Nucleoside phosphoramidite
نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس قدرتی یا مصنوعی نیوکلیوسائڈز کے مشتق ہیں۔ وہ اولیگونیوکلیوٹائڈز، نیوکلک ایسڈ کے نسبتا مختصر ٹکڑوں اور ان کے ینالاگس کی ترکیب کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس کو پہلی بار 1981 میں بیوکیج اور کیروتھرس نے متعارف کرایا تھا۔ ناپسندیدہ ضمنی رد عمل سے بچنے کے لیے، قدرتی یا مصنوعی نیوکلیوسائڈز میں موجود رد عمل والے ہائیڈروکسی اور ایکسوائکلک امینو گروپ مناسب طریقے سے محفوظ ہیں۔ جب تک کہ نیوکلیوسائڈ اینالاگ میں کم از کم ایک ہائیڈروکسی گروپ ہوتا ہے، مناسب حفاظتی حکمت عملی کا استعمال اسے متعلقہ فاسفورامائڈائٹ میں تبدیل کرنے اور بعد میں مصنوعی نیوکلک ایسڈ میں شامل کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ فاسفورامائڈائٹ حکمت عملی کا استعمال کرتے ہوئے اولیگونیوکلیوٹائڈ سلسلہ کے وسط میں شامل ہونے کے لیے، نیوکلیوسائڈ اینالاگ میں دو ہائیڈروکسی گروپ یا کم کثرت سے، ایک ہائیڈروکسی گروپ اور دوسرا نیوکلیوفیلک گروپ (امینو یا مرکیپٹو) ہونا چاہیے۔ مثالوں میں شامل ہیں، لیکن ان تک محدود نہیں ہیں، متبادل نیوکلیوٹائڈز، ایل این اے، مورفولینو، 2 'پوزیشن (او ایم ای، محفوظ این ایچ 2، ایف) پر ترمیم شدہ نیوکلیوسائڈز، غیر کینونکل اڈوں پر مشتمل نیوکلیوسائڈز (قدرتی نیوکلیوسائڈز انوسین اور زینتھوسین میں موجود ہائپوکسنتھائن اور زینتھائن، بالترتیب، ٹرائی سائیکلک بیس جیسے جی-کلیمپ، وغیرہ) یا ایک فلوروسینٹ گروپ یا لنکر بازو سے ماخوذ بیس۔ تیاری نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس کی تیاری کے تین اہم طریقے ہیں۔ عام طریقہ کار میں کمزور تیزاب کے اتپریرک عمل کے تحت فاسفورڈیمیڈائٹ کے ساتھ ایک آزاد ہائیڈروکسی گروپ والے محفوظ نیوکلیوسائڈ کا علاج شامل ہے۔ اگرچہ کچھ بیسامیڈائٹس کو تھرمل طور پر غیر مستحکم مرکبات کے طور پر رپورٹ کیا گیا تھا، 2-سائانویتھیل این، این، این '، این'-ٹیٹریسوپروپیلفاسفورڈیمیڈائٹ، تجارتی نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس تیار کرنے کے لیے استعمال ہونے والا امیڈائٹ نسبتا مستحکم ہے۔ اسے دو مراحل، ایک برتن کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا جا سکتا ہے اور ویکیوم ڈسٹلشن کے ذریعے صاف کیا جا سکتا ہے۔ ایک بہترین جائزہ بہت تفصیل سے نیوکلیوسیڈک اور غیر نیوکلیوسیڈک فاسفورامائٹس کی تیاری میں مؤخر الذکر ریجینٹ کے استعمال کا خاکہ پیش کرتا ہے۔ دوسرے طریقہ کار میں، محفوظ نیوکلیوسائڈ کا علاج فاسفوروکلورائڈائٹ کے ساتھ نامیاتی بیس کی موجودگی میں کیا جاتا ہے، عام طور پر این-ایتھائل-این، این-ڈائیسوپروپائلامائن (ہنگس بیس)۔ تیسرے طریقہ کار میں، محفوظ نیوکلیوسائڈ کا علاج سب سے پہلے کلورو این، این، این '، این'-ٹیٹریسوپروپائل فاسفوروڈیامیڈائٹ کے ساتھ ایک نامیاتی بیس کی موجودگی میں کیا جاتا ہے، جو کہ عام طور پر این-ایتھائل-این، این-ڈائیسوپروپائلامائن (ہنگ کا بیس) ایک محفوظ نیوکلیوسائڈ ڈائمیڈائٹ بنانے کے لیے ہوتا ہے۔ مؤخر الذکر کو مطلوبہ فاسفائٹ حفاظتی گروپ سے متعلق الکحل کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے، مثال کے طور پر، 2-سائانو ایتھانول، ایک کمزور ایسڈ کی موجودگی میں۔ نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس کو سلیکا جیل پر کالم کرومیٹوگرافی کے ذریعے پاک کیا جاتا ہے۔ فاسفورامائڈائٹ کے حصے کے استحکام کی ضمانت کے لیے، یہ مشورہ دیا جاتا ہے کہ کالم کو ایک ایلیوینٹ کے ساتھ متوازن کیا جائے جس میں 3 سے 5 فیصد ٹرائیتھیلیمین ہو اور علیحدگی کے پورے دور میں ایلیوینٹ میں اس ارتکاز کو برقرار رکھا جائے۔ فاسفورامائڈائٹ کی پاکیزگی کا اندازہ 31 پی این ایم آر سپیکٹروسکوپی کے ذریعے کیا جا سکتا ہے۔ چونکہ نیوکلیوسائڈ فاسفورامائڈائٹ میں پی (III) ایٹم چیرل ہوتا ہے، اس لیے یہ مرکب کے دو ڈائسٹریومرز کے مطابق تقریبا 149 پی پی ایم پر دو چوٹیوں کو ظاہر کرتا ہے۔ ممکنہ طور پر موجود فاسفائٹ ٹرسٹر کی نجاست 138-140 پی پی ایم پر عروج کو ظاہر کرتی ہے۔ ایچ-فاسفونیٹ کی نجاست 8 اور 10 پی پی ایم پر چوٹیوں کو ظاہر کرتی ہے۔ نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس کی کیمیائی خصوصیات نسبتا مستحکم مرکبات ہیں جن کی شیلف لائف طویل ہوتی ہے جب 4 ڈگری سیلسیس سے کم درجہ حرارت پر ہوا کی عدم موجودگی میں غیر آبی حالات میں پاؤڈر کے طور پر ذخیرہ کیا جاتا ہے۔ امیڈائٹس ہلکے بنیادی حالات کا مقابلہ کرتے ہیں۔ اس کے برعکس، یہاں تک کہ ہلکے ایسڈ کی موجودگی میں، فاسفورامائٹس تقریبا فوری طور پر ختم ہو جاتے ہیں۔ فاسفورامائٹس غیر جانبدار حالات میں ہائیڈرولیسس کے لیے نسبتا مستحکم ہوتے ہیں۔ مثال کے طور پر، 25 ڈگری سینٹی گریڈ پر 95 فیصد آبی ایسیٹونیٹریل میں 2-سائانویتھیل 5 '-O-(4,4'-ڈائیمیتھوکسیٹریٹل) تھائمیڈائن-3 '-O-(N، N-ڈائیسوپروپیلامینو) فاسفائٹ کی نصف زندگی 200 گھنٹے ہے۔ فاسفورامائٹس کی سب سے اہم خصوصیت فاسفورامائڈائٹ جوڑے کے رد عمل سے گزرنے کی صلاحیت ہے جو کہ ایک تیزابی ایزول اتپریرک، 1H-ٹیٹرازول، 2-ایتھلتھیوٹیٹرازول، 2-بینزیلتھیوٹیٹرازول، 4,5-ڈائیسانومیڈازول کی موجودگی میں نیوکلیوفیلک گروپوں کے ساتھ رد عمل ظاہر کرنے کی صلاحیت ہے۔ ردعمل انتہائی تیزی سے آگے بڑھتا ہے۔ یہ خصوصیت نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس کو اولیگونیوکلیوٹائڈ کی ترکیب میں مفید انٹرمیڈیٹس بناتی ہے۔ سٹیریو کیمیکل طور پر، فاسفورامائڈائٹ جوڑا پی (III) چیرل سینٹر میں ایپیمیرائزیشن (ڈائسٹریومرز کی تشکیل) کا باعث بنتا ہے۔ جب پانی کو نیوکلیوفائل کے طور پر پیش کیا جاتا ہے، تو پروڈکٹ ایک ایچ-فاسفونیٹ ڈیسٹر ہوتا ہے جیسا کہ اوپر اسکیم میں دکھایا گیا ہے۔ سالوینٹس اور ریجینٹس میں بقایا پانی کی موجودگی کی وجہ سے، مؤخر الذکر کمپاؤنڈ کی تشکیل فاسفورامائڈز کے تیاری کے استعمال میں سب سے عام پیچیدگی ہے، خاص طور پر اولیگونیوکلیوٹائڈ کی ترکیب میں۔ فاسفورامیڈائٹس کو کمزور آکسیڈیٹنگ ریجینٹس کے ساتھ آسانی سے آکسائڈائز کیا جاتا ہے، مثال کے طور پر، کمزور اڈوں کی موجودگی میں آبی آیوڈین کے ساتھ یا ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے ساتھ متعلقہ فاسفورامیڈیٹس بنانے کے لیے۔ اسی طرح، فاسفورامائڈائٹس دوسرے چالکوجینز کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتے ہیں۔ جب سلفر کے محلول یا متعدد مرکبات کے ساتھ رابطے میں لایا جاتا ہے جسے اجتماعی طور پر سلفورائزنگ ایجنٹ کہا جاتا ہے، تو فاسفورامائڈائٹس مقداری طور پر فاسفورتھیوامیڈیٹس بناتے ہیں۔ سیلینیم یا سیلینیم مشتقات کے ساتھ تعامل سے فاسفورسیلینوامیڈیٹس پیدا ہوتے ہیں۔ اس قسم کے تمام تعاملات میں، فاسفورس ایٹم کی تشکیل برقرار رہتی ہے۔ نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس متعلقہ فاسفونامیڈیٹس بنانے کے لیے مائیکلس-آربوزوف رد عمل سے گزرتے ہیں۔ ایک مثال ایکریلونیٹریل کی موجودگی میں فاسفونامیڈیٹس کی تیاری کو بیان کرتی ہے۔ اطلاعات کے مطابق، کمرے کے درجہ حرارت پر رد عمل فاسفورس کے مرکز میں ترتیب کو برقرار رکھنے کے ساتھ سٹیریو سلیکٹو ہوتا ہے۔ اس کے برعکس، جب 55 ڈگری سیلسیس پر انجام دیا جاتا ہے، تو ردعمل ریسائزڈ مصنوعات کی طرف جاتا ہے۔ اسی طرح فاسفائنز اور ترتیری فاسفائٹس کے لیے، فاسفورامائٹس آسانی سے اسٹاؤنجر رد عمل سے گزرتے ہیں۔ (آر او) 2 پی-این (آر 1) 2 + آر 2-این 3 + ایچ 2 او---- (آر او) 2 پی (= او)-این (آر 1) 2 + آر 2-این ایچ 2 + این 2 ؛ حفاظتی حکمت عملی قدرتی طور پر پائے جانے والے نیوکلیوٹائڈز (نیوکلیوسائڈ-3 '-یا 5'-فاسفیٹس) اور ان کے فاسفوڈیسٹر اینالاگس زیادہ پیداوار میں اولیگونیوکلیوٹائڈز کی تیز مصنوعی تیاری کے متحمل ہونے کے لیے ناکافی رد عمل رکھتے ہیں۔ نیوکلیوسائڈز (نیوکلیوسائڈ فاسفورامائٹس) کے 3 '-O-(N، N-ڈائیسوپروپائل فاسفورامائڈائٹ) مشتقات کا استعمال کرکے انٹرنیوکلیوسیڈک روابط کے انتخاب اور تشکیل کی شرح کو ڈرامائی طور پر بہتر بنایا جاتا ہے جو فاسفائٹ ٹرسٹر طریقہ کار میں بلڈنگ بلاکس کے طور پر کام کرتے ہیں۔ ناپسندیدہ ضمنی رد عمل کو روکنے کے لیے، نیوکلیوسائڈز میں موجود دیگر تمام فعال گروپوں کو حفاظتی گروپوں کو جوڑ کر غیر فعال (محفوظ) کیا جانا چاہیے۔ اولیگونیوکلیوٹائڈ چین اسمبلی کی تکمیل کے بعد، مطلوبہ اولیگونیوکلیوٹائڈز حاصل کرنے کے لیے تمام حفاظتی گروپوں کو ہٹا دیا جاتا ہے۔ ذیل میں، فی الحال تجارتی طور پر دستیاب اور سب سے عام نیوکلیوسائڈ فاسفورامائڈائٹ بلڈنگ بلاکس میں استعمال ہونے والے حفاظتی گروپوں کا مختصر جائزہ لیا گیا ہے: 5 '-ہائیڈروکسیل گروپ ایسڈ-لیبل ڈی ایم ٹی (4,4'-ڈائیمیتھوکسائٹریٹل) گروپ کے ذریعہ محفوظ ہے۔ تھامین اور یوراسل، بالترتیب تھائمیڈائن اور یوریڈائن کے نیوکلک بیسز میں ایکسوائکلک امینو گروپ نہیں ہوتے ہیں اور اس لیے انہیں کسی تحفظ کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔ اس کے برعکس، نیوکلک بیسز اڈینائن، سائٹوسین، اور گوانائن ایکسوائکلک امینو گروپس کو برداشت کرتے ہیں، جو جوڑے کے رد عمل کے حالات میں فعال فاسفورامائٹس کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتے ہیں۔ اگرچہ، مصنوعی سائیکل میں اضافی مراحل کی قیمت پر، اولیگونیوکلیوٹائڈ چین اسمبلی کو غیر محفوظ امینو گروپوں کے ساتھ فاسفورامائڈائٹس کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جا سکتا ہے، اکثر انہیں اولیگونیوکلیوٹائڈ چین اسمبلی کی پوری لمبائی میں مستقل طور پر محفوظ رکھا جاتا ہے۔ ایکسوائکلک امینو گروپوں کا تحفظ 5 '-ہائیڈروکسی گروپ کے آرتھوگنل ہونا چاہیے کیونکہ ہر مصنوعی سائیکل کے اختتام پر مؤخر الذکر کو ہٹا دیا جاتا ہے۔ لاگو کرنے میں سب سے آسان اور اس وجہ سے سب سے زیادہ وسیع پیمانے پر قبول شدہ حکمت عملی ہے جہاں ایکسوائکلک امینو گروپ بیس لیبل تحفظ برداشت کرتے ہیں۔ اکثر، دو حفاظتی اسکیمیں استعمال کی جاتی ہیں۔ پہلے میں، معیاری اور زیادہ مضبوط اسکیم (شکل)، بی زیڈ (بینزوئل) تحفظ کا استعمال اے، ڈی اے، سی، ڈی سی، جی کے لیے کیا جاتا ہے، اور ڈی جی آئسوبیوٹریل گروپ کے ساتھ محفوظ ہیں۔ حال ہی میں، اے سی (ایسیٹیل) گروپ اکثر سی اور ڈی سی کی حفاظت کے لیے استعمال ہوتا ہے جیسا کہ شکل میں دکھایا گیا ہے۔ دوسری، ہلکی حفاظتی اسکیم میں، اے اور ڈی اے آئسوبوٹیرل یا فینوکسیسیٹیل گروپس (پی اے سی) سے محفوظ ہیں۔ سی اور ڈی سی ریچھ ایکٹیل تحفظ، اور جی اور ڈی جی 4-آئسوپروپیلفینوکسائٹیل (آئی-پی آر-پی اے سی) یا ڈائیمیتھائلفارمائڈینو (ڈی ایم ایف) گروپوں سے محفوظ ہیں۔ ہلکے حفاظتی گروپوں کو معیاری حفاظتی گروپوں کے مقابلے میں زیادہ آسانی سے ہٹا دیا جاتا ہے۔ تاہم، ان گروپوں کو رکھنے والے فاسفورامائٹس حل میں ذخیرہ ہونے پر کم مستحکم ہوتے ہیں۔ فاسفائٹ گروپ بیس-لیبل 2-سائانویتھیل گروپ کے ذریعے محفوظ ہے۔ ایک بار جب فاسفورامائڈائٹ کو ٹھوس سپورٹ باؤنڈ اولیگونیوکلیوٹائڈ کے ساتھ جوڑ دیا جاتا ہے اور فاسفائٹ موئٹیز کو پی (وی) پرجاتیوں میں تبدیل کر دیا جاتا ہے، تو مزید جوڑے کے رد عمل کے کامیاب انعقاد کے لیے فاسفیٹ تحفظ کی موجودگی لازمی نہیں ہے۔ آر این اے کی ترکیب میں، 2 '-ہائیڈروکسی گروپ ٹی بی ڈی ایم ایس (ٹی-بیوٹیلڈیمیتھائلسیل) گروپ سے محفوظ ہے۔ یا ٹی او ایم (ٹرائی-آئسو-پروپائلسیلائیلوکسیمیتھائل) گروپ کے ساتھ، دونوں کو فلورائڈ آئن کے ساتھ علاج کے ذریعے ہٹایا جا سکتا ہے۔ فاسفائٹ کا حصہ تیزابیت کے حالات میں ڈائیسوپروپیلامینو (آئی پی آر 2 این) گروپ ری ایکٹیو بھی رکھتا ہے۔ فعال ہونے پر، ڈائیسوپروپیلامینو گروپ چھوڑ دیتا ہے، جسے سپورٹ باؤنڈ اولیگونیوکلیوٹائڈ کے 5 '-ہائیڈروکسی گروپ کے ذریعہ تبدیل کیا جاتا ہے۔ مزید پڑھیں جامع قدرتی مصنوعات کیمسٹری، جلد 7: ڈی این اے اور سالماتی حیاتیات کے پہلو۔ کول، ایرک ٹی۔ ایڈیٹر۔ نیتھن۔ (1999)، 733 پی پی۔ ناشر: (ایلسیویئر، ایمسٹرڈیم، نیت۔) بیوکیج، ایس ایل۔ اولیگوڈیوکسیریبونیوکلیوٹائڈز کی ترکیب۔ فاسفورامائڈائٹ نقطہ نظر۔ سالماتی حیاتیات میں طریقے (ٹوٹووا، این جے، ریاستہائے متحدہ) (1993)، 20 (اولیگونیوکلیوٹائڈز اور اینالاگس کے لیے پروٹوکول)، 33-61۔ براؤن ٹی۔، براؤن ڈی جے ایس۔ 1991۔ اولیگونیوکلیوٹائڈز اور اینالاگس میں۔ ایک عملی نقطہ نظر، ایڈ۔ ایف ایکسٹین، پی پی۔ 1-24۔ آکسفورڈ: آئی آر ایل فاسفورامائٹس پی ایل: امیڈوفوسفورینی