Immunofluorescence
امیونو فلوریسنس ایک ایسی تکنیک ہے جو فلوروسینس خوردبین کے ساتھ ہلکی خوردبین کے لیے استعمال ہوتی ہے اور بنیادی طور پر حیاتیاتی نمونوں پر استعمال ہوتی ہے۔ یہ تکنیک ان کے اینٹیجن کے لیے اینٹی باڈیز کی خاصیت کا استعمال کرتی ہے تاکہ سیل کے اندر مخصوص بائیو مالیکیول کے اہداف کے لیے فلوروسینٹ رنگوں کو نشانہ بنایا جا سکے، اور اس لیے نمونے کے ذریعے ہدف مالیکیول کی تقسیم کا تصور کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ اینٹی باڈی کسی اینٹیجن پر جس مخصوص علاقے کو پہچانتی ہے اسے ایپیٹوپ کہا جاتا ہے۔ ایپیٹوپ میپنگ میں کوششیں کی گئی ہیں کیونکہ بہت سے اینٹی باڈیز ایک ہی ایپیٹوپ کو باندھ سکتے ہیں اور ایک ہی ایپیٹوپ کو پہچاننے والے اینٹی باڈیز کے درمیان پابند ہونے کی سطح مختلف ہو سکتی ہے۔ مزید برآں، خود اینٹی باڈی سے فلوروفور کا پابند ہونا اینٹی باڈی کی امیونولوجیکل خاصیت یا اس کے اینٹیجن کی پابند کرنے کی صلاحیت میں مداخلت نہیں کر سکتا۔ امیونو فلوریسنس امیونوسٹیننگ (پروٹین کو داغ لگانے کے لیے اینٹی باڈیز کا استعمال) کی ایک وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والی مثال ہے اور یہ امیونو ہسٹو کیمسٹری (ٹشوز میں اینٹی باڈی-اینٹیجن تعلقات کا استعمال) کی ایک مخصوص مثال ہے۔ یہ تکنیک بنیادی طور پر اینٹی باڈیز کے مقام کا تصور کرنے کے لیے فلوروفورز کا استعمال کرتی ہے۔ امیونو فلوریسنس ٹشو کے حصوں، کلچرڈ سیل لائنوں، یا انفرادی خلیوں پر استعمال کیا جا سکتا ہے، اور پروٹین، گلائکنز، اور چھوٹے حیاتیاتی اور غیر حیاتیاتی مالیکیولز کی تقسیم کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس تکنیک کو درمیانی سائز کے تنوں جیسے ڈھانچوں کو دیکھنے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اگر سیل میمبرین کی ٹوپولوجی کا تعین ہونا باقی ہے، تو ڈھانچے کا تعین کرنے کے لیے پروٹین میں ایپیٹوپ کے اندراج کو امیونو فلوریسنس کے ساتھ مل کر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ امیونو فلوریسنس کو ڈی این اے میتھیلیشن کی سطحوں اور لوکلائزیشن کے نمونوں کے بارے میں بصیرت حاصل کرنے کے لیے "نیم مقداری" طریقہ کے طور پر بھی استعمال کیا جا سکتا ہے کیونکہ یہ حقیقی مقداری طریقوں سے زیادہ وقت طلب طریقہ ہے اور میتھیلیشن کی سطحوں کے تجزیے میں کچھ ساپیکشیت ہے۔ امیونو فلوریسنس کو فلوروسینٹ سٹیننگ کے دیگر، غیر اینٹی باڈی طریقوں کے ساتھ مل کر استعمال کیا جا سکتا ہے، مثال کے طور پر، ڈی این اے کو لیبل کرنے کے لیے ڈی اے پی آئی کا استعمال۔ امیونو فلوریسنس نمونوں کے تجزیے کے لیے کئی خوردبین ڈیزائن استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ سب سے آسان ایپی فلوریسنس خوردبین ہے، اور کنفوکل خوردبین بھی بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے۔ مختلف سپر ریزولوشن مائکروسکوپ ڈیزائن بھی استعمال کیے جا سکتے ہیں جو بہت زیادہ ریزولوشن کے قابل ہیں۔ اقسام فلوروسینس کی تیاری فلوروکروم-لیبلڈ اینٹی باڈیز بنانے کے لیے، ایک فلوروکروم کو اینٹی باڈی سے جوڑنا ("ٹیگ") ضروری ہے۔ اسی طرح، ایک اینٹیجن کو فلوروسینٹ اینٹیجن تکنیک نامی تکنیک میں فلوروسینٹ تحقیقات کے ساتھ اینٹی باڈی سے بھی جوڑا جا سکتا ہے۔ داغ لگانے کے طریقہ کار سائٹوپلازم میں فکسڈ اینٹیجن یا زندہ خلیوں پر سیل کی سطح کے اینٹیجن دونوں پر لاگو ہو سکتے ہیں، جسے "جھلی امیونو فلوریسنس" کہا جاتا ہے۔ اینٹی باڈی-اینٹیجن کمپلیکس کی تکمیل کو فلوروسینٹ تحقیقات کے ساتھ لیبل کرنا بھی ممکن ہے۔ اس عنصر کے علاوہ جس سے فلوروسینس تحقیقات منسلک ہیں، امیونو فلوریسینس تکنیک کی دو عام کلاسیں ہیں: پرائمری اور سیکنڈری۔ مندرجہ ذیل وضاحتیں بنیادی طور پر ان کلاسوں پر مربوط اینٹی باڈیز کے لحاظ سے توجہ مرکوز کریں گی۔ امیونو فلوریسنس تکنیک کی دو قسمیں ہیں، پرائمری (یا براہ راست) اور سیکنڈری (یا بالواسطہ)۔ پرائمری (براہ راست) پرائمری (براہ راست) امیونو فلوریسنس ایک واحد، پرائمری اینٹی باڈی کا استعمال کرتا ہے، جو کیمیائی طور پر فلوروفور سے منسلک ہوتا ہے۔ بنیادی اینٹی باڈی ہدف مالیکیول (اینٹیجن) کو پہچانتی ہے اور ایک مخصوص علاقے سے جڑی ہوتی ہے جسے ایپیٹوپ کہا جاتا ہے۔ یہ ایک ایسے عمل کے ذریعے پورا کیا جاتا ہے جو انکولی قوت مدافعت کے ساتھ حیاتیات کے مدافعتی ردعمل میں ہیرا پھیری کرتا ہے۔ منسلک فلوروفور کا پتہ فلوروسینٹ مائکروسکوپی کے ذریعے لگایا جا سکتا ہے، جو استعمال شدہ میسنجر پر منحصر ہے، ایک بار پرجوش ہونے کے بعد روشنی کی ایک مخصوص طول موج کا اخراج کرے گا۔ براہ راست امیونو فلوریسنس، اگرچہ کچھ کم عام ہے، ثانوی (بالواسطہ) طریقہ کار کے مقابلے میں قابل ذکر فوائد رکھتے ہیں۔ اینٹی باڈی سے میسنجر کا براہ راست لگاؤ طریقہ کار میں اقدامات کی تعداد کو کم کرتا ہے، وقت کی بچت کرتا ہے اور غیر مخصوص پس منظر کے سگنل کو کم کرتا ہے۔ یہ پورے عمل میں اینٹی باڈی کراس ری ایکٹیویٹی اور ممکنہ غلطیوں کے امکان کو بھی محدود کرتا ہے۔ تاہم، اس طریقہ کار میں کچھ نقصانات موجود ہیں۔ چونکہ بنیادی اینٹی باڈی سے منسلک ہونے والے فلوروسینٹ مالیکیولز کی تعداد محدود ہے، براہ راست امیونو فلوریسنس بالواسطہ امیونو فلوریسنس کے مقابلے میں کافی کم حساس ہے اور اس کے نتیجے میں غلط منفی ہو سکتے ہیں۔ براہ راست امیونو فلوریسنس کے لیے بہت زیادہ بنیادی اینٹی باڈی کے استعمال کی بھی ضرورت ہوتی ہے، جو انتہائی مہنگا ہوتا ہے، بعض اوقات $400.00/mL تک ہوتا ہے۔ ثانوی (بالواسطہ) ثانوی (بالواسطہ) امیونو فلوریسنس دو اینٹی باڈیز کا استعمال کرتا ہے۔ غیر لیبل شدہ پہلا (بنیادی) اینٹی باڈی خاص طور پر ٹارگٹ مالیکیول کو باندھتا ہے، اور ثانوی اینٹی باڈی، جو فلوروفور کو لے کر جاتا ہے، بنیادی اینٹی باڈی کو پہچانتا ہے اور اس سے جڑا رہتا ہے۔ متعدد ثانوی اینٹی باڈیز ایک واحد بنیادی اینٹی باڈی کو باندھ سکتی ہیں۔ یہ فی اینٹیجن فلوروفور مالیکیولز کی تعداد میں اضافہ کرکے سگنل میں اضافہ فراہم کرتا ہے۔ یہ پروٹوکول اوپر دیے گئے بنیادی (یا براہ راست) پروٹوکول کے مقابلے میں زیادہ پیچیدہ اور وقت طلب ہے، لیکن زیادہ لچک کی اجازت دیتا ہے کیونکہ دی گئی بنیادی اینٹی باڈی کے لیے مختلف قسم کے ثانوی اینٹی باڈیز اور پتہ لگانے کی تکنیکیں استعمال کی جا سکتی ہیں۔ یہ پروٹوکول ممکن ہے کیونکہ اینٹی باڈی دو حصوں پر مشتمل ہوتی ہے، ایک متغیر خطہ (جو اینٹیجن کو پہچانتا ہے) اور مستقل خطہ (جو اینٹی باڈی مالیکیول کی ساخت بناتا ہے)۔ یہ سمجھنا ضروری ہے کہ یہ تقسیم مصنوعی ہے اور حقیقت میں اینٹی باڈی انو چار پولی پیپٹائڈ زنجیروں پر مشتمل ہے: دو بھاری زنجیروں اور دو ہلکی زنجیروں۔ ایک محقق کئی بنیادی اینٹی باڈیز پیدا کر سکتا ہے جو مختلف اینٹی جینز کو پہچانتے ہیں (جن کے متغیر علاقے مختلف ہوتے ہیں)، لیکن سب ایک ہی مستقل علاقے کا اشتراک کرتے ہیں۔ اس لیے ان تمام اینٹی باڈیز کو ایک واحد ثانوی اینٹی باڈی سے پہچانا جا سکتا ہے۔ یہ براہ راست فلوروفور لے جانے کے لیے بنیادی اینٹی باڈیز میں ترمیم کرنے کی لاگت کو بچاتا ہے۔ مختلف مستقل علاقوں کے ساتھ مختلف بنیادی اینٹی باڈیز عام طور پر مختلف انواع میں اینٹی باڈیز کو بڑھا کر تیار کی جاتی ہیں۔ مثال کے طور پر، ایک محقق بکری میں بنیادی اینٹی باڈیز بنا سکتا ہے جو کئی اینٹی جینز کو پہچانتا ہے، اور پھر ڈائی جوڑے والے خرگوش ثانوی اینٹی باڈیز کو استعمال کرتا ہے جو بکری کے اینٹی باڈی مستقل علاقے ("خرگوش مخالف بکری" اینٹی باڈیز) کو پہچانتے ہیں۔ اس کے بعد محقق ماؤس میں بنیادی اینٹی باڈیز کا دوسرا سیٹ بنا سکتا ہے جسے ایک علیحدہ "گدھے اینٹی ماؤس" ثانوی اینٹی باڈی سے پہچانا جا سکتا ہے۔ یہ متعدد تجربات میں مشکل سے بننے والے ڈائی جوڑے والے اینٹی باڈیز کے دوبارہ استعمال کی اجازت دیتا ہے۔ حدود زیادہ تر فلوروسینس تکنیکوں کی طرح، امیونو فلوروسینس کا ایک اہم مسئلہ فوٹو بلیچنگ ہے۔ فوٹو بلیچنگ کی وجہ سے ہونے والی سرگرمی کے نقصان کو روشنی کی نمائش کی شدت یا وقت کی مدت کو کم یا محدود کرکے، فلوروفورز کے ارتکاز کو بڑھا کر، یا زیادہ مضبوط فلوروفورز کو استعمال کرکے کنٹرول کیا جا سکتا ہے جو بلیچنگ کا کم شکار ہوتے ہیں (مثال کے طور پر، الیکسا فلورز، سیٹا فلورز، یا ڈائی لائٹ فلورز)۔ اس تکنیک سے پیدا ہونے والے کچھ مسائل میں آٹو فلوروسینس، غیر معمولی ناپسندیدہ مخصوص فلوروسینس، اور غیر مخصوص فلوروسینس شامل ہیں۔ آٹوفلوریسنس میں نمونے کے ٹشو یا سیل سے خارج ہونے والی فلوروسینس شامل ہوتی ہے۔ غیر معمولی ناپسندیدہ مخصوص فلوروسینس اس وقت ہوتا ہے جب ایک ٹارگٹڈ اینٹیجن ناپاک ہوتا ہے اور اس میں اینٹیجینک آلودگیاں ہوتی ہیں۔ غیر مخصوص فلوروسینس میں فلوروفور، نامناسب فکسشن، یا خشک نمونے کی وجہ سے تحقیقات کی خاصیت کا نقصان شامل ہے۔ امیونو فلوریسنس صرف مقررہ (یعنی مردہ) خلیوں تک محدود ہوتا ہے جب خلیے کے اندر کے ڈھانچے کو دیکھا جانا ہوتا ہے کیونکہ فلوروسینٹ لیبلز کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتے وقت اینٹی باڈیز خلیے کی جھلی میں داخل نہیں ہوتے ہیں۔ اینٹیجینک مواد کو خلیے کے اندر اس کی قدرتی لوکلائزیشن کی جگہ پر مضبوطی سے نصب کیا جانا چاہیے۔ انٹیکٹ اینٹی باڈیز ویو میں کینسر کے خلیوں کو رنگنے کے لیے بہت بڑی بھی ہو سکتی ہیں۔ ان کے سائز کے نتیجے میں سست ٹیومر دخول اور طویل گردش نصف زندگی ہوتی ہے۔ اس حد کو حاصل کرنے کے لیے ڈائی باڈیز کے استعمال کی تحقیقات کی گئی ہیں۔ سپر نیٹنٹ میں یا خلیے کی جھلی کے باہر پروٹین اینٹی باڈیز سے جڑے ہو سکتے ہیں ؛ یہ زندہ خلیوں کو داغدار ہونے کی اجازت دیتا ہے۔ استعمال ہونے والے فکسیٹو پر منحصر ہے، دلچسپی کے پروٹین کراس لنکڈ ہو سکتے ہیں اور اس کے نتیجے میں غیر مخصوص بائنڈنگ کی وجہ سے یا تو غلط مثبت یا غلط منفی اشارے مل سکتے ہیں۔ ایک متبادل نقطہ نظر فلوروسینٹ پروٹین ڈومینز پر مشتمل ریکومبیننٹ پروٹین کا استعمال کرنا ہے، مثال کے طور پر، گرین فلوروسینٹ پروٹین (جی ایف پی)۔ اس طرح کے "ٹیگ شدہ" پروٹینوں کا استعمال زندہ خلیوں میں ان کی لوکلائزیشن کے تعین کی اجازت دیتا ہے۔ اگرچہ یہ امیونو فلوریسنس کا ایک خوبصورت متبادل معلوم ہوتا ہے، خلیوں کو جی ایف پی-ٹیگ کے ساتھ منتقل یا منتقل کرنا پڑتا ہے، اور اس کے نتیجے میں وہ کم از کم ایس 1 یا اس سے اوپر کے جاندار بن جاتے ہیں جن کے لیے لیبارٹری میں سخت حفاظتی معیارات کی ضرورت ہوتی ہے۔ اس تکنیک میں خلیوں کی جینیاتی معلومات کو تبدیل کرنا شامل ہے۔ اس طریقہ کار میں بہت سی بہتری فلوروسینٹ خوردبین اور فلوروفورز کی بہتری میں ہے۔ سپر ریزولوشن کے طریقے عام طور پر خوردبین کی ابی کی حد سے نیچے ریزولوشن پیدا کرنے کی صلاحیت کا حوالہ دیتے ہیں (روشنی پر اس کی طول موج کی وجہ سے رکھی گئی حد)۔ یہ تفریق کی حد پس منظر کی سمت میں تقریبا 200-300 nm اور محوری سمت میں 500-700 nm ہے۔ یہ حد خلیے کے کچھ ڈھانچوں سے موازنہ یا بڑی ہے، اور اس کے نتیجے میں، اس حد نے سائنسدانوں کو ان کی ساخت میں تفصیلات کا تعین کرنے سے روک دیا۔ فلوروسینس میں سپر ریزولوشن، خاص طور پر، مائکروسکوپ کی صلاحیت سے مراد ہے جو ملحقہ سپیکٹرم سے ملتے جلتے فلوروفورز کی بیک وقت فلوروسینس کو روکتا ہے۔ یہ عمل خوردبین کے پوائنٹ اسپریڈ فنکشن کو مؤثر طریقے سے تیز کرتا ہے۔ حال ہی میں تیار کردہ سپر ریزولوشن فلوروسینٹ مائکروسکوپ طریقوں کی مثالوں میں محرک اخراج کی کمی (ایس ٹی ای ڈی) مائکروسکوپی، سیچوریٹڈ اسٹرکچرڈ-ایلیومینیشن مائکروسکوپی (ایس ایس آئی ایم)، فلوروسینس فوٹو ایکٹیویشن لوکلائزیشن مائکروسکوپی (ایف پی اے ایل ایم)، اور اسٹوچسٹک آپٹیکل ری کنسٹرکشن مائکروسکوپی (ایس ٹی او آر ایم) شامل ہیں۔ قابل ذکر افراد کارنیلیا مچل ڈاؤنز (1892-1987)، مائکروبیولوجسٹ اور صحافی امیونو فلوریسنس کے نتائج کے ساتھ جلد کے حالات بھی دیکھیں امیونو کیمسٹری پیچنگ اور کیپنگ حوالہ جات بیرونی لنکس برمنگھم یونیورسٹی میں آٹو امیون بیماریوں سے وابستہ تصاویر ڈیوڈسن کالج میں امیونولوجیک ٹیسٹ حیاتیاتی تکنیک اور ٹولز پیتھولوجی اناٹومیکل پیتھولوجی لائف سائنسز انڈسٹری ریجینٹس فار بائیو کیمسٹری