Allele-specific oligonucleotide
ایلیل مخصوص اولیگونیوکلیوٹائڈ (اے ایس او) مصنوعی ڈی این اے کا ایک مختصر ٹکڑا ہے جو متغیر ہدف ڈی این اے کی ترتیب کی تکمیل کرتا ہے۔ یہ سدرن بلاٹ جانچ میں ہدف کی موجودگی کے لیے تحقیقات کے طور پر کام کرتا ہے یا، زیادہ عام طور پر، آسان ڈاٹ بلاٹ جانچ میں۔ یہ جینیاتی جانچ، فارنکس اور مالیکیولر بائیولوجی ریسرچ میں استعمال ہونے والا ایک عام ٹول ہے۔ اے ایس او عام طور پر لمبائی میں 15-21 نیوکلیوٹائڈ اڈوں کا اولیگونیوکلیوٹائڈ ہوتا ہے۔ اسے اس طرح سے ڈیزائن کیا گیا ہے (اور استعمال کیا گیا ہے) جو اسے ٹیسٹ کیے جانے والے ڈی این اے کے صرف ایک ورژن، یا ایلیل کے لیے مخصوص بناتا ہے۔ اے ایس او کی لمبائی، جس اسٹرینڈ سے اسے منتخب کیا گیا ہے، اور وہ حالات جن کے ذریعے یہ ہدف ڈی این اے سے جڑا ہوا ہے (اور دھویا گیا ہے)، یہ سب اس کی خاصیت میں ایک کردار ادا کرتے ہیں۔ ان تحقیقات کو عام طور پر ہدف کی جینیاتی ترتیب میں 1 بیس کے فرق کا پتہ لگانے کے لیے ڈیزائن کیا جا سکتا ہے، جو کہ سنگل نیوکلیوٹائڈ پولیمورفزم (ایس این پیز) کی جانچ میں ایک بنیادی صلاحیت ہے، جو جینوٹائپ تجزیہ اور ہیومن جینوم پروجیکٹ میں اہم ہے۔ اپنے ہدف سے منسلک ہونے کے بعد اس کا پتہ لگانے کے لیے، اے ایس او کو تابکار، انزیمیٹک، یا فلوروسینٹ ٹیگ کے ساتھ لیبل کیا جانا چاہیے۔ الومینا میتھیلیشن اسیس ٹیکنالوجی کسی مخصوص سی پی جی سائٹ پر میتھیلیشن کی پیمائش کرنے کے لیے ایک بیس جوڑی کے فرق (سائٹوسین بمقابلہ تھامین) کا پتہ لگانے کے لیے اے ایس او کا فائدہ اٹھاتی ہے۔ مثال انسانی بیماری سکل سیل انیمیا خون کے پروٹین بیٹا ہیموگلوبن کے چھٹے امینو ایسڈ کے لیے کوڈن میں جینیاتی تغیر کی وجہ سے ہوتی ہے۔ عام ڈی این اے ترتیب G-A-G امینو ایسڈ گلوٹامیٹ کے لیے کوڈ کرتا ہے، جبکہ تغیر درمیانی اڈینائن کو تھامین میں تبدیل کر دیتا ہے، جس کی وجہ سے ترتیب G-T-G (mRNA میں G-U-G) ہوتی ہے۔ یہ تبدیل شدہ ترتیب ایک ویلائن کو حتمی پروٹین میں بدل دیتی ہے، جس سے اس کی ساخت مسخ ہو جاتی ہے۔ ڈی این اے کے نمونے میں تغیر کی موجودگی کی جانچ کے لیے، ایک اے ایس او تحقیقات کو تبدیل شدہ ترتیب کی تکمیل کے لیے ترکیب کیا جائے گا، جسے یہاں "ایس" کے طور پر لیبل کیا گیا ہے۔ ایک کنٹرول کے طور پر، ایک اور اے ایس او کو عام ترتیب "اے" کے لیے ترکیب کیا جائے گا۔ ہر اے ایس او اپنے ہدف کی ترتیب کے لیے مکمل طور پر تکمیلی ہے (اور مضبوطی سے جڑے گا)، لیکن اس کے غیر ہدف والے ایلیل کے خلاف ایک ہی مطابقت نہیں ہے (جو کمزور تعامل کا باعث بنتا ہے)۔ پہلا خاکہ دکھاتا ہے کہ کس طرح "ایس" تحقیقات "ایس" ہدف (اوپر) کی مکمل تکمیل کرتی ہے، لیکن جزوی طور پر "اے" ہدف (نیچے) سے مماثل ہے۔ نمونے کے ڈی این اے (ز) میں بیٹا ہیموگلوبن جین کے ایک حصے کو پی سی آر کے ذریعے بڑھایا جائے گا، اور اس کے نتیجے میں پیدا ہونے والی مصنوعات کو ڈاٹ بلاٹس کے طور پر معاون جھلیوں کی نقل پر لاگو کیا جائے گا۔ نمونے کے ڈی این اے اسٹرینڈز کو الکالی کے ساتھ الگ کیا جاتا ہے، اور ہر اے ایس او تحقیقات کو ایک مختلف دھبے پر لگایا جاتا ہے۔ ہائبرڈائزیشن کے بعد، ایک دھونے کا پروٹوکول استعمال کیا جاتا ہے جو مکمل طور پر تکمیلی اور بے ترتیب ہائبرڈ کے درمیان فرق کر سکتا ہے۔ مماثل اے ایس اوز کو دھبوں سے دھو دیا جاتا ہے، جبکہ مماثل اے ایس اوز (اور ان کے لیبل) باقی رہتے ہیں۔ دوسرے خاکہ میں، دونوں دھبوں میں سے ہر ایک پر امپلیفائیڈ ڈی این اے کے چھ نمونے لگائے گئے ہیں۔ دھونے کے بعد باقی رہنے والے اے ایس او لیبل کا پتہ لگانے سے نمونوں کے جینوٹائپ کو براہ راست پڑھنے کی اجازت ملتی ہے، ہر ایک میں بیٹا ہیموگلوبن جین کی دو کاپیاں ہوتی ہیں۔ نمونے 1 اور 4 میں صرف عام "اے" ایلیل ہوتا ہے، جبکہ نمونے 3 اور 5 میں "اے" اور "ایس" دونوں ایلیل ہوتے ہیں (اور اس وجہ سے اس ریسیسیو میوٹیشن کے ہیٹروزائگس کیریئر ہوتے ہیں)۔ نمونے 2 اور 6 میں صرف "ایس" ایلیل ہوتا ہے، اور یہ بیماری سے متاثر ہوگا۔ دکھایا گیا 'کراس ہائبرڈائزیشن' کی چھوٹی مقدار عام ہے، اور حتمی نتائج کی تشریح کے عمل میں سمجھا جاتا ہے۔ متبادل اے ایس او تجزیہ جینیاتی پولیمرفزم کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہونے والے طریقوں میں سے صرف ایک طریقہ ہے۔ براہ راست ڈی این اے ترتیب کا استعمال ابتدائی طور پر تغیر کی خصوصیت کے لیے کیا جاتا ہے، لیکن معمول کی جانچ کے لیے یہ بہت مشکل ہے۔ اس سے پہلے کا ایک طریقہ، ریسٹریکشن فریگمنٹ لینتھ پولیمورفزم (آر ایف ایل پی) کو ترتیب کی تبدیلی کو پہلے سے جاننے کی ضرورت نہیں تھی، لیکن اس بات کی ضرورت تھی کہ اتپریورتن ریسٹریکشن انزائم کے کلیویج سائٹ کو متاثر کرے۔ آر ایف ایل پی جانچ کو مختصر طور پر اولیگونیوکلیوٹائڈ تحقیقات کے استعمال کے لیے ڈھال لیا گیا تھا، لیکن اس تکنیک کو تیزی سے پولیمرس چین ری ایکشن (پی سی آر) ایمپلیفائیڈ ڈی این اے کے اے ایس او تجزیہ کے ذریعے تبدیل کر دیا گیا۔ پی سی آر تکنیک کو خود پولی مورفزم کا پتہ لگانے کے لیے ایلیل مخصوص پی سی آر کے طور پر ڈھال لیا گیا ہے۔ تاہم، مشترکہ پی سی آر/اے ایس او طریقہ کار کی سادگی اور استعداد اس کے مسلسل استعمال کا باعث بنی ہے، بشمول غیر تابکار لیبلز کے ساتھ، اور "ریورس ڈاٹ بلاٹ" فارمیٹ میں جہاں اے ایس او تحقیقات جھلی سے جڑے ہوتے ہیں اور امپلیفائیڈ نمونہ ڈی این اے ہائبرڈائزیشن کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ جینیاتی ترتیب کے تغیرات کے لیے مخصوص تحقیقات کے طور پر مصنوعی اولیگونیوکلیوٹائڈز کے استعمال کا آغاز آر بروس والیس نے کیا تھا، جو کیلیفورنیا کے شہر ڈوارٹے میں سٹی آف ہوپ نیشنل میڈیکل سینٹر میں کام کر رہے تھے۔ 1979 میں والیس اور اس کے ساتھی کارکنوں نے سنگل اسٹرینڈڈ بیکٹیریل وائرس میں تغیرات کا پتہ لگانے کے لیے اے ایس او تحقیقات کے استعمال کی اطلاع دی، اور بعد میں اس تکنیک کو انسانی جینوں کی کلوننگ کے لیے استعمال کیا۔ 1983 اور 1985 میں والیس کی لیب نے پورے جینومک ڈی این اے کے نمونوں میں سکل سیل انیمیا کے تغیر کا پتہ لگانے کی اطلاع دی، حالانکہ اس ایپلی کیشن میں لیبل کی چھوٹی مقدار کی وجہ سے رکاوٹ پیدا ہوئی تھی جسے اے ایس او لے جا سکتا تھا۔ خوش قسمتی سے پی سی آر، ڈی این اے کے ایک مخصوص حصے کو بہت زیادہ بڑھانے کا ایک طریقہ، 1985 میں بھی رپورٹ کیا گیا تھا۔ ایک سال سے بھی کم عرصے میں پی سی آر کو اے ایس او تجزیہ کے ساتھ جوڑ دیا گیا تھا۔ اس امتزاج نے اے ایس او لیبلنگ کا مسئلہ حل کیا، کیونکہ ہدف ڈی این اے کی مقدار کو دس لاکھ گنا سے زیادہ بڑھایا جا سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، پی سی آر کے عمل کی خاصیت کو خود اے ایس او تحقیقات میں شامل کیا جا سکتا ہے، جس سے اے ایس او کے غیر ہدف ترتیبات پر جعلی پابند ہونے کے مسئلے کو بہت کم کیا جا سکتا ہے۔ امتزاج اتنا مخصوص تھا کہ اسے ایک سادہ ڈاٹ بلاٹ میں استعمال کیا جا سکتا تھا، محنت کش اور غیر موثر سدرن بلاٹ طریقہ سے گریز کرتے ہوئے۔ دیگر استعمال اے ایس او-پی سی آر کا استعمال بلڈ کینسر جیسے ملٹی پل مائیلوما میں کم سے کم بقایا بیماری کا پتہ لگانے کے لیے بھی کیا جا سکتا ہے۔ حوالہ جات بیرونی روابط اے ایس او آٹوریڈیوگرام ڈی این اے پروفائلنگ تکنیک کی تصویر سالماتی حیاتیات لیبارٹری تکنیک سالماتی حیاتیات تکنیک