X-gal
ایکس-گیل (5-برومو-4-کلورو-3-انڈولائل-β-گیلیکٹوپیرنوسائڈ کے لیے بھی مختصر BCIG) ایک نامیاتی مرکب ہے جو کہ گیلیکٹوز پر مشتمل ہوتا ہے جو ایک متبادل انڈول سے منسلک ہوتا ہے۔ اس مرکب کو جیروم ہورویٹز اور ساتھیوں نے 1964 میں ترکیب کیا تھا۔ رسمی کیمیائی نام کو اکثر کم درست لیکن کم پیچیدہ جملے جیسے بروموکلوروائنڈوکسیل گیلیکٹوسائڈ سے مختصر کیا جاتا ہے۔ انڈوکسیل کا X، X-gal سنکچن میں X کا منبع ہو سکتا ہے۔ ایکس-گیل اکثر سالماتی حیاتیات میں ایک انزائم، β-galactosidase کی موجودگی کی جانچ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اس کے معمول کے ہدف، β-galactoside کی جگہ۔ یہ ہسٹو کیمسٹری اور بیکٹیریاولوجی میں اس انزائم کی سرگرمی کا پتہ لگانے کے لیے بھی استعمال ہوتا ہے۔ ایکس-گیل بہت سے انڈوکسیل گلائکوسائڈز اور ایسٹرز میں سے ایک ہے جو انزائم-اتپریرک ہائیڈرولیسس کے نتیجے میں انڈگو ڈائی کی طرح اگھلنشیل نیلے مرکب پیدا کرتا ہے۔ ایک کم کثرت سے استعمال ہونے والا لیکن بہت ہی مماثل (چیرل) مرکب X-gal (Xαgal، X-α-gal)، یا 5-برومو-4-کلورو-3-انڈولائل-α-D-galactopyranoside ہے، جسے β-galactosidase (EC 3.2.1.23) کے بجائے α-galactosidase (EC 3.2.1.22) کے ذریعے ہائیڈرولائز کیا جاتا ہے۔ X-gal کا استعمال لییکٹوز کا ایک ینالاگ ہے، اور اس لیے اسے β-galactosidase انزائم کے ذریعے ہائیڈرولائز کیا جا سکتا ہے جو-لییکٹوز میں β-glycosidic بانڈ کو الگ کرتا ہے۔ ایکس-گیل، جب β-گیلیکٹوسیڈیز کے ذریعے الگ کیا جاتا ہے، تو گیلیکٹوز اور 5-برومو-4-کلورو-3-ہائیڈروکسینڈول-1 حاصل ہوتا ہے۔ مؤخر الذکر پھر بے ساختہ ڈائمرائز ہوتا ہے اور 5,5 '-ڈائبرومو-4,4'-ڈائکلورو-انڈگو-2 میں آکسائڈائز ہوتا ہے، جو ایک انتہائی نیلی مصنوعات ہے جو اگھلنشیل ہے۔ ایکس-گیل خود بے رنگ ہے، لہذا نیلے رنگ کے پروڈکٹ کی موجودگی کو فعال β-galactosidase کی موجودگی کے ٹیسٹ کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ بیکٹیریل β-galactosidase (نام نہاد لاک زیڈ) کو مختلف ایپلی کیشنز میں بطور رپورٹر استعمال کرنے کی بھی اجازت دیتا ہے۔ اسی طرح، Xαgal کو α-galactosidase کے لیے رپورٹر کمپاؤنڈ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ خمیر میں میل 1)۔ رد عمل کلوننگ جین کلوننگ میں، ایکس-گیل کو ایک بصری اشارے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے کہ آیا کوئی خلیہ نیلے/سفید اسکریننگ نامی تکنیک میں فعال β-galactosidase انزائم کا اظہار کرتا ہے۔ اسکریننگ کا یہ طریقہ ایک کامیاب کلوننگ پروڈکٹ کو دوسرے ناکام پروڈکٹ سے ممتاز کرنے کا ایک آسان طریقہ ہے۔ نیلے/سفید اسکریننگ کا طریقہ β-گیلیکٹوسیڈیز جین کی α-تکمیل کے اصول پر منحصر ہے، جہاں پلازمیڈ میں لیک زیڈ جین (لیک زیڈ اے) کا ایک ٹکڑا خلیے میں ایک اور اتپریورتن لیک زیڈ جین (لیک زیڈ ڈی ایم 15) کی تکمیل کر سکتا ہے۔ دونوں جین خود ہی غیر فعال پیپٹائڈز پیدا کرتے ہیں، تاہم، جب ایک ساتھ اظہار کیا جاتا ہے، جیسے کہ جب ایک پلاسمڈ جس میں لیک زیڈ ایم 15 خلیات ہوتے ہیں، وہ ایک فعال β-گیلیکٹوسیڈیز بناتے ہیں۔ ایک فعال β-galactosidase کی موجودگی کا پتہ اس وقت لگایا جا سکتا ہے جب خلیوں کو X-gal پر مشتمل پلیٹوں میں اگایا جاتا ہے، خلیوں کے اندر نیلے رنگ کے پروڈکٹ کے نتیجے میں خصوصیت والی نیلی کالونیاں پیدا ہوتی ہیں۔ تاہم، ایک سے زیادہ کلوننگ سائٹ، جہاں دلچسپی کے جین کو پلاسمڈ ویکٹر میں منسلک کیا جا سکتا ہے، لیک زیڈ اے جین کے اندر واقع ہے۔ اس لیے کامیاب لائیگیشن لاک زیڈ اے جین میں خلل ڈالتا ہے، اس لیے α-تکمیل میں بھی خلل پڑتا ہے اور کوئی فعال β-galactosidase نہیں بن سکتا، جس کے نتیجے میں سفید کالونیاں بنتی ہیں۔ کامیابی سے جڑے ہوئے داخل ہونے والے خلیوں کو پھر ناکام نیلے رنگ کے خلیوں سے اس کے سفید رنگ سے آسانی سے پہچانا جا سکتا ہے۔ اس ٹیسٹ کے لیے استعمال ہونے والے کلوننگ ویکٹرز کی مثال پی یو سی 19، پی بلیو اسکرپٹ، پی جی ای ایم-ٹی ویکٹرز ہیں، اور اس کے لیے مخصوص ای کولی میزبان تناؤ جیسے ڈی ایچ 5 اے کے استعمال کی بھی ضرورت ہوتی ہے جس میں میوٹینٹ لیک زیڈ ایم 15 جین ہوتا ہے۔ اکثر، ایکس-گیل پر مشتمل پلیٹ میں آئی پی ٹی جی (آئسوپروپائل β-1-تھیوگالیکٹوپیرانوسائیڈ) بھی ہوتا ہے۔ آئی پی ٹی جی لییکٹوز کا ایک کیمیائی ڈھانچہ اینالاگ ہے۔ تاہم، آئی پی ٹی جی کو β-galactosidase کے ذریعے ہائیڈرولائز نہیں کیا جا سکتا۔ آئی پی ٹی جی کو ایک انڈسر کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے جو ڈی این اے کو جاری کرنے اور نقل کی اجازت دینے والے لاک ریپریسر سے جڑا ہوتا ہے۔ اگر پلیٹ میں آئی پی ٹی جی کی موجودگی اس لیے β-galactosidase کی ترکیب میں اضافہ کرتی ہے۔ متغیرات ایکس-گیل کی متعدد قسمیں ہیں، جو ایک جیسے مالیکیول ہیں جن میں معمولی فرق ہوتے ہیں جو بنیادی طور پر نیلے رنگ کے علاوہ دوسرے رنگوں کو سگنل کے طور پر تیار کرنے کے لیے کام کرتے ہیں۔ پروٹین-پروٹین تعاملات دو ہائبرڈ تجزیے میں، β-galactosidase کو ایک رپورٹر کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے تاکہ ایک دوسرے کے ساتھ تعامل کرنے والے پروٹین کی شناخت کی جا سکے۔ اس طریقہ کار میں، خمیر یا بیکٹیریل نظام کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کے تعامل کے لیے جینوم لائبریریوں کی جانچ کی جا سکتی ہے۔ جہاں پروٹین کی جانچ پڑتال کے درمیان ایک کامیاب تعامل ہوتا ہے، اس کے نتیجے میں ایک ایکٹیویشن ڈومین ایک پروموٹر کے پابند ہو جائے گا۔ اگر پروموٹر ایک لیک زیڈ جین سے منسلک ہے، تو β-گیلیکٹوسیڈیز کی پیداوار، جس کے نتیجے میں ایکس-گیل کی موجودگی میں نیلی رنگ کی کالونیوں کی تشکیل ہوتی ہے، اس لیے پروٹین کے درمیان کامیاب تعامل کی نشاندہی کرے گی۔ یہ تکنیک تقریبا 106 سے کم سائز کی اسکریننگ لائبریریوں تک محدود ہو سکتی ہے۔ ایکس-گیل کا کامیاب کلیویج بھی انڈول کے اتار چڑھاؤ کی وجہ سے نمایاں طور پر بدبو پیدا کرتا ہے۔ مزید دیکھیں ایکس-گلوک حوالہ جات گیلیکٹوسائڈز انڈولس کلوروارینز بروموارینز