Structured Illumination Light Sheet Microscopy
اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن لائٹ شیٹ مائکروسکوپی (ایس آئی-ایل ایس ایم) ایک آپٹیکل امیجنگ تکنیک ہے جو تینوں جہتوں میں اعلی عارضی اور مقامی ریزولوشن کے ساتھ والیومیٹرک امیجنگ حاصل کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ یہ ساختی روشنی مائکروسکوپی کی اعلی محوری اور مقامی ریزولوشن خصوصیت کے ساتھ نسبتا موٹے نمونوں میں مقامی ریزولوشن کو برقرار رکھنے کے لیے لائٹ شیٹ مائکروسکوپی کی صلاحیت کو یکجا کرتا ہے۔ ایس آئی-ایل ایس ایم سینکڑوں مائکرو میٹر موٹے حیاتیاتی نمونوں میں 100 این ایم سے نیچے لیٹرل ریزولوشن حاصل کر سکتا ہے۔ ایس آئی-ایل ایس ایم اکثر زندہ حیاتیاتی نمونوں، جیسے سیل کلچرز کی فلوروسینٹ امیجنگ کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ یہ خاص طور پر طول البلد مطالعات کے لیے مفید ہے، جہاں نمونے کو نقصان پہنچائے بغیر طویل عرصے تک ہائی ریٹ امیجنگ کی جانی چاہیے۔ تھری ڈی نمونوں کی فلوروسینٹ امیجنگ کے لیے سب سے زیادہ استعمال ہونے والے دو طریقے-کنفوکل مائکروسکوپی اور وائڈ فیلڈ مائکروسکوپی-دونوں میں اس قسم کی درخواست کے لیے اہم خامیاں ہیں۔ وائڈ فیلڈ مائکروسکوپی میں، دلچسپی کے سطح سے ان فوکس روشنی کے ساتھ ساتھ باقی نمونے سے آؤٹ آف فوکس روشنی دونوں ایک ساتھ حاصل کی جاتی ہیں، جس سے "مسنگ کون مسئلہ" پیدا ہوتا ہے جس سے ہائی ریزولوشن امیجنگ مشکل ہو جاتی ہے۔ اگرچہ کنفوکل مائکروسکوپی بڑی حد تک غیر مرکوز روشنی کو روکنے کے لیے پن ہول کا استعمال کرکے اس مسئلے کو حل کرتی ہے، لیکن یہ تکنیک لامحالہ مفید سگنل کو بھی روکتی ہے، جو خاص طور پر فلوروسینٹ امیجنگ میں نقصان دہ ہے جب سگنل پہلے ہی بہت کمزور ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، وائڈ فیلڈ اور کنفوکل مائکروسکوپی دونوں ہی امیجنگ کے دوران پورے نمونے کو روشن کرتے ہیں، جس کی وجہ سے کچھ نمونوں میں فوٹو بلیچنگ اور فوٹوٹوکسائٹی کے مسائل پیدا ہوتے ہیں۔ اگرچہ صرف لائٹ فیلڈ مائکروسکوپی ہی ان میں سے زیادہ تر مسائل کو حل کر سکتی ہے، لیکن اس کا حاصل کردہ حل اب بھی روشنی کے انحراف کی وجہ سے بنیادی طور پر محدود ہے اور یہ سپر ریزولوشن حاصل کرنے سے قاصر ہے۔ ایس آئی-ایل ایس ایم امیج کیے جانے والے حجم کے ایک واحد سطح کو روشن کرنے کے لیے یکساں لائٹ شیٹ کے بجائے نمونے کا استعمال کرتے ہوئے کام کرتا ہے۔ اس طرح، یہ ساختی روشنی مائکروسکوپی کے اعلی ریزولوشن کو حاصل کرتے ہوئے لائٹ شیٹ مائکروسکوپی کے بہت سے فوائد کو برقرار رکھتا ہے۔ پس منظر اور نظریہ ایس آئی-ایل ایس ایم کے پیچھے کے نظریہ کو منظم روشنی اور لائٹ شیٹ مائکروسکوپی کی علیحدہ ترقی پر غور کرکے بہتر طور پر سمجھا جاتا ہے۔ اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی (SIM) سپر ریزولوشن مائکروسکوپی کا ایک طریقہ ہے جو روشنی کے مختلف نمونوں کے تحت ایک ہی نمونے کی متعدد تصاویر حاصل کرکے انجام دیا جاتا ہے، پھر ان تصاویر کو کمپیوٹیشنل طور پر ملا کر ایک ہی تعمیر نو حاصل کرنے کے لیے ڈفریکشن محدود لیٹرل ریزولوشن پر 2x تک بہتری حاصل کی جاتی ہے۔ اس نظریہ کو سب سے پہلے 1995 کے ایک مقالے میں جان ایم گوریرا نے تجویز کیا اور اس پر عمل درآمد کیا جس میں 50 این ایم لائنوں اور خالی جگہوں کے ساتھ ایک سلکان گریٹنگ کو 650 این ایم طول موج (ہوا میں) روشنی کے ساتھ حل کیا گیا تھا جس کی ساخت ایک شفاف نقل پراکسیمل کے ذریعے کی گئی تھی۔ "اسٹرکچرڈ ایلیومینیشن مائکروسکوپی" کا نام 2000 میں ایم جی ایل نے تیار کیا تھا۔ گسٹافسن۔ سم "موائر ایفیکٹ" کا فائدہ اٹھاتا ہے، جو اس وقت ہوتا ہے جب دو نمونوں کو ضرب کے ساتھ سپر امپوز کیا جاتا ہے۔ سپر امپوزیشن "موائر فرنجز" کے ظاہر ہونے کا سبب بنتی ہے، جو اصل پیٹرن سے زیادہ کورسر ہوتے ہیں لیکن پھر بھی ہائی فریکوئنسی پیٹرن کے بارے میں معلومات رکھتے ہیں جو بصورت دیگر نظر نہیں آتے۔ سم کے پیچھے کا نظریہ فورئیر یا فریکوئنسی ڈومین میں بہتر طور پر سمجھا جاتا ہے۔ عام طور پر، امیجنگ سسٹم صرف تفریق کی حد سے نیچے کی تعدد کو حل کر سکتے ہیں۔ اس طرح، فورئیر ڈومین میں، تصویر کے نمونے سے تمام ریکارڈ شدہ تعدد ایک مقررہ رداس کے دائرے میں رہیں گی۔ اس حد سے باہر کسی بھی تعدد کو حل نہیں کیا جا سکتا۔ تاہم، فریکوئنسی سپیکٹرم کو نمونے کی روشنی کے ساتھ امیجنگ کے ذریعے منتقل کیا جا سکتا ہے۔ اکثر، نمونہ ایک 1 ڈی سینوسائڈل میلان ہوتا ہے، جیسے کہ مندرجہ بالا تصویر میں موائر کے کنارے بنانے کے لیے استعمال ہونے والا نمونہ۔ چونکہ سینوسائڈ کا فورئیر ٹرانسفارم ایک منتقل شدہ ڈیلٹا فنکشن ہے، اس پیٹرن کی تبدیلی تین ڈیلٹا افعال پر مشتمل ہوگی: ایک صفر فریکوئنسی پر اور دو سینوسائڈ کے مثبت اور منفی فریکوئنسی اجزاء سے مطابقت رکھتے ہیں (نیچے دی گئی تصویر دیکھیں)۔ جب اس نمونے کا استعمال کرتے ہوئے ہدف کو روشن کیا جاتا ہے، تو ہدف اور روشنی کے نمونے کو ضرب سے سپر امپوز کیا جاتا ہے، جس کا مطلب ہے کہ نتیجے میں آنے والی تصویر کا فورئیر ٹرانسفارم ہدف کے انفرادی تبدیلیوں اور روشنی کے نمونے کا ارتقاء ہے۔ ڈیلٹا فنکشن کے ساتھ کسی بھی فنکشن کو تبدیل کرنے سے اصل فنکشن کے مرکز کو ڈیلٹا فنکشن کے مقام پر منتقل کرنے کا اثر پڑتا ہے۔ اس طرح، اس صورت حال میں، ہدف کے فریکوئنسی سپیکٹرم کو منتقل کر دیا جاتا ہے اور فریکوئنسی جو پہلے حل کرنے کے لیے بہت زیادہ تھیں اب قابل حل فریکوئنسی کے دائرے میں آتی ہیں۔ نتیجہ یہ ہے کہ سم کے ساتھ ایک ہی تصویر کے حصول کے لیے، فورئیر ڈومین میں تین الگ الگ علاقوں سے فریکوئنسی اجزاء (مرکز اور مثبت اور منفی شفٹوں سے مطابقت رکھتے ہیں) سب کو ایک ساتھ پکڑا جاتا ہے۔ آخر میں، کیونکہ مقامی ڈومین میں گردش کے نتیجے میں فورئیر ڈومین میں ایک ہی گردش ہوتی ہے، روشنی کے نمونے کو گھما کر مکمل 360° سے زیادہ اعلی تعدد کو پکڑا جا سکتا ہے۔ شکل ب) نیچے دی گئی تصویر میں دکھایا گیا ہے کہ فریکوئنسی کے کون سے اجزاء کو 4 الگ الگ تصاویر حاصل کرکے اور ہر حصول کے درمیان روشنی کے نمونے کو 45 ڈگری گھما کر پکڑا جائے گا۔ ایک بار جب تمام تصاویر پر قبضہ کر لیا جاتا ہے، تو ایک واحد حتمی تصویر کو کمپیوٹیشنل طور پر دوبارہ تعمیر کیا جا سکتا ہے۔ اس تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے، ریزولوشن کو ڈفریکشن کی حد سے 2x تک بہتر بنایا جا سکتا ہے۔ یہ 2x حد عائد کی گئی ہے کیونکہ روشنی کا نمونہ خود اب بھی انحراف محدود ہے۔ 2 ڈی سم کے پیچھے تصورات کو 3 ڈی والیومیٹرک امیجنگ تک بڑھایا جا سکتا ہے۔ ایکسائٹیشن لائٹ کی تین باہمی مربوط بیموں کا استعمال کرتے ہوئے، امیجڈ نمونے میں متعدد فریکوئنسی اجزاء کے ساتھ مداخلت کے نمونے بنائے جا سکتے ہیں۔ یہ بالآخر تینوں محوروں کے ساتھ 2x تک بہتر ریزولوشن کے ساتھ 3D تعمیر نو انجام دینا ممکن بناتا ہے۔ تاہم، حیاتیاتی بافتوں کے مضبوط بکھرنے کے گتانک کی وجہ سے، یہ نظریاتی حل صرف 10 ام سے پتلے نمونوں میں حاصل کیا جا سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، بکھرنا پس منظر کے اشارے کی زیادتی کا باعث بنتا ہے جو درست تعمیر نو کو ناممکن بنا دیتا ہے۔ لائٹ شیٹ مائکروسکوپی لائٹ شیٹ مائکروسکوپی (ایل ایس ایم) کو جسمانی سیکشننگ یا کلیئرنگ کی ضرورت کے بغیر موٹے حیاتیاتی نمونوں کی باریک نظری سیکشننگ کی اجازت دینے کے لیے تیار کیا گیا تھا، جو وقت طلب اور ان ویو امیجنگ کے لیے نقصان دہ دونوں ہیں۔ جبکہ زیادہ تر فلوروسینٹ امیجنگ تکنیک منسلک روشنی اور پتہ لگانے والے محوروں کا استعمال کرتی ہیں، ایل ایس ایم آرتھوگنل محوروں کا استعمال کرتا ہے۔ نمونے کو طرف سے روشن کرنے کے لیے ایک فوکسڈ لائٹ شیٹ کا استعمال کیا جاتا ہے، جبکہ اوپر سے فلوروسینٹ سگنل کا پتہ لگایا جاتا ہے۔ یہ دونوں طیاروں کی فعال طور پر امیج نہ کیے جانے سے آؤٹ آف فوکس شراکت کو ختم کرکے وائڈ فیلڈ مائکروسکوپی کے "شنک کے مسئلے" کو ختم کرتے ہیں اور فوٹو بلیچنگ کے اثر کو کم کرتے ہیں کیونکہ پورے نمونے کو امیجنگ کے دوران روشن نہیں کیا جاتا ہے۔ اس کے علاوہ، چونکہ نمونے کو ایک طرف سے روشن کیا جاتا ہے، روشنی کی روشنی کا فوکس گہرائی پر منحصر نہیں ہوتا ہے، جس سے حیاتیاتی نمونوں کی حجم امیجنگ کہیں زیادہ ممکن ہو جاتی ہے۔ ایل ایس ایم میں ایک بڑا جاری چیلنج لائٹ شیٹ کی تشکیل میں ہے۔ عام طور پر، آپٹیکل محور پر لائٹ شیٹ کی موٹائی (جو بڑی حد تک محوری ریزولوشن کا تعین کرتی ہے) اور فیلڈ آف ویو کے درمیان ایک ٹریڈ آف ہوتا ہے جس پر لائٹ شیٹ کافی موٹائی برقرار رکھتی ہے۔ اس مسئلے کو ایس آئی-ایل ایس ایم کے اضافی حل سے جزوی طور پر حل کیا جا سکتا ہے۔ تکنیک ایس آئی-ایل ایس ایم کو دو اہم زمروں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔ آپٹیکل سیکشننگ ایس آئی-ایل ایس ایم سب سے عام نقطہ نظر ہے اور غیر مرکوز پس منظر سگنل کے اثر کو مزید کم کرکے محوری ریزولوشن کو بہتر بناتا ہے۔ سپر ریزولوشن ایس آئی-ایل ایس ایم 3 ڈی نمونوں میں سپر ریزولوشن حاصل کرنے کے لیے 2 ڈی سم کی روشنی اور تعمیر نو کی تکنیکوں کا استعمال کرتا ہے۔ آپٹیکل سیکشننگ ایس آئی-ایل ایس ایم آپٹیکل سیکشننگ ایس آئی-ایل ایس ایم (او ایس-ایس آئی-ایل ایس ایم) کو پہلی بار 1997 کے ایک مقالے میں ایم اے نے بیان کیا تھا۔ نیل اور دیگر۔ سپر ریزولوشن حاصل کرنے کے بجائے، یہ تکنیک ان تہوں سے پس منظر کی دھند کو ہٹا کر محوری ریزولوشن کو بہتر بنانے کے لیے ساختی روشنی کے پیچھے کے خیالات کا استعمال کرتی ہے جہاں روشن روشنی کی شیٹ سب سے زیادہ مرکوز ہوتی ہے۔ اگرچہ اس کو حاصل کرنے کے کئی طریقے ہیں، لیکن سب سے عام نقطہ نظر کو "تھری فیز" سم کے نام سے جانا جاتا ہے، جسے یہاں بیان کیا جائے گا۔ نیل پیپر میں یہ دکھایا گیا ہے کہ گرڈ کی روشنی کے نمونے کے ساتھ ہدف کی امیجنگ کے ذریعے حاصل کردہ سگنل کو درج ذیل مساوات کے ذریعے ظاہر کیا جا سکتا ہے: یہاں، پس منظر کا سگنل ہے، جبکہ اور گرڈ کے کوسائن اور سائن اجزاء کے ذریعے روشن کردہ ہدف کے علاقے سے سگنل ہیں۔ یہ بھی دکھایا گیا ہے کہ دلچسپی کے سطح کی ایک ان فوکس تصویر کو مساوات کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ تعمیر کیا جا سکتا ہے: یہ گرڈ کی روشنی کے حالات میں تین الگ الگ تصاویر حاصل کرکے، ہر حصول کے درمیان گرڈ کو 60 ڈگری سے گھما کر حاصل کیا جا سکتا ہے۔ اس کے بعد مطلوبہ 2 ڈی تصویر کو مساوات کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ تعمیر کیا جا سکتا ہے: یہ ایک 2 ڈی تصویر بناتا ہے جس میں گرڈ کی روشنی کے نمونے کے زیادہ تر مرکوز علاقے سے صرف معلومات ہوتی ہیں۔ اگر یہ نمونہ لائٹ شیٹ کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا ہے، تو پھر شیٹ کو محوری سمت میں اسکین کیا جا سکتا ہے تاکہ نمونے کی مکمل 3D تعمیر نو پیدا کی جا سکے۔ پس منظر کے اشارے کو کم کرنے کے لیے اس نقطہ نظر کو استعمال کرنے کی بنیادی خرابی یہ ہے کہ یہ بالآخر دو تصاویر کے درمیان مشترکہ پس منظر کے اشارے کو گھٹانے پر منحصر ہے۔ کچھ ان فوکس سگنل لامحالہ پس منظر کی دھند کے ساتھ گھٹا دیا جائے گا۔ اس کے نتیجے میں سگنل کی مجموعی کمی ہوگی، جو کم سگنل والی فلوروسینٹ امیجنگ میں نقصان دہ ہو سکتی ہے۔ بہر حال، یہ تکنیک ایس آئی-ایل ایس ایم کا سب سے عام استعمال ہے اور اس نے صرف ایل ایس ایم پر بہتر محوری ریزولوشن دکھایا ہے۔ سپر ریزولوشن ایس آئی-ایل ایس ایم سپر ریزولوشن ایس آئی-ایل ایس ایم (ایس آر-ایس آئی-ایل ایس ایم) 2 ڈی یا 3 ڈی سم کی تکنیکوں کا استعمال کرتا ہے جبکہ لائٹ شیٹ کو روشنی کے ذریعہ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے سم کے مقامی ریزولوشن کے ساتھ ساتھ ڈیپتھ انڈیپینڈنٹ امیجنگ اور ایل ایس ایم کی کم فوٹو بلیچنگ حاصل کرتا ہے۔ سب سے عام ایپلی کیشن میں، ایک لائٹ شیٹ کا استعمال 3D ٹارگٹ نمونے کے ایک ہی سطح پر 1D سینوسائڈل پیٹرن بنانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد پیٹرن کو اس واحد جہاز پر متعدد بار گھمایا جاتا ہے تاکہ ہائی ریزولوشن 2 ڈی تعمیر نو کے لیے کافی تصاویر حاصل کی جا سکیں۔ روشنی کو محوری ریزولوشن میں اسکین کیا جاتا ہے اور اس عمل کو اس وقت تک دہرایا جاتا ہے جب تک کہ مکمل 3D تعمیر نو کے لیے کافی 2D تصاویر نہ ہوں۔ عام طور پر، یہ نقطہ نظر نہ صرف بہتر ریزولوشن کا مظاہرہ کرتا ہے بلکہ او ایس-ایس آئی-ایل ایس ایم پر بہتر ایس این آر کا بھی مظاہرہ کرتا ہے، کیونکہ تعمیر نو میں کوئی معلومات ضائع نہیں کی جاتی ہے۔ اس کے علاوہ، اگرچہ ایس آر-ایس آئی-ایل ایس ایم کے لیے نظریاتی ریزولوشن 3 ڈی سم سے قدرے کم ہے، لیکن گہرائی> 10 ام میں یہ تکنیک ایل ایس ایم کی روشنی کی خصوصیت کی گہرائی سے آزاد فوکسنگ کی وجہ سے 3 ڈی سم پر بہتر کارکردگی دکھاتی ہے۔ نفاذ ایس آئی-ایل ایس ایم میں ایک بڑا چیلنج انجینئرنگ سسٹم ہے جو جسمانی طور پر لائٹ شیٹس میں ساختی نمونے پیدا کرنے کے قابل ہیں۔ اس کو پورا کرنے کے تین اہم طریقے انٹرفیرنگ لائٹ شیٹس، ڈیجیٹل ایل ایس ایم، اور اسپاٹیل لائٹ ماڈیولٹرز کا استعمال کر رہے ہیں۔ مداخلت کرنے والی لائٹ شیٹس کے ساتھ، نمونے میں دو مربوط کاؤنٹر پروپیگیٹنگ شیٹس بھیجی جاتی ہیں۔ ان چادروں کے درمیان مداخلت کا نمونہ مطلوبہ روشنی کا نمونہ بناتا ہے، جسے چادروں کو موڑنے کے لیے گھومنے والے آئینے کا استعمال کرتے ہوئے گھمایا اور اسکین کیا جا سکتا ہے۔ روشنی کے نمونوں کو پیدا کرنے کے لیے ڈیجیٹل لائٹ شیٹ مائکروسکوپی کا استعمال کرکے اضافی لچک شامل کی جا سکتی ہے۔ ڈیجیٹل ایل ایس ایم میں، نمونے کے ذریعے لیزر بیم کو تیزی سے اسکین کرکے لائٹ شیٹ بنائی جاتی ہے۔ یہ لیزر کی شدت کو اسکین کرتے ہوئے ماڈیول کرکے مخصوص روشنی کے نمونے پر عمدہ کنٹرول کی اجازت دیتا ہے۔ اس تکنیک کا استعمال ایس آئی-ایل ایس ایم کے علاوہ متعدد قسم کے لائٹ شیٹ مائکروسکوپی کے قابل نظام بنانے کے لیے کیا گیا ہے۔ آخر میں، مقامی لائٹ ماڈیولٹرز کو روشنی کے نمونوں کو الیکٹرانک طور پر کنٹرول کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جس میں نمونوں کے درمیان بہت عمدہ کنٹرول اور تیزی سے تبدیلی کی اجازت دینے کا فائدہ ہے۔ اس کے علاوہ، ایس آئی-ایل ایس ایم کے ارد گرد حالیہ کام کا زیادہ تر حیاتیاتی بافتوں میں گہری امیجنگ کے لیے دیگر تکنیکوں کے ساتھ نقطہ نظر کو یکجا کرنے پر مرکوز ہے۔ مثال کے طور پر، 2021 کے ایک مقالے میں این آئی آر-II روشنی کے ساتھ ایس آئی-ایل ایس ایم کے استعمال کا مظاہرہ کیا گیا تاکہ ٹرانسکرینیئل ماؤس برین امیجنگ کے ریزولوشن کو ~ 1.7x تک بہتر بنایا جا سکے جس میں ~ 750 یو ایم کی دخول کی گہرائی اور سگنل ٹو بیک گراؤنڈ تناسب میں تقریبا 16x بہتری ہو۔ دیگر امید افزا سمتوں میں ایل ایس ایم میں لائٹ شیٹس کی تشکیل کے لیے سم کو دیگر تکنیکوں کے ساتھ جوڑنا، ایس آئی-ایل ایس ایم کو دو فوٹون ایکسائٹیشن کے ساتھ جوڑنا، یا ریزولوشن کی حدود کو مزید آگے بڑھانے کے لیے غیر لکیری فلوروسینس کا استعمال کرنا شامل ہے۔ حوالہ جات مائکروسکوپی آپٹیکل امیجنگ حجم آلات