Tetramer assay
ٹیٹریمر جانچ (جسے ٹیٹریمر داغ بھی کہا جاتا ہے) ایک ایسا طریقہ کار ہے جو خون کے نمونے کے اندر دیئے گئے اینٹیجن کے لیے مخصوص ٹی خلیوں کا پتہ لگانے اور ان کی مقدار کے لیے ٹیٹریمیرک پروٹین کا استعمال کرتا ہے۔ جانچ میں استعمال ہونے والے ٹیٹریمرز چار بڑے ہسٹوکومپٹیبلٹی کمپلیکس (ایم ایچ سی) مالیکیولز سے بنے ہوتے ہیں، جو جسم کے زیادہ تر خلیوں کی سطح پر پائے جاتے ہیں۔ ایم ایچ سی مالیکیول ٹی خلیوں کو پیپٹائڈز پیش کرتے ہیں جو کسی خلیے میں وائرس، بیکٹیریا، کینسر کے تغیرات، یا دیگر اینٹی جینز کی موجودگی کو بات چیت کرنے کا ایک طریقہ ہے۔ اگر ٹی سیل کا رسیپٹر ایم ایچ سی مالیکیول کے ذریعہ پیش کیے جانے والے پیپٹائڈ سے میل کھاتا ہے، تو مدافعتی ردعمل پیدا ہوتا ہے۔ اس طرح، ایم ایچ سی ٹیٹریمرز جو ایک مخصوص پیپٹائڈ پیش کرنے کے لیے بائیو انجینیئرڈ ہوتے ہیں، ٹی خلیوں کو ریسیپٹرز کے ساتھ تلاش کرنے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں جو اس پیپٹائڈ سے میل کھاتے ہیں۔ ٹیٹریمرز کو فلوروفور کے ساتھ لیبل کیا جاتا ہے، جس سے ٹیٹریمر سے جڑے ٹی خلیوں کا فلو سائٹومیٹری کے ساتھ تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ فلو سائٹومیٹری کے ذریعے ٹی خلیوں کی مقدار اور ترتیب محققین کو وائرل انفیکشن اور ویکسین کے انتظام کے ساتھ ساتھ اینٹیجن مخصوص ٹی خلیوں کی فعالیت کے خلاف مدافعتی ردعمل کی تحقیقات کرنے کے قابل بناتی ہے۔ عام طور پر، اگر کسی شخص کے مدافعتی نظام کو کسی پیتھوجین کا سامنا کرنا پڑا ہے، تو فرد کے پاس اس پیتھوجین پر کچھ پیپٹائڈ کی طرف مخصوص ٹی خلیات ہوں گے۔ لہذا، اگر کسی پیتھوجینک پیپٹائڈ کے لیے مخصوص ٹیٹریمر داغ کے نتیجے میں مثبت سگنل آتا ہے، تو یہ اس بات کی نشاندہی کر سکتا ہے کہ اس شخص کے مدافعتی نظام کو اس پیتھوجین کا سامنا کرنا پڑا ہے اور اس کا ردعمل پیدا ہوا ہے۔ یہ طریقہ کار پہلی بار 1996 میں اسٹینفورڈ یونیورسٹی کی ایک لیب نے شائع کیا تھا۔ اینٹیجن مخصوص ٹی خلیوں کی مقدار طے کرنے کی پچھلی کوششوں میں کم درست محدود ڈائلیوشن جانچ شامل تھی، جو ٹی خلیوں کی تعداد کا تخمینہ ان کی اصل سطح سے نیچے 50-500 اوقات پر کرتی ہے۔ گھلنشیل ایم ایچ سی مونومرز کا استعمال کرنے والے داغ بھی ٹی سیل ریسیپٹرز اور ایم ایچ سی پیپٹائڈ مونومرز کی کم بائنڈنگ وابستگی کی وجہ سے ناکام رہے۔ ایم ایچ سی ٹیٹریمرز ہدف ٹی سیل پر ایک سے زیادہ رسیپٹر سے جڑے رہ سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں بائنڈنگ کی کل طاقت میں اضافہ ہوتا ہے اور علیحدگی کی شرح کم ہوتی ہے۔ سی ڈی 8 + ٹی خلیوں کا استعمال کرتا ہے ٹیٹریمر داغ عام طور پر سائٹوٹوکسک ٹی لیمفوسائٹ (سی ٹی ایل) آبادیوں کا تجزیہ کرتے ہیں۔ سی ٹی ایل کو سی ڈی 8 + ٹی سیل بھی کہا جاتا ہے، کیونکہ ان میں سی ڈی 8 شریک رسیپٹر ہوتے ہیں جو ایم ایچ سی کلاس I مالیکیولز سے جڑے ہوتے ہیں۔ جسم میں زیادہ تر خلیات ایم ایچ سی کلاس I مالیکیولز کا اظہار کرتے ہیں، جو انٹرا سیلولر اینٹیجنز کو پروسیس کرنے اور سیل کی سطح پر پیش کرنے کے ذمہ دار ہوتے ہیں۔ اگر ایم ایچ سی کلاس I مالیکیولز کی طرف سے پیش کیے جانے والے پیپٹائڈز غیر ملکی ہیں-مثال کے طور پر، سیل کے اپنے پروٹینز کے بجائے وائرل پروٹینز سے حاصل کیے گئے ہیں-پیپٹائڈ سے ملنے والے ریسیپٹر کے ساتھ سی ٹی ایل سیل کو تباہ کر دے گا۔ ٹیٹریمر کے داغ فلو سائٹومیٹری کے ذریعے ان خلیوں کے تصور، مقدار اور ترتیب کی اجازت دیتے ہیں، جو امیونولوجی میں انتہائی مفید ہے۔ ٹی سیل کی آبادی کو وائرس کی مدت کے دوران یا ویکسین لگانے کے بعد ٹریک کیا جا سکتا ہے۔ ٹیٹریمر کے داغوں کو ای ایل آئی اسپاٹ جیسے فنکشنل اسیس کے ساتھ بھی جوڑا بنایا جا سکتا ہے، جو نمونے میں سائٹوکائن خفیہ کرنے والے خلیوں کی تعداد کا پتہ لگاتا ہے۔ لیب میں تیار کردہ ایم ایچ سی کلاس I ٹیٹریمر کنسٹرکشن ایم ایچ سی ٹیٹریمر مالیکیول خلیوں پر موجود کمپلیکس کو پیش کرنے والے اینٹیجن کی نقل کر سکتے ہیں اور ٹی خلیوں سے جڑے ہو سکتے ہیں جو اینٹیجن کو پہچانتے ہیں۔ کلاس I ایم ایچ سی مالیکیول ایک غیر متغیر لائٹ چین بیٹا-2 مائکروگلوبلین (β2m) سے وابستہ پولیمرفک ہیوی α-چین سے بنے ہوتے ہیں۔ ایسچریچیا کولی کو ہلکی زنجیر اور بھاری زنجیر کے ایک مختصر ورژن کی ترکیب کے لیے استعمال کیا جاتا ہے جس میں بائیوٹن 15 امینو ایسڈ ریکگنیشن ٹیگ شامل ہوتا ہے۔ یہ ایم ایچ سی زنجیروں کو انزائم بی آر اے کے ساتھ بائیوٹینیلیٹ کیا جاتا ہے اور دلچسپی کے اینٹیجینک پیپٹائڈ کے ساتھ دوبارہ جوڑ دیا جاتا ہے۔ بائیوٹن ایک چھوٹا مالیکیول ہے جو ایک اور پروٹین کے ساتھ مضبوط بندھن بناتا ہے جسے سٹریپٹوڈین کہا جاتا ہے۔ فلورفور ٹیگڈ سٹریپٹاویڈن کو بائیو انجینیئرڈ ایم ایچ سی مونومرز میں شامل کیا جاتا ہے، اور بائیوٹن-سٹریپٹاویڈن تعامل چار ایم ایچ سی مونومرز کو سٹریپٹاویڈن سے جوڑنے اور ٹیٹریمر بنانے کا سبب بنتا ہے۔ جب ٹیٹریمرز کو خون کے نمونے کے ساتھ ملایا جاتا ہے، تو وہ ٹی خلیوں سے جڑے ہوں گے جو مناسب اینٹیجن مخصوص رسیپٹر کا اظہار کرتے ہیں۔ کوئی بھی ایم ایچ سی ٹیٹریمر جو پابند نہیں ہوتے ہیں، فلو سائٹومیٹری کے ساتھ تجزیہ کرنے سے پہلے نمونے سے دھوئے جاتے ہیں۔ ریکومبیننٹ ایم ایچ سی مالیکیولز کے اندر حالیہ پیشرفتوں نے پیپٹائڈ ایم ایچ سی کمپلیکس کی تشکیل اور اس کے بعد ملٹی مییرائزیشن کو جمہوری بنایا ہے۔ ایم ایچ سی کلاس I مالیکیولز کی ایک وسیع رینج کی انتہائی فعال فارمولیشنز اب غیر ماہرین صارفین کو بغیر کسی خاص آلات کے کسی بھی لیب میں روزانہ اپنی مرضی کے مطابق پیپٹائڈ-ایم ایچ سی کمپلیکس بنانے کی اجازت دیتی ہیں۔ سی ڈی 4 + ٹی خلیات ٹیٹریمر بھی تیار کیے گئے ہیں جو مددگار ٹی خلیات سے جڑے ہوتے ہیں۔ مددگار ٹی خلیات یا سی ڈی 4 + ٹی خلیات سی ڈی 4 شریک رسیپٹرز کا اظہار کرتے ہیں۔ وہ کلاس II ایم ایچ سی مالیکیولز سے جڑے ہوتے ہیں، جو صرف پیشہ ورانہ اینٹیجن پیش کرنے والے خلیات جیسے ڈینڈرائٹک خلیات یا میکروفیجز میں ظاہر ہوتے ہیں۔ کلاس II ایم ایچ سی مالیکیولز ایکسٹرا سیلولر اینٹیجنز پیش کرتے ہیں، جو مددگار ٹی خلیوں کو بیکٹیریا، فنگی اور پرجیویوں کا پتہ لگانے کی اجازت دیتے ہیں۔ کلاس II ایم ایچ سی ٹیٹریمر کا استعمال زیادہ عام ہوتا جا رہا ہے، لیکن ٹیٹریمرز کو کلاس I ٹیٹریمرز کے مقابلے میں بنانا زیادہ مشکل ہے اور مددگار ٹی خلیوں اور ایم ایچ سی مالیکیولز کے درمیان بندھن اور بھی کمزور ہے۔ قدرتی قاتل ٹی خلیات قدرتی قاتل ٹی خلیات (این کے ٹی خلیات) کو ٹیٹریمر ٹیکنالوجی سے بھی دیکھا جا سکتا ہے۔ این کے ٹی خلیات پروٹین سے جڑے ہوتے ہیں جو لپڈ یا گلائکولیپیڈ اینٹیجن پیش کرتے ہیں۔ اینٹیجن پیش کرنے والا کمپلیکس جس سے این کے ٹی خلیات جڑے ہوتے ہیں اس میں سی ڈی 1 پروٹین شامل ہوتے ہیں، لہذا سی ڈی 1 سے بنے ٹیٹریمرز کو این کے ٹی خلیوں پر داغ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مثالیں ٹیٹریمر ٹیکنالوجی کا ابتدائی اطلاق ایچ آئی وی انفیکشن کے لیے سیل کی ثالثی والے مدافعتی ردعمل پر مرکوز ہے۔ ایم ایچ سی ٹیٹریمرز کو ایچ آئی وی اینٹیجنز پیش کرنے کے لیے تیار کیا گیا تھا اور متاثرہ مریضوں کے خون کے نمونوں میں ان ایچ آئی وی اینٹیجنز کے لیے مخصوص سی ٹی ایل کی فیصد تلاش کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔ ایچ آئی وی انفیکشن میں سی ٹی ایل کے فنکشن کی خصوصیت کے لیے اس کا موازنہ سائٹوٹوکسک اسیسز اور پلازما آر این اے وائرل لوڈ کے نتائج سے کیا گیا۔ ٹیٹریمرز سے منسلک سی ٹی ایل کو سائٹوکائن سراو کے تجزیے کے لیے ای ایل آئی اسپاٹ کنوؤں میں ترتیب دیا گیا تھا۔ ایک اور مطالعہ نے انفلوئنزا ویکسین کی فراہمی کے طریقہ کار کی تاثیر کی تحقیقات کے لیے ایم ایچ سی ٹیٹریمر کمپلیکس کا استعمال کیا۔ چوہوں کو انفلوئنزا کے لیے ذیلی جلد اور انٹرا ناسل ویکسین دی گئیں، اور فلو سائٹومیٹری کے ساتھ مل کر ٹیٹریمر داغوں کو ویکسین میں استعمال ہونے والے اینٹیجن کے لیے مخصوص سی ٹی ایل کی مقدار کے لیے استعمال کیا گیا۔ اس سے ویکسین کی فراہمی کے دو مختلف طریقوں میں مدافعتی ردعمل (وائرس کو نشانہ بنانے والے ٹی خلیوں کی تعداد) کا موازنہ کرنے کی اجازت ملی۔ حوالہ جات مزید پڑھنا خون کے ٹیسٹ فلو سائٹومیٹری