Primer walking
پرائمر واکنگ ایک ایسی تکنیک ہے جو کسی جین (مثال کے طور پر بیماری کے جین) کو اس کے معروف قریبی مارکر (مثال کے طور پر معروف جین) سے کلون کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ نتیجے کے طور پر، یہ پودوں، پھپھوندی اور ممالیہ جانوروں میں معمولی تبدیلیوں کے ساتھ کلوننگ اور ترتیب کی کوششوں میں استعمال ہوتا ہے۔ یہ تکنیک، جسے "ڈائریکٹڈ سیکوینسنگ" بھی کہا جاتا ہے، سینگر سیکوینسنگ رد عمل کی ایک سیریز کو استعمال کرتی ہے تاکہ یا تو حوالہ ترتیب (ترتیب کی تصدیق سروس) کی بنیاد پر کسی معروف پلاسمڈ یا پی سی آر پروڈکٹ کے حوالہ ترتیب کی تصدیق کی جا سکے یا مکمل پلاسمڈ یا پی سی آر پروڈکٹ کی نامعلوم ترتیب کو دریافت کیا جا سکے۔ پرائمر واکنگ: ڈی این اے سیکوینسنگ کا طریقہ پرائمر واکنگ 1.3-7.0 kb رینج تک ڈی این اے کی ترتیب کا تعین کرنے کا ایک طریقہ ہے جبکہ کروموسوم واکنگ جین کے پہلے سے معلوم ترتیبات کے کلون تیار کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ بہت لمبے ٹکڑوں کو زنجیر ختم کرنے کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے ایک ہی ترتیب میں نہیں پڑھا جا سکتا۔ یہ طریقہ طویل ترتیب کو کئی مسلسل مختصر ترتیبوں میں تقسیم کرکے کام کرتا ہے۔ دلچسپی کا ڈی این اے پلازمیڈ انسٹر، پی سی آر پروڈکٹ یا جینوم کی ترتیب دیتے وقت خلا کی نمائندگی کرنے والا ٹکڑا ہو سکتا ہے۔ "پرائمر واکنگ" کی اصطلاح استعمال کی جاتی ہے جہاں بنیادی مقصد جینوم کی ترتیب دینا ہوتا ہے۔ اس کے بجائے "کروموسوم واکنگ" کی اصطلاح اس وقت استعمال ہوتی ہے جب ترتیب معلوم ہوتی ہے لیکن جین کا کوئی کلون نہیں ہوتا ہے۔ مثال کے طور پر، کسی بیماری کے لیے جین ایک مخصوص مارکر کے قریب واقع ہو سکتا ہے جیسے کہ ترتیب پر آر ایف ایل پی۔ کروموسوم واکنگ ایک ایسی تکنیک ہے جو کسی جین (مثال کے طور پر بیماری کے جین) کو اس کے معروف قریبی مارکر (مثال کے طور پر معروف جین) سے کلون کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے اور اس لیے اسے پودوں، فنگی اور جانوروں میں کلوننگ اور ترتیب کے منصوبوں میں اعتدال پسند ترمیم میں استعمال کیا جاتا ہے۔ دوسرے الفاظ میں، اس کا استعمال نقشہ سازی کے لیے جین کے قریب موجود ایک مخصوص ترتیب کو تلاش کرنے، الگ کرنے اور کلون کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ بڑے ٹکڑوں کی لائبریریاں، بنیادی طور پر بیکٹیریل مصنوعی کروموسوم لائبریریاں، زیادہ تر جینومک منصوبوں میں استعمال ہوتی ہیں۔ مطلوبہ کالونی کی شناخت کرنے اور کسی خاص کلون کو منتخب کرنے کے لیے لائبریری کو پہلے مطلوبہ تحقیقات کے ساتھ اسکرین کیا جاتا ہے۔ اسکریننگ کے بعد، کلون کو تحقیقات کے ساتھ اوور لیپ کیا جاتا ہے اور اوور لیپنگ ٹکڑوں کی نقشہ سازی کی جاتی ہے۔ اس کے بعد ان ٹکڑوں کو دیگر کلونوں کی شناخت کے لیے ایک نئی تحقیقات (کلون کے 3 ′ یا 5 ′ سروں سے حاصل کردہ مختصر ڈی این اے کے ٹکڑے) کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ ایک لائبریری تقریبا 96 کلون پر مشتمل ہوتی ہے اور ہر کلون میں ایک مختلف اندراج ہوتا ہے۔ پروب ون λ1 اور λ2 کی شناخت کرتا ہے کیونکہ یہ ان کو اوورلیپ کرتا ہے۔ λ2 کلون سے ماخوذ پروب ٹو کا استعمال λ3 وغیرہ کی شناخت کے لیے کیا جاتا ہے۔ کلون کی سمت کا تعین کلون کی پابندی کی نقشہ سازی سے ہوتا ہے۔ اس طرح جین کے آس پاس موجود نئے کروموسومل علاقوں کی شناخت کی جا سکتی ہے۔ کروموسوم چلنا وقت طلب ہے، اور کروموسوم لینڈنگ جین کی شناخت کے لیے انتخاب کا طریقہ ہے۔ اس طریقہ کار کے لیے ایک ایسے مارکر کی دریافت کی ضرورت ہوتی ہے جو متغیر لوکس سے مضبوطی سے متعلق ہو۔ ٹکڑے کو پہلے ترتیب دیا جاتا ہے گویا یہ ایک چھوٹا ٹکڑا ہو۔ ترتیب ہر سرے سے یونیورسل پرائمرز یا خاص طور پر ڈیزائن کردہ کا استعمال کرتے ہوئے انجام دی جاتی ہے۔ اس سے پہلے 1000 یا اس سے زیادہ اڈوں کی شناخت ہونی چاہیے۔ دلچسپی کے علاقے کو مکمل طور پر ترتیب دینے کے لیے، ملحقہ ترتیب کی معلومات حاصل کرنے کے لیے نئے پرائمرز (معلوم ترتیب کے آخری 20 اڈوں کی تکمیل) کا ڈیزائن اور ترکیب ضروری ہے۔ پرائمر واکنگ بمقابلہ شاٹگن سیکوینسنگ پرائمر واکنگ ڈائریکٹڈ سیکوینسنگ کی ایک مثال ہے کیونکہ پرائمر کو ڈی این اے کے ایک معروف علاقے سے ڈیزائن کیا گیا ہے تاکہ ترتیب کو ایک مخصوص سمت میں رہنمائی کی جا سکے۔ ہدایت شدہ ترتیب کے برعکس، ڈی این اے کی شاٹگن ترتیب ایک زیادہ تیز ترتیب کی حکمت عملی ہے۔ جینوم سیکوینسنگ کی "پرانے زمانے" کی ایک تکنیک ہے۔ ترتیب کے لیے بنیادی طریقہ سینگر چین ٹرمینیشن طریقہ ہے جس میں 100 اور 1000 بیس پیئرز (استعمال شدہ آلات پر منحصر ہے) کے درمیان پڑھنے کی لمبائی ہو سکتی ہے۔ اس کا مطلب ہے کہ آپ کو لمبے ڈی این اے مالیکیولز کو توڑنا ہوگا، کلون کرنا ہوگا اور بعد میں ان کی ترتیب دینی ہوگی۔ دو طریقے ممکن ہیں۔ پہلے کو کروموسوم (یا پرائمر) چلنا کہا جاتا ہے اور پہلے ٹکڑے کی ترتیب کے ساتھ شروع ہوتا ہے۔ ترتیب کے اگلے (ملحقہ) ٹکڑے کو پھر ایک پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا جاتا ہے جو پہلی ترتیب کے اختتام کی تکمیل کرتا ہے وغیرہ۔ اس تکنیک کو زیادہ جمع کرنے کی ضرورت نہیں ہے، لیکن آپ کو بہت سارے پرائمرز کی ضرورت ہے اور یہ نسبتا سست ہے۔ اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے شاٹگن سیکوینسنگ کا طریقہ تیار کیا گیا۔ یہاں ڈی این اے کو مختلف ٹکڑوں میں توڑا جاتا ہے (سبھی ایک ہی جگہ پر نہیں توڑے جاتے ہیں)، کلوننگ کے لیے استعمال ہونے والے ویکٹر کے لیے مخصوص پرائمرز کے ساتھ کلون اور ترتیب دی جاتی ہے۔ یہ اوور لیپنگ سیکوینس کی طرف جاتا ہے جسے پھر کمپیوٹر پر ایک سیکوینس میں جمع کرنا پڑتا ہے۔ یہ طریقہ ترتیب کے متوازی ہونے کی اجازت دیتا ہے (آپ ایک ہی وقت میں بہت سارے ترتیب کے رد عمل تیار کر سکتے ہیں اور انہیں چلا سکتے ہیں) جو عمل کو بہت تیز بناتا ہے اور ترتیب کے مخصوص پرائمر کی ضرورت سے بھی بچتا ہے۔ چیلنج یہ ہے کہ ترتیبات کو ان کی ترتیب میں منظم کیا جائے، کیونکہ اوورلیپس یہاں اتنے واضح نہیں ہیں۔ اس مسئلے کو حل کرنے کے لیے، پہلا مسودہ بنایا جاتا ہے اور پھر اہم علاقوں کو دیگر تکنیکوں جیسے پرائمر واکنگ کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا جاتا ہے۔ عمل مجموعی عمل مندرجہ ذیل ہے: ایک پرائمر جو ڈی این اے کے آغاز سے ترتیب سے ملتا جلتا ہے، نامعلوم ترتیب سے متصل ایک مختصر ڈی این اے اسٹرینڈ کی ترکیب کے لیے استعمال ہوتا ہے، جس کا آغاز پرائمر سے ہوتا ہے (پی سی آر دیکھیں)۔ نئے مختصر ڈی این اے اسٹرینڈ کو زنجیر ختم کرنے کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا جاتا ہے۔ سیکوینسڈ اسٹرینڈ کا اختتام طویل ڈی این اے سیکوینس کے اگلے حصے کے لیے پرائمر کے طور پر استعمال ہوتا ہے، اس لیے اصطلاح "واکنگ" ہے۔ یہ طریقہ پورے کروموسوم کو ترتیب دینے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے (اس لیے "کروموسوم واکنگ")۔ پرائمر واکنگ بھی شاٹگن سیکوینسنگ کی ترقی کی بنیاد تھی، جو خاص طور پر منتخب کردہ کے بجائے بے ترتیب پرائمر استعمال کرتا ہے۔ کروموسوم جمپنگ کروموسوم لینڈنگ شاٹگن سیکوینسنگ بھی دیکھیں-ایک متبادل طریقہ، بے ترتیب استعمال کرتے ہوئے، مسلسل، ذیلی تاروں کے بجائے۔ حوالہ جات ڈی این اے سالماتی حیاتیات