Rapid amplification of cDNA ends
سی ڈی این اے اینڈز کی تیز رفتار امپلیفکیشن (آر اے سی ای) ایک ایسی تکنیک ہے جو سالماتی حیاتیات میں سیل کے اندر پائے جانے والے آر این اے ٹرانسکرپٹ کی مکمل لمبائی کی ترتیب حاصل کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ آر اے سی ای کے نتیجے میں دلچسپی کی آر این اے ترتیب کی سی ڈی این اے کاپی تیار ہوتی ہے، جو ریورس ٹرانسکرپشن کے ذریعے تیار ہوتی ہے، اس کے بعد سی ڈی این اے کاپیز کی پی سی آر امپلیفیکیشن ہوتی ہے (آر ٹی-پی سی آر دیکھیں)۔ ایمپلیفائیڈ سی ڈی این اے کاپیاں پھر ترتیب دی جاتی ہیں اور، اگر کافی لمبی ہوں تو، ایک منفرد جینومک خطے کا نقشہ بنانا چاہیے۔ RACE کے بعد عام طور پر کلوننگ کی جاتی ہے جو اصل میں انفرادی RNA مالیکیولز کی ترتیب سے پہلے ہوتی ہے۔ ایک زیادہ ہائی تھرو پٹ متبادل جو نوول ٹرانسکرپٹ ڈھانچوں کی شناخت کے لیے مفید ہے، اگلی نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کے ذریعے آر اے سی ای مصنوعات کو ترتیب دینا ہے۔ پروسیس آر اے سی ای نقل کے اندر ایک چھوٹی سی معروف ترتیب سے آر این اے کے 5 'سرے (5' آر اے سی ای-پی سی آر) یا 3 'سرے (3' آر اے سی ای-پی سی آر) تک آر این اے نقل کی ترتیب فراہم کر سکتا ہے۔ اس تکنیک کو بعض اوقات یک طرفہ پی سی آر یا اینکرڈ پی سی آر کہا جاتا ہے۔ آر اے سی ای میں پہلا قدم ریورس ٹرانسکرپشن کا استعمال کرنا ہے تاکہ آر این اے ٹرانسکرپٹ کے علاقے کی سی ڈی این اے کاپی تیار کی جا سکے۔ اس عمل میں، نقل کے ایک نامعلوم اختتامی حصے کو نقل کے مرکز سے ایک معروف ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے نقل کیا جاتا ہے۔ نقل شدہ خطہ 5 'یا 3' کے سرے پر معروف ترتیب سے جڑا ہوا ہے۔ 5 'یا 3' نسلوں کے پروٹوکول قدرے مختلف ہیں۔ 5 'آر اے سی ای-پی سی آر ایک اینٹی سینس (ریورس) اولیگونیوکلیوٹائڈ پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے سی ڈی این اے کی ترکیب (یا ریورس ٹرانسکرپشن) رد عمل کے پہلے دور کے لیے ٹیمپلیٹ کے طور پر ایم آر این اے کا استعمال شروع کرتا ہے جو دلچسپی کے جین کے وسط میں ایک معروف ترتیب کو پہچانتا ہے۔ پرائمر کو جین مخصوص پرائمر (جی ایس پی) کہا جاتا ہے۔ پرائمر ایم آر این اے سے جڑا رہتا ہے، اور انزائم ریورس ٹرانسکرپٹیس ایک مخصوص سنگل اسٹرینڈڈ سی ڈی این اے پروڈکٹ تیار کرنے کے لیے پرائمر کے 3 'سرے پر بیس جوڑوں کو شامل کرتا ہے۔ یہ ایم آر این اے کی ریورس تکمیل ہے۔ سی ڈی این اے کی ترکیب کے بعد، انزائم ٹرمینل ڈی آکسینوکلیوٹیڈائل ٹرانسفرس (ٹی ڈی ٹی) کا استعمال سی ڈی این اے کے 3 'سرے پر یکساں نیوکلیوٹائڈز کی ایک تار کو شامل کرنے کے لیے کیا جاتا ہے، جسے ہوموپولیمرک دم کہا جاتا ہے۔ (ڈی نووو سی ڈی این اے کی ترکیب کے پہلے اسٹرینڈ کے لیے 3 '-ٹرمینل سیکوینس کو شامل کرنے کے کچھ اور طریقے ہیں جو ہومو پولیمرک ٹیلنگ سے کہیں زیادہ موثر ہیں، لیکن طریقہ کار کا احساس وہی رہتا ہے)۔ اس کے بعد پی سی آر کیا جاتا ہے، جس میں دوسرا اینٹی سینس جین مخصوص پرائمر (جی ایس پی 2) استعمال ہوتا ہے جو معلوم ترتیب سے جڑا ہوتا ہے، اور ایک سینس (فارورڈ) یونیورسل پرائمر (یو پی) جو سی ڈی این اے کے 3 'سروں میں شامل ہوموپولیمرک دم کو باندھتا ہے تاکہ سی ڈی این اے پروڈکٹ کو 5' سرے سے بڑھایا جا سکے۔ 3 'آر اے سی ای-پی سی آر قدرتی پولی اے دم کا استعمال کرتا ہے جو ریورس ٹرانسکرپشن کے دوران پرائمنگ کے لیے تمام یوکرائیوٹک ایم آر این اے کے 3' سرے پر موجود ہے، لہذا اس طریقہ کار میں ٹی ڈی ٹی کے ذریعے نیوکلیوٹائڈز کے اضافے کی ضرورت نہیں ہے۔ سی ڈی این اے ایک اولیگو-ڈی ٹی-اڈاپٹر پرائمر (ڈی آکسی-تھامین نیوکلیوٹائڈز کی ایک مختصر ترتیب والا ایک پرائمر) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا جاتا ہے جو پولی اے اسٹریچ کو مکمل کرتا ہے اور ہر سی ڈی این اے کے 5 'سرے پر ایک خصوصی اڈاپٹر ترتیب کا اضافہ کرتا ہے۔ اس کے بعد پی سی آر کا استعمال سینس جی ایس پی کا استعمال کرتے ہوئے کسی معروف علاقے سے 3 'سی ڈی این اے کو بڑھانے کے لیے کیا جاتا ہے، اور ایک اینٹی سینس پرائمر جو اڈاپٹر سیکوینس کی تکمیل کرتا ہے۔ RACE-ترتیب RACE کے ذریعے پیدا ہونے والے سی ڈی این اے مالیکیولز کو ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز (جسے RACE-SEQ بھی کہا جاتا ہے) کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا جا سکتا ہے۔ مالیکیولر کلوننگ کے ساتھ آر اے سی ای ٹکڑوں کی روایتی خصوصیت کے مقابلے میں آر اے سی ای ٹکڑوں کی ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ خصوصیت انتہائی وقت کی بچت، زیادہ حساس، کم مہنگی اور تکنیکی طور پر قابل عمل ہے جس کے بعد چند کلونوں کی سینگر ترتیب ہوتی ہے۔ تاریخ اور ایپلی کیشنز RACE کو RNA مالیکیولز کے نامعلوم 5 '(5'-RACE) یا 3 '(3'-RACE) حصوں کو بڑھانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جہاں RNA ترتیب کا حصہ جانا جاتا ہے اور جین مخصوص پرائمر کے ذریعے نشانہ بنایا جاتا ہے۔ ان امپلیفائیڈ آر اے سی ای مصنوعات کی خصوصیت کے لیے ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے ساتھ مل کر، کسی بھی قسم کی کوڈنگ یا نان کوڈنگ آر این اے مالیکیولز کی خصوصیت کے لیے نقطہ نظر کا اطلاق کرنا ممکن ہے۔ RACE کو ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے ساتھ جوڑنے کا خیال پہلی بار 2009 میں ڈیپ ریس کے طور پر متعارف کرایا گیا تھا تاکہ ایک سیل لائن میں 17 جینوں کی ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹس (TSS) کی نقشہ سازی کی جا سکے۔ مثال کے طور پر، 2014 کے ایک مطالعے میں مصنوعی ایس آئی آر این اے کے ذریعہ ہدایت کردہ ہدف آر این اے کے کلیویج سائٹس کا درست نقشہ بنانے کے لیے، اس نقطہ نظر کو پہلے آر اے سی ای-سی کیو کا نام دیا گیا تھا۔ مزید برآں، یہ طریقہ کار کولوریکٹل کینسر میں ناول ٹرانسکرپٹس اور فیوژن ٹرانسکرپٹس کے مکمل لمبائی کے نامعلوم حصوں کی خصوصیت کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ایک اور مطالعہ میں جس کا مقصد ایل این سی آر این اے کے نامعلوم نقل کے ڈھانچے کو نمایاں کرنا ہے، آر اے سی ای کو نیم طویل 454 ترتیب کے ساتھ مل کر استعمال کیا گیا۔ مالیکیولر کلوننگ: اے لیبارٹری مینوئل (ای ڈی ایس) میں حوالہ جات "5 'سی ڈی این اے کی تیز رفتار توسیع ختم"۔ سمبروک، جے۔ ) باب 8 پروٹوکول 9، 8.54 − 8.60 (کولڈ اسپرنگ ہاربر لیبارٹری پریس، کولڈ اسپرنگ ہاربر، نیویارک، یو ایس اے، 2001) اصول جین ہیرا پھیری اور جینومکس، ایس بی پرائمروز اور آر ایم ٹومین، بلیک ویل پبلشنگ، 2006 (7 واں ایڈیشن۔ )، صفحات 111-12۔ بیرونی روابط آر اے سی ای-سی کیو بائیو کیمسٹری کا پتہ لگانے کے طریقوں کے بارے میں بلاگ مضمون جینیاتی نقشہ سازی جینیات کی تکنیک سالماتی حیاتیات