Tandem affinity purification
ٹینڈم افینیٹی پیوریفکیشن (ٹی اے پی) پروٹین-پروٹین کے تعاملات کا مطالعہ کرنے کے لیے امیونوپریسیپیٹیشن پر مبنی پیوریفکیشن تکنیک ہے۔ مقصد یہ ہے کہ کسی خلیے سے صرف دلچسپی کا پروٹین نکالا جائے، کسی بھی دوسرے پروٹین کے ساتھ پیچیدہ جس کے ساتھ اس کا تعامل ہوتا ہے۔ ٹی اے پی دو قسم کے اگاروز موتیوں کا استعمال کرتا ہے جو دلچسپی کے پروٹین سے جڑے ہوتے ہیں اور جنہیں خلیوں کے لائسیٹ سے سینٹرفیوگیشن کے ذریعے الگ کیا جا سکتا ہے، بغیر کسی خلل کے، شامل کمپلیکس کو خراب یا آلودہ کیے۔ دلچسپی کے پروٹین کو موتیوں سے جوڑنے کے قابل بنانے کے لیے، اسے ایک ڈیزائن شدہ ٹکڑا، ٹی اے پی ٹیگ کے ساتھ ٹیگ کیا جاتا ہے۔ اصل ٹی اے پی طریقہ کار میں زیر مطالعہ پروٹین کے سی-ٹرمینس میں ٹی اے پی ٹیگ کا فیوژن شامل ہے۔ ٹی اے پی ٹیگ تین اجزاء پر مشتمل ہوتا ہے: ایک کیلمڈوولین بائنڈنگ پیپٹائڈ (سی بی پی)، ٹی ای وی پروٹیز کلیویج سائٹ، اور دو پروٹین اے ڈومینز، جو آئی جی جی سے مضبوطی سے جڑے ہوتے ہیں (ٹی اے پی ٹیگ کو ایک قسم کا ایپیٹوپ ٹیگ بناتے ہیں)۔ ٹی اے پی اصول پہلی بار شائع ہونے کے بعد سے بہت سے دوسرے ٹیگ/مالا/ایلیوینٹ امتزاج تجویز کیے گئے ہیں۔ متغیر ٹیگز اس ٹیگ کو سی-ٹرمینل ٹی اے پی ٹیگ کے نام سے بھی جانا جاتا ہے کیونکہ این-ٹرمینل ورژن بھی دستیاب ہے۔ تاہم، بیان کیا جانے والا طریقہ سی-ٹرمینل ٹیگ کے استعمال کو فرض کرتا ہے، حالانکہ طریقہ کار کے پیچھے اصول اب بھی وہی ہے۔ تاریخ ٹی اے پی ٹیگنگ کو 1990 کی دہائی کے آخر میں یورپی مالیکیولر بائیولوجی لیبارٹری میں کام کرنے والی ایک تحقیقی ٹیم نے ایجاد کیا تھا (ریگاٹ ایٹ ال۔، 1999، پیوگ ایٹ ال۔، 2001) اور پروٹیوم ایکسپلوریشن کے لیے ایک نئے ٹول کے طور پر تجویز کیا گیا تھا۔ اسے ٹیم نے کئی پروٹین کمپلیکس (ریگاٹ اور دیگر، 1999، کیسپری اور دیگر) کی خصوصیت کے لیے استعمال کیا تھا۔ 1999، بوویریٹ اور دیگر، 2000، پیوگ اور دیگر، 2001)۔ اس تکنیک کا پہلا بڑے پیمانے پر استعمال 2002 میں ہوا تھا، جس میں تحقیقی ٹیم نے پروٹومکس کمپنی سیل زوم کے سائنسدانوں کے ساتھ مل کر کام کیا تاکہ خمیر کے خلیے میں 230 سے زیادہ ملٹی پروٹین کمپلیکس کے تعامل کا بصری نقشہ تیار کیا جا سکے۔ پودوں میں ٹی اے پی ٹیگ ٹیکنالوجی کے استعمال کی پہلی کامیاب رپورٹ 2004 میں آئی (روہیلا اور دیگر، 2004،) عمل کچھ طریقے ہیں جن میں فیوژن پروٹین کو میزبان خلیوں میں متعارف کرایا جا سکتا ہے۔ اگر میزبان خمیر ہے، تو ان طریقوں میں سے ایک پلازمیڈز کا استعمال ہو سکتا ہے جو بالآخر میزبان کے اندر فیوژن پروٹین کا ترجمہ کرے گا۔ جو بھی طریقہ استعمال کیا جا رہا ہے، فیوژن پروٹین کے اظہار کو اس کی قدرتی سطح کے جتنا ممکن ہو اتنا قریب برقرار رکھنا بہتر ہے۔ ایک بار جب فیوژن پروٹین کا میزبان کے اندر ترجمہ ہو جاتا ہے، تو یہ دوسرے پروٹین کے ساتھ تعامل کرے گا، مثالی طور پر ٹی اے پی ٹیگ سے غیر متاثر انداز میں۔ اس کے بعد، ٹیگ شدہ پروٹین (اس کے بائنڈنگ پارٹنرز کے ساتھ) کو وابستگی کے انتخاب کے عمل کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ حاصل کیا جاتا ہے۔ شامل کی گئی پہلی قسم کی مالا امیونوگلوبلین جی کے ساتھ لیپت ہوتی ہے، جو ٹی اے پی ٹیگ کے بیرونی سرے سے جڑی ہوتی ہے۔ دلچسپی کے پروٹین کے ساتھ موتیوں کو سینٹرفیوگیشن کے ذریعے لائسیٹ سے الگ کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد پروٹین کو موتیوں سے ایک انزائم (ٹی ای وی پروٹیز) کے ذریعے چھوڑا جاتا ہے جو بیچ میں ٹی ای وی کلیویج سائٹ پر ٹیگ کو توڑ دیتا ہے۔ صفائی کے اس پہلے مرحلے کے بعد، جاری شدہ پروٹین میں ایک دوسری قسم کا مالا (کیلمڈوولین کے ساتھ لیپت) شامل کیا جاتا ہے جو پروٹین پر موجود ٹی اے پی ٹیگ کے بقیہ ٹکڑے سے الٹ جاتا ہے۔ موتیوں کو دوبارہ سینٹری فیوگیشن کے ذریعے الگ کیا جاتا ہے، جو مزید آلودگیوں کے ساتھ ساتھ ٹی ای وی پروٹیز کو بھی دور کرتا ہے۔ آخر میں، موتیوں کو ای جی ٹی اے کے ذریعے جاری کیا جاتا ہے، جس سے مقامی ایلیوٹ پیچھے رہ جاتا ہے جس میں صرف دلچسپی کا پروٹین، اس کے پابند پروٹین شراکت دار اور ٹی اے پی ٹیگ کا بقیہ سی بی پی ٹکڑا ہوتا ہے۔ اس کے بعد پروٹین کے بائنڈنگ پارٹنرز کی شناخت کے لیے جیل الیکٹروفورسس اور ماس سپیکٹرومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے مقامی ایلیویٹ کا تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ فوائد اس طریقہ کار کا ایک فائدہ یہ ہے کہ پیچیدہ ساخت کے پیشگی علم کے بغیر ویو میں پروٹین شراکت داروں کا مقداری طور پر حقیقی تعین ہو سکتا ہے۔ اسے انجام دینا بھی آسان ہے اور اکثر زیادہ پیداوار فراہم کرتا ہے۔ پروٹین پروٹین کے تعامل کا مطالعہ کرنے میں رکاوٹوں میں سے ایک ہدف پروٹین کی آلودگی ہے خاص طور پر جب ہمیں اس کا کوئی پیشگی علم نہ ہو۔ ٹی اے پی ہدف پروٹین کو صاف کرنے کے لیے ایک موثر اور انتہائی مخصوص ذریعہ پیش کرتا ہے۔ 2 مسلسل وابستگی کی صفائی کے بعد، آلودگیوں کو ایلیوٹ میں برقرار رکھنے کا امکان نمایاں طور پر کم ہو جاتا ہے۔ نقصانات تاہم، اس بات کا بھی امکان ہے کہ پروٹین میں شامل کیا گیا ٹیگ نئے پروٹین کے تعامل کرنے والے شراکت داروں کے پابند ہونے کو غیر واضح کر سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، ٹیگ پروٹین کے اظہار کی سطح کو بھی متاثر کر سکتا ہے۔ دوسری طرف، ٹیگ بھی کافی حد تک وابستگی کے موتیوں کے سامنے نہیں آسکتا ہے، اس لیے نتائج کو موڑ دیتا ہے۔ ٹی ای وی پروٹیز کے ذریعہ پروٹین کے پھٹنے کا امکان بھی ہو سکتا ہے، حالانکہ ٹی ای وی پروٹیز کی اعلی خاصیت کو دیکھتے ہوئے اس کے بار بار ہونے کا امکان نہیں ہے۔ چونکہ اس طریقہ کار میں دھونے کے کم از کم 2 راؤنڈ شامل ہوتے ہیں، اس لیے یہ خمیر دو ہائبرڈ طریقہ کے برعکس یا فوٹو ری ایکٹیو امینو ایسڈ اینالاگس کے ساتھ ویو کراس لنکنگ میں عارضی پروٹین کے تعاملات کی اسکریننگ کے لیے موزوں نہیں ہو سکتا ہے۔ تاہم، یہ مستحکم پروٹین تعاملات کی جانچ کے لیے ایک اچھا طریقہ ہے اور پروٹین کمپلیکس کو کتنی بار صاف کیا جاتا ہے اس پر قابو پا کر مختلف درجے کی تحقیقات کی اجازت دیتا ہے۔ ایپلی کیشنز 2002 میں، ٹی اے پی ٹیگ کو سب سے پہلے ماس سپیکٹرومیٹری کے ساتھ بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا تھا تاکہ ملٹی پروٹین کمپلیکس کی خصوصیت کے ذریعے خمیر کے پروٹومکس کا منظم طریقے سے تجزیہ کیا جا سکے۔ مطالعہ میں 491 کمپلیکس کا انکشاف ہوا، جن میں سے 257 مکمل طور پر نئے تھے۔ باقی دیگر تحقیقات سے واقف تھے، لیکن اب عملی طور پر ان سب میں نئے اجزاء پائے گئے۔ انہوں نے ایک پیچیدہ نیٹ ورک میں فعال طور پر تمام پروٹین اجزاء سے متعلق ایک نقشہ تیار کیا۔ بہت سے دوسرے پروٹومک تجزیوں میں ٹی اے پی ٹیگ کا استعمال بھی شامل ہے۔ ای ایم بی او (ڈزیمبووسکی، 2004) کی ایک تحقیق میں نیوکلیئر پری-ایم آر این اے برقرار رکھنے اور اسپلیسنگ کے لیے درکار ایک نئے کمپلیکس کی نشاندہی کی گئی۔ انہوں نے 3 دیگر ذیلی اکائیوں (Snu17p، बड 13p اور PML1p) پر مشتمل ایک نئے ٹرائمرک کمپلیکس کو صاف کیا ہے اور پتہ چلا ہے کہ یہ ذیلی اکائیاں عملداری کے لیے ضروری نہیں ہیں بلکہ پری-ایم آر این اے کے موثر اسپلیسنگ (انٹرنز کو ہٹانے) کے لیے ضروری ہیں۔ 2006 میں، فلیشر اور دیگر۔ یوکرائیوٹک رائبوسومل کمپلیکس سے وابستہ منظم طریقے سے شناخت شدہ پروٹین۔ انہوں نے خمیر رائبوسومل کمپلیکس کی شناخت کے لیے کثیر جہتی ماس سپیکٹرومیٹری پروٹومک اسکرینز کا استعمال کیا اور پھر ان تمام پروٹینز کو فعال طور پر جوڑنے کے لیے ٹی اے پی ٹیگنگ کا استعمال کیا۔ دیگر ایپیٹوپ-ٹیگ امتزاج ملٹی پروٹین کمپلیکس کے ٹینڈم-افیینیٹی پیوریفکیشن کا اصول سی بی پی اور پروٹین اے ٹیگز کے امتزاج تک محدود نہیں ہے جو ریگاٹ اور دیگر کے اصل کام میں استعمال ہوتے ہیں۔ (1999)۔ مثال کے طور پر، FLAG-اور HA-ٹیگز کا امتزاج 2000 سے ناکاتانی کے گروپ کے ذریعہ ممالیہ خلیوں سے متعدد پروٹین کمپلیکس کو صاف کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا رہا ہے۔ ٹی اے پی اصول شائع ہونے کے بعد سے ٹیگ کے بہت سے دوسرے امتزاج تجویز کیے گئے ہیں۔ حوالہ جات بائیو کیمیکل علیحدگی کے عمل پروٹین-پروٹین تعامل کی جانچ