت یا آر این اے پروسیسنگ اور پختگی کے ساتھ ساتھ پری-ایم آر این اے اسپلیسنگ کا مطالعہ کیا جاتا ہے۔ اگرچہ پیش رو ابتدائی ادب میں پائے جا سکتے ہیں، لیکن زیادہ تر موجودہ تشخیص گارنر اور ریوزین اور فرائیڈ اور کروتھرس کے بیان کردہ طریقوں پر مبنی ہیں۔ اصول ایک موبلٹی شفٹ اسیسے ایک پروٹین-ڈی این اے یا پروٹین-آر این اے مرکب کو پولی ایکریلامائڈ یا اگاروز جیل پر مختصر مدت کے لیے (15 سے 20 سینٹی میٹر جیل کے لیے تقریبا 1.5-2 ایچ آر) الیکٹروفوریٹک علیحدگی ہے۔ جس رفتار سے مختلف مالیکیول (اور اس کے امتزاج) جیل کے ذریعے حرکت کرتے ہیں اس کا تعین ان کے سائز اور چارج سے ہوتا ہے، اور کم حد تک، ان کی شکل (جیل الیکٹروفورسس دیکھیں)۔ کنٹرول لین (پروٹین کے بغیر ڈی این اے تحقیقات) میں ایک واحد بینڈ ہوگا جو غیر پابند ڈی این اے یا آر این اے ٹکڑے سے مطابقت رکھتا ہے۔ تاہم، یہ فرض کرتے ہوئے کہ پروٹین ٹکڑے سے جڑے رہنے کی صلاحیت رکھتا ہے، پروٹین کے ساتھ موجود لین میں ایک اور بینڈ ہوگا جو پروٹین سے جڑے نیوکلک ایسڈ پروب کے بڑے، کم متحرک کمپلیکس کی نمائندگی کرتا ہے جو جیل پر 'منتقل' ہوتا ہے (چونکہ یہ زیادہ آہستہ آہستہ منتقل ہوا ہے)۔ درست تجرباتی حالات کے تحت، ڈی این اے (یا آر این اے) اور پروٹین کے درمیان تعامل مستحکم ہوتا ہے اور جیل پر غیر پابند نیوکلک ایسڈ کے پابند ہونے کا تناسب آزاد اور پابند پروب مالیکیولز کے حصے کی عکاسی کرتا ہے جیسے ہی پابند ردعمل جیل میں داخل ہوتا ہے۔ یہ استحکام جزوی طور پر "کیجنگ ایفیکٹ" کی وجہ سے ہے، اس میں پروٹین، جو جیل میٹرکس سے گھرا ہوا ہے، دوبارہ ملنے سے پہلے تحقیقات سے دور پھیلنے سے قاصر ہے۔ اگر پروٹین اور پروب کی ابتدائی ارتکاز معلوم ہو، اور اگر کمپلیکس کی اسٹوچیومیٹری معلوم ہو، تو نیوکلک ایسڈ کی ترتیب کے لیے پروٹین کی ظاہری وابستگی کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ جب تک کہ کمپلیکس جیل کے حالات میں بہت طویل عرصے تک زندہ نہ رہے، یا الیکٹروفورسس کے دوران علیحدگی کو مدنظر نہ رکھا جائے، اخذ کردہ نمبر ایک واضح Kd ہے۔ اگر پروٹین کا ارتکاز معلوم نہیں ہے لیکن پیچیدہ اسٹوچیومیٹری ہے، تو پروٹین کے ارتکاز کا تعین ڈی این اے تحقیقات کے ارتکاز کو بڑھا کر کیا جا سکتا ہے جب تک کہ مزید اضافہ پروٹین کے پابند حصے میں اضافہ نہ کرے۔ ایک ہی جیل پر چلنے والے فری پروب کے معیاری ڈائلیوشن کے سیٹ کے مقابلے میں، پروٹین کے مولز کی تعداد کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔ متغیرات اور اضافے ایک اینٹی باڈی جو پروٹین کو پہچانتی ہے اس مرکب میں شامل کی جا سکتی ہے تاکہ زیادہ شفٹ کے ساتھ اس سے بھی بڑا کمپلیکس بنایا جا سکے۔ اس طریقہ کو سپر شفٹ جانچ کہا جاتا ہے، اور اسے پروٹین-نیوکلک ایسڈ کمپلیکس میں موجود پروٹین کی غیر واضح طور پر شناخت کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ اکثر، بائنڈنگ پروٹین کے لیے سب سے زیادہ سازگار بائنڈنگ سیکوینس کا تعین کرنے کے لیے ایک اضافی لین کو حریف اولیگونیوکلیوٹائڈ کے ساتھ چلایا جاتا ہے۔ متعین ترتیب کے مختلف اولیگونیوکلیوٹائڈز کا استعمال مسابقت کے ذریعہ عین مطابق بائنڈنگ سائٹ کی شناخت کی اجازت دیتا ہے (خاکہ میں نہیں دکھایا گیا ہے)۔ مسابقتی جانچ کے متغیرات بائنڈنگ کی خاصیت کی پیمائش اور ایسوسی ایشن اور علیحدگی کی حرکیات کی پیمائش کے لیے مفید ہیں۔ اس طرح، ای ایم ایس اے کو سلیکس تجربے کے حصے کے طور پر بھی استعمال کیا جا سکتا ہے تاکہ اولیگونیوکلیوٹائڈز کا انتخاب کیا جا سکے جو دراصل کسی دیئے گئے پروٹین کو باندھتے ہیں۔ ایک بار جب ڈی این اے-پروٹین بائنڈنگ کا تعین وٹرو میں کیا جاتا ہے، تو متعدد الگورتھم ٹرانسکرپشن فیکٹر کی شناخت کے لیے تلاش کو تنگ کر سکتے ہیں۔ دلچسپی کے ٹرانسکرپشن عنصر کے لیے اتفاق رائے کی ترتیب اولیگونیوکلیوٹائڈز بائنڈنگ کے لیے مقابلہ کرنے کے قابل ہوں گے، منتقل شدہ بینڈ کو ختم کر دیں گے، اور اس کی تصدیق سپر شفٹ کے ذریعے کی جانی چاہیے۔ اگر پیش گوئی شدہ اتفاق رائے کی ترتیب بائنڈنگ کے لیے مقابلہ کرنے میں ناکام رہتی ہے، تو ٹرانسکرپشن فیکٹر کی شناخت میں ملٹی پلیکسڈ کمپٹیٹر ای ایم ایس اے (ایم سی-ای ایم ایس اے) کی مدد مل سکتی ہے، جس کے تحت ہر رد عمل میں اتفاق رائے کی ترتیب کے بڑے سیٹوں کو ملٹی پلیکس کیا جاتا ہے، اور جہاں ایک سیٹ بائنڈنگ کے لیے مقابلہ کرتا ہے، اس سیٹ سے انفرادی اتفاق رائے کی ترتیب کو مزید رد عمل میں چلایا جاتا ہے۔ تصور کے مقاصد کے لیے، نیوکلک ایسڈ کے ٹکڑے کو عام طور پر تابکار، فلوروسینٹ یا بائیوٹن لیبل کے ساتھ لیبل کیا جاتا ہے۔ معیاری ایتھیڈیم برومائڈ سٹیننگ ان طریقوں کے مقابلے میں کم حساس ہے اور اگر ان تجربات میں نیوکلک ایسڈ یا سنگل اسٹرینڈڈ نیوکلک ایسڈ کی تھوڑی مقدار استعمال کی جائے تو نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے لیے حساسیت کی کمی ہو سکتی ہے۔ بائیوٹن لیبل کا استعمال کرتے وقت، ڈی این اے کے ٹکڑے کا پتہ لگانے کے لیے ہارس ڈیش پیرو آکسائیڈیز جیسے انزائم سے منسلک سٹریپٹا ویڈن کا استعمال کیا جاتا ہے۔ اگرچہ آئسوٹوپک ڈی این اے لیبلنگ کا پروٹین بائنڈنگ وابستگی پر بہت کم یا کوئی اثر نہیں پڑتا ہے، لیکن غیر آئسوٹوپک لیبلز بشمول فلوفورز یا بائیوٹن کا استعمال دلچسپی کے پروٹین کے تعامل کی وابستگی اور/یا اسٹیوچیومیٹری کو تبدیل کر سکتا ہے۔ فلورفور-یا بائیوٹن-لیبلڈ پروب اور اسی ترتیب کے غیر لیبلڈ ڈی این اے کے درمیان مقابلہ اس بات کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے کہ آیا لیبل بائنڈنگ وابستگی یا اسٹیوچیومیٹری کو تبدیل کرتا ہے۔ حوالہ جات بیرونی روابط کیمیلومینسینٹ جیل شفٹ پروٹوکول جینیات تکنیک سالماتی جینیات سالماتی حیاتیات پروٹین طریقے پروٹومیکس تجزیاتی کیمسٹری لیبارٹری تکنیک الیکٹروفورسس حیاتیاتی تکنیک اور اوزار