Cell synchronization
سیل سنکرونائزیشن ایک ایسا عمل ہے جس کے ذریعے سیل سائیکل کے مختلف مراحل پر کلچر میں موجود خلیوں کو ایک ہی مرحلے میں لایا جاتا ہے۔ سیل سنکرونی سیل سائیکل کے ذریعے آگے بڑھنے والے خلیوں کے مطالعہ میں ایک اہم عمل ہے کیونکہ یہ صرف سنگل سیل تجربات پر انحصار کرنے کے بجائے آبادی بھر میں ڈیٹا اکٹھا کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ مطابقت پذیری کی اقسام کو وسیع پیمانے پر دو گروپوں میں درجہ بند کیا گیا ہے۔ جسمانی فریکشنائزیشن اور کیمیائی ناکہ بندی۔ جسمانی علیحدگی ایک ایسا عمل ہے جس کے ذریعے خلیوں کو مسلسل تقسیم کرنے والے خلیوں کو درج ذیل خصوصیات کی بنیاد پر مرحلے سے بھرپور آبادیوں میں الگ کیا جاتا ہے: خلیوں کی کثافت خلیوں کا سائز اینٹی باڈیز کے ذریعے نشان زد خلیوں کی سطح کے ایپیٹوپس کی موجودگی لیبل والے خلیوں کے ذریعے ہلکے بکھرے ہوئے فلوروسینٹ اخراج۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ خلیات پورے سیل سائیکل میں مختلف مورفولوجیز اور سطح کے مارکر اختیار کرتے ہیں، ان خصلتوں کو فیز کے لحاظ سے الگ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ عام طور پر استعمال ہونے والے دو طریقے ہیں۔ سینٹرفیوگل ایلیوٹریشن (پہلے کہا جاتا تھا: کاؤنٹر اسٹریمنگ سینٹرفیوگیشن) سینٹرفیوگل ایلیوٹریشن کو سیل سائیکل کے مختلف مراحل میں خلیوں کو ان کے سائز اور تلچھٹ کی رفتار (تلچھٹ گتانک سے متعلق) کی بنیاد پر الگ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ سیل سائیکل کے دوران مسلسل نشوونما کے نمونوں کی وجہ سے، سینٹرفیوگل ایلٹریشن خلیوں کو جی 1، ایس، جی 2، اور ایم مراحل میں سائز بڑھا کر (اور تلچھٹ کے گتانک میں اضافہ کر کے) جی 2 اور ایم مراحل کے درمیان کم ریزولوشن کے ساتھ سیلولر ہیٹروجینیٹی اور ایک الگ سائز کی تبدیلی کی کمی کی وجہ سے الگ کر سکتا ہے۔ بڑے خلیات تیزی سے تلچھٹ کرتے ہیں، لہذا G2 میں ایک خلیہ، جس نے ترقی کے زیادہ وقت کا تجربہ کیا ہے، G1 میں ایک خلیے سے زیادہ تیزی سے تلچھٹ کرے گا اور اس وجہ سے اسے الگ کیا جا سکتا ہے۔ سسپنشن میں اگائے جانے والے خلیات کو باہر نکالنا آسان ہوتا ہے کیونکہ وہ ایک دوسرے پر قائم نہیں رہتے اور ان کی شکلیں گول، یکساں ہوتی ہیں۔ تاہم، کچھ قسم کے چپکے خلیوں کا علاج ٹرپسن کے ساتھ کیا جا سکتا ہے اور اخراج کے لیے دوبارہ معطل کیا جا سکتا ہے کیونکہ وہ معطلی میں زیادہ گول شکل اختیار کر لیں گے۔ فلو سائٹومیٹری اور سیل شارٹنگ فلو سائٹومیٹری خلیوں کی جسمانی اور کیمیائی خصوصیات کا پتہ لگانے، گنتی اور پیمائش کی اجازت دیتا ہے۔ خلیات کو سیال میں معطل کر کے فلو سائٹومیٹر کے ذریعے ڈال دیا جاتا ہے۔ خلیات کو لیزر بیم کے ذریعے ایک ایک کر کے بھیجا جاتا ہے اور روشنی کے بکھرنے کی پیمائش ایک ڈٹیکٹر کے ذریعے کی جاتی ہے۔ خلیوں یا ان کے اجزاء کو فلوروسینٹ مارکر کے ساتھ لیبل کیا جا سکتا ہے تاکہ وہ لیزر کے جواب میں روشنی کی مختلف طول موج کا اخراج کریں، جس سے اضافی ڈیٹا اکٹھا کیا جا سکے۔ مقداری خلیے کے چکر کے تجزیے کے لیے، خلیوں کو عام طور پر ایتھنول کے ساتھ طے کیا جاتا ہے اور ڈی این اے بائنڈنگ رنگوں جیسے پروپیڈیم آیوڈائڈ، ہوچسٹ 33342، ڈی اے پی آئی، 7-امینو ایکٹنومیسن ڈی، میتھرمائسن، ڈی آر اے کیو 5، یا ٹی او-پرو-3 سے داغدار کیا جاتا ہے، جس سے ڈی این اے کی مقدار کے ذریعے مرحلے کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، اگر ان خلیوں کو ٹھیک کر دیا گیا ہے، تو وہ مردہ ہیں اور مسلسل نشوونما کے لیے برقرار نہیں رکھے جا سکتے۔ زندہ ثقافتوں کو برقرار رکھنے کے لیے خلیوں کو میڈیا میں دوبارہ معطل کیا جا سکتا ہے اور غیر زہریلے رنگوں سے رنگا جا سکتا ہے۔ خلیوں کو جینوم میں اس طرح ترمیم بھی کیا جا سکتا ہے کہ کچھ سیلولر پروٹین کنجوگیٹڈ فلوروسینٹ ٹیگز جیسے جی ایف پی، ایم چیری، اور لوسیفیریز سے بنائے جاتے ہیں جو ان اجزاء کا پتہ لگانے اور ان کی مقدار کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ مثال کے طور پر، چیمیرک ہسٹون H2B-GFP تعمیرات کو ڈی این اے کے مواد کی پیمائش کرنے اور خلیوں کے مرحلے کو سمجھنے کے ایک ذریعہ کے طور پر نقل کی حیثیت کا تعین کرنے کے لیے بنایا اور استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ہلکے بکھرے ہوئے پیمائشوں کو سائز جیسی خصوصیات کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جس سے ٹیگنگ کے بغیر خلیے کے مرحلے میں فرق کیا جا سکتا ہے۔ فلو سائٹومیٹر کو ملٹی پیرامیٹر سائٹومیٹری ڈیٹا جمع کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، لیکن خلیوں کو الگ کرنے یا صاف کرنے کے لیے استعمال نہیں کیا جا سکتا۔ فلوروسینس ایکٹیویٹڈ سیل شارٹنگ (ایف اے سی ایس) خلیوں کو ان اختلافات کی بنیاد پر ترتیب دینے کی ایک تکنیک ہے جن کا پتہ روشنی کے بکھرنے سے لگایا جا سکتا ہے (مثال کے طور پر۔ خلیے کا سائز) یا فلوروسینس کا اخراج (دخول شدہ ڈی این اے، آر این اے، پروٹین یا اینٹی جینز کے ذریعے)۔ یہ نظام بہاؤ سائٹومیٹری کی طرح کام کرتا ہے، لیکن ایک متعین پیرامیٹر کی بنیاد پر ناپنے کے بعد ہر خلیے کے قطرے کو بھی چارج کرے گا۔ چارج شدہ بوند پھر ایک الیکٹروسٹیٹک ڈیفلیکشن سسٹم کا سامنا کرے گا جو اس چارج کی بنیاد پر سیل کو ایک مختلف کنٹینر میں ترتیب دے گا۔ یہ خلیوں کو فلوروسینٹ مواد یا بکھرے ہوئے کی بنیاد پر الگ کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ خلاصہ کے طور پر، سیل سائیکل فیز ڈسٹری بیوشن کے بارے میں مقداری ڈیٹا اکٹھا کرنے کے لیے اکیلے فلو سائٹومیٹری کا استعمال کیا جا سکتا ہے، لیکن ایف اے سی ایس کے ساتھ ہم آہنگی میں فلو سائٹومیٹری کا استعمال مقداری ڈیٹا اکٹھا کرنے اور مزید مطالعہ کے لیے فیز کے لحاظ سے خلیوں کو الگ کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ حدود میں شامل ہیں: روشنی کے بکھرنے کی پیمائش کے لیے، فکسڈ خلیوں کے لیے G2 اور M کے درمیان ناقص ریزولوشن (جیسا کہ سینٹرفیوگل ایلٹریشن کے ساتھ)، غیر فکسڈ لیکن رنگے ہوئے خلیوں کے لیے زندہ کلچر کو برقرار رکھنے سے قاصر، ڈائی ٹریٹمنٹ کی وجہ سے خلیوں کی ممکنہ خلل یا میوٹیجینیسیس کچھ آبادی کی متنوعیت کو برقرار رکھا جا سکتا ہے، کیونکہ سائز کی علیحدگی ہمیشہ مرحلے کی پیمائش کے لیے درست نہیں ہو سکتی ہے اور ڈی این اے سے ترمیم شدہ خلیوں کے لیے ہر مرحلے (ابتدائی G1 بمقابلہ دیر سے G1) کے اندر تمام خلیات ایک ہی مقام پر نہیں ہو سکتے ہیں، اس عمل میں کیمیائی ناکہ بندی کی ایک طویل مدت لگ سکتی ہے۔ سیل سائیکل کے کچھ مراحل میں خلیوں کو روکنے کے لیے بیرونی سبسٹریٹس کے اضافے کا استعمال کیا جا سکتا ہے اور اکثر سیل سائیکل چیک پوائنٹس کو نشانہ بنایا جا سکتا ہے۔ یہ تکنیکیں وٹرو میں انجام دی جا سکتی ہیں اور انہیں کلچر کے ماحول سے ہٹانے کی ضرورت نہیں ہے۔ کیمیائی ناکہ بندی کی سب سے عام قسم گرفتاری اور رہائی ہے، جس میں کیمیائی بلاک کے ساتھ کلچر کا علاج اور اس کے بعد بلاک کے لیے غیر جانبدار کرنے والے ایجنٹ کو دھو کر یا اس کے علاوہ چھوڑنا شامل ہے۔ اگرچہ کیمیائی ناکہ بندی عام طور پر جسمانی علیحدگی سے زیادہ موثر اور عین مطابق ہوتی ہے، کچھ طریقے مختلف وجوہات کی بناء پر نامکمل ہو سکتے ہیں، بشمول: مطابقت پذیر خلیوں کا تناسب ناکافی کیمیائی ہیرا پھیری سیلولر فنکشن میں خلل ڈال سکتا ہے اور/یا خلیوں کے ایک حصے کو مار سکتا ہے۔ علاج زہریلا ہے اور ویو میں لاگو نہیں ہوتا ہے (صرف متعلقہ اگر کلینیکل ایپلی کیشن پر غور کیا جائے) ایم مائٹوٹک گرفتاری میں گرفتاری بہت سے طریقوں کے ذریعے اور ایم مرحلے کے اندر مختلف نکات پر حاصل کی جا سکتی ہے، بشمول جی 2/ایم منتقلی، میٹا فیز/انافس منتقلی، اور مائٹوٹک اخراج۔ نوکوڈازول مائکرو ٹیوبل پولیمرائزیشن کا تیزی سے بدلنے والا روک تھام ہے جسے میٹا فیز/انافس منتقلی میں اسپنڈل اسمبلی چیک پوائنٹ پر انافس سے پہلے خلیوں کو گرفتار کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مائکرو ٹیوبل زہر مائٹوٹک تکلوں کی تشکیل کو روک کر کام کرتا ہے جو خلیوں کو تقسیم کرنے میں بہن کرومیٹائڈز سے منسلک ہوتے ہیں اور انہیں الگ کرتے ہیں۔ خلیات اس وقت تک بند رہیں گے جب تک کہ نوکوڈازول بہہ نہ جائے۔ نوکوڈازول انٹرفیس میٹابولزم میں خلل ڈالتا دکھائی نہیں دیتا، اور خارج شدہ خلیات سیل سائیکل کی معمول کی ترقی پر واپس آجاتے ہیں۔ چونکہ مائکرو ٹیوبلز دیگر سیلولر افعال میں اہم ہیں، نوکوڈازول کے مستقل استعمال کے نتیجے میں ان افعال میں خلل پڑ سکتا ہے، جس سے سیل کی موت ہو سکتی ہے۔ جی 2 سے ایم مرحلے میں منتقلی کے لیے سی ڈی کے 1 سی ڈی کے 1 کی روک تھام ضروری ہے۔ آر او-3306 ایک منتخب سی ڈی کے 1 انفیکٹر ہے جو جی 2/ایم بارڈر پر خلیوں کو الٹا روک سکتا ہے۔ آر او-3306 سائیکلنگ خلیات کا 95 ٪ (بشمول کینسر کے خلیات) مطابقت پذیر ہوتا ہے، اور خارج ہونے والے خلیات تیزی سے مائٹوسس میں داخل ہوتے ہیں۔ راسکووٹائن کا استعمال کنیز کے اے ٹی پی بائنڈنگ خطے میں اے ٹی پی کے ساتھ مقابلہ کرکے سائکلین پر منحصر کنیز (سی ڈی کے) کی سرگرمی کو روکنے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ اس کے اثرات طاقتور ہوتے ہیں، سیل سائیکل کی ترقی کے لیے ضروری سی ڈی کے کے کام کو روک کر خلیوں کو گرفتار کرتے ہیں۔ روسکووٹائن کا استعمال G0/G1، G1/S، یا G2/M منتقلی میں خلیوں کو روکنے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ کولچیسین میٹافیز میں خلیوں کو گرفتار کرتا ہے اور یہ ایک مائکرو ٹیوبل زہر ہے جو مائٹوٹک تکلے کی تشکیل کو روکتا ہے، بالکل نوکوڈازول کی طرح۔ یہ مائکرو ٹیوبلز میں ٹیوبلین کو ڈی پولیمرائز کرکے، اسپنڈل اسمبلی چیک پوائنٹ پر مستقل گرفتاری کے ذریعے انافس کی طرف بڑھنے سے روک کر کام کرتا ہے۔ ایس مرحلے میں گرفتاری (جی 1/ایس گرفتاری) ایس مرحلے میں گرفتاری میں عام طور پر ڈی این اے کی ترکیب کی روک تھام شامل ہوتی ہے کیونکہ جینوم کی نقل تیار کی جا رہی ہوتی ہے۔ زیادہ تر طریقے دھونے کے ذریعے تبدیل کیے جا سکتے ہیں۔ ڈبل تھائمیڈائن بلاک تھائمیڈائن کی زیادہ مقدار مسابقتی روک تھام کے ذریعے ڈی آکسینوکلیوٹائڈ میٹابولزم کے راستے میں خلل ڈالتی ہے، اس طرح ڈی این اے کی نقل کو روکتی ہے۔ تھائمیڈائن کے ساتھ ایک واحد علاج پورے ایس مرحلے میں خلیوں کو گرفتار کرتا ہے، لہذا ایک ڈبل علاج ابتدائی ایس مرحلے میں زیادہ یکساں بلاک پیدا کرنے کا کام کرتا ہے۔ یہ عمل تھائمیڈائن کے علاج، کلچر کو دھونے، اور اس کے بعد ایک اور تھائمیڈائن کے علاج سے شروع ہوتا ہے۔ ہائیڈروکسوریا ہائڈروکسوریا ربنیوکلیوٹائڈ ریڈکٹیس انزائم کو روک کر ڈی این ٹی پیز کی پیداوار کو کم کرتا ہے۔ یہ نقل کے کانٹوں پر ڈی این ٹی پیز کے ڈی این اے پولیمریز کو محروم کرکے ڈی این اے کی ترکیب کو روکنے کا کام کرتا ہے۔ ہائیڈروکسیریا کا استعمال بعض قسم کے کینسر اور خون کی خرابیوں کے علاج کے لیے بھی کیا جاتا ہے۔ ایفیڈیکولن ایفیڈوکولن ایک فنگس سے ماخوذ ٹیٹراسائکلک ڈائٹرپینائڈ ہے جو ڈی این اے پولیمریز α کے لیے انتخابی رکاوٹ کے طور پر کام کرتا ہے۔ یہ انزائم نقل کرنے والے ڈی این اے کی ترکیب کے لیے ضروری ہے، لیکن ڈی این اے کی مرمت کی ترکیب یا مائٹوکونڈریل ڈی این اے کی نقل میں خلل نہیں ڈالتا ہے۔ G1 میں گرفتاری G1 میں خلیوں کی ہم آہنگی کے لیے ایک عام طور پر استعمال ہونے والا کیمیائی طریقہ موجود ہے۔ اس میں لووسٹیٹن شامل ہے، جو 3-ہائیڈروکسی-3-میتھائلگلوٹریل-کوینزیم اے ریڈکٹیس کا ایک ریورسیبل مسابقتی انفیکٹر ہے، جو میوالونک ایسڈ کی پیداوار میں اہم انزائم ہے۔ میوالونک ایسڈ میوالونیٹ راستے میں ایک کلیدی انٹرمیڈیٹ ہے جو کولیسٹرول کی ترکیب کے لیے ذمہ دار ہے۔ لووسٹیٹن کے علاج شدہ خلیوں میں کولیسٹرول کا اضافہ گرفتاری کے اثر کو ختم نہیں کرتا ہے، لہذا لووسٹیٹن راستے میں کچھ ابتدائی انٹرمیڈیٹ کی تشکیل کو روکتا دکھائی دیتا ہے جو ابتدائی جی 1 کے ذریعے ترقی کے لیے ضروری ہے۔ مطابقت پذیری کے دیگر طریقے مائٹوٹک سلیکشن مائٹوٹک سلیکشن ایک مونو لیئر سے مائٹوٹک خلیوں کے انتخاب کے لیے ایک منشیات سے پاک طریقہ کار ہے جو تیز رفتار نمو سے گزر رہا ہے۔ مائٹوسس کے دوران، خلیات مورفولوجی میں تبدیلیوں سے گزرتے ہیں، اور مائٹوٹک انتخاب یک پرت میں اگنے والے مستقل خلیات میں اس کا فائدہ اٹھاتا ہے۔ کلچرل پلیٹ سے منسلک سیل جھلی کے سطحی رقبے کو کم کرتے ہوئے خلیات زیادہ گول ہو جاتے ہیں۔ اس لیے مائٹوٹک خلیوں کو آہستہ سے ہلا کر اور سپر نیٹنٹ سے جمع کر کے مکمل طور پر الگ کیا جا سکتا ہے۔ غذائیت/سیرم سے محرومی کلچر میڈیم سے تقریبا 24 گھنٹوں تک سیرم کے خاتمے کے نتیجے میں G0 سکون اور ابتدائی G1 کے درمیان منتقلی پر خلیات جمع ہوتے ہیں۔ یہ گرفتاری سیرم یا محروم غذائیت کے اضافے کے ذریعے آسانی سے واپس آسکتی ہے۔ رہائی کے بعد، خلیے کے چکر کے ذریعے ترقی متغیر ہوتی ہے، کیونکہ کچھ خلیے خاموش رہتے ہیں جبکہ دیگر متغیر شرحوں پر خلیے کے چکر سے گزرتے ہیں۔ رابطہ کی روک تھام رابطہ کی روک تھام اس وقت ہوتی ہے جب خلیوں کو اونچے یا مکمل سنگم تک بڑھنے دیا جاتا ہے، جس سے سیل سے سیل کا رابطہ زیادہ سے زیادہ ہوتا ہے۔ یہ عام خلیوں میں ابتدائی G1 میں گرفتاری کو متحرک کرتا ہے۔ کم کثافت پر خلیوں کی نقل کرکے گرفتاری کو الٹ دیا جاتا ہے۔ کینسر کے پھیلاؤ کو فروغ دینے والی تغیرات کی وجہ سے، ٹیومر سیل لائنیں عام طور پر رابطے کی روک تھام سے گزرنے کے قابل نہیں ہوتی ہیں، حالانکہ اس میں مستثنیات بھی ہیں۔ بیرونی روابط سیل سنکرونائزیشن پروٹوکول حوالہ جات سیل حیاتیات