ChIP-exo
CHIP-exo ان مقامات کی نقشہ سازی کے لیے کرومیٹن امیونوپریسیپیٹیشن پر مبنی طریقہ ہے جس پر دلچسپی کا پروٹین (ٹرانسکرپشن فیکٹر) جینوم سے جڑا ہوتا ہے۔ یہ CHIP-SEQ پروٹوکول کی ایک ترمیم ہے، جس سے بائنڈنگ سائٹس کے ریزولوشن کو سینکڑوں بیس جوڑوں سے تقریبا ایک بیس جوڑے میں بہتر بنایا گیا ہے۔ یہ پروٹین بائنڈنگ سائٹ کے نیوکلیوٹائڈز کی ایک چھوٹی سی تعداد کے اندر 5 '-3' سمت میں پروٹین بائنڈ ڈی این اے کے تاروں کو کم کرنے کے لیے ایکسونیوکلیسیس کے استعمال کو استعمال کرتا ہے۔ ایکسونکیولیز سے علاج شدہ سروں کے نیوکلیوٹائڈز کا تعین ڈی این اے سیکوینسنگ، مائیکرو ایریز اور پی سی آر کے کچھ امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد ان ترتیبات کو جینوم میں نقشہ بنایا جاتا ہے تاکہ جینوم پر ان مقامات کی شناخت کی جا سکے جہاں پروٹین جڑا ہوتا ہے۔ نظریہ کرومیٹن امیونوپریسیپیٹیشن (CHIP) تکنیک 1984 سے پروٹین-DNA تعاملات کا پتہ لگانے کے لیے استعمال میں ہے۔ نتائج کے معیار کو بہتر بنانے کے لیے چپ پر بہت سے تغیرات ہوئے ہیں۔ ایسی ہی ایک بہتری، چپ-آن-چپ (چپ-چپ)، چپ کو مائیکرو ارے ٹیکنالوجی کے ساتھ جوڑتی ہے۔ اس تکنیک میں محدود حساسیت اور خاصیت ہوتی ہے، خاص طور پر ویو میں جہاں مائیکرو ارے جوہری ڈبے میں موجود ہزاروں پروٹین سے محدود ہوتے ہیں، جس کے نتیجے میں غلط مثبت کی شرح زیادہ ہوتی ہے۔ اس کے بعد CHIP-سیکوینسنگ (CHIP-SEQ) آئی، جو CHIP کو ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے ساتھ جوڑتی ہے۔ تاہم، کٹے ہوئے ڈی این اے کے ٹکڑوں کی متنوع نوعیت بائنڈنگ سائٹس کو ±300 بیس جوڑوں کے اندر نقشہ بناتی ہے، جس سے خاصیت محدود ہوتی ہے۔ دوسرا، ڈی این اے کو آلودہ کرنا ایک سنگین مسئلہ پیش کرتا ہے کیونکہ بہت کم جینیاتی لوکی دلچسپی کے پروٹین سے جڑے ہوتے ہیں، جس سے کوئی بھی غیر مخصوص جینومک ڈی این اے پس منظر کے شور کا ایک اہم ذریعہ بن جاتا ہے۔ ان مسائل کو حل کرنے کے لیے، ری اور پگ نے چپ-ایکسو تیار کرنے کے لیے کلاسیکی نیوکلیز پروٹیکشن اسیس میں ترمیم کی۔ یہ نئی CHIP تکنیک ایک لیمبڈا ایکسونوکلیز پر انحصار کرتی ہے جو صرف اور تمام غیر پابند ڈبل اسٹرینڈڈ DNA کو 5′-3′ سمت میں خراب کرتی ہے۔ مختصر طور پر، دلچسپی کا ایک پروٹین (ایپیٹوپ ٹیگ والا انجینئرنگ امیونوپریسیپیٹیشن کے لیے مفید ہو سکتا ہے) فارملڈیہائیڈ کا استعمال کرتے ہوئے جینوم کے پار اس کے قدرتی بائنڈنگ مقامات سے ویو میں کراس لنک کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد خلیوں کو جمع کیا جاتا ہے، توڑا جاتا ہے، اور کرومیٹن کو کاٹا جاتا ہے اور سونکیشن کے ذریعے گھلنشیل کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد ایک اینٹی باڈی کا استعمال کراس لنکڈ ڈی این اے کے ساتھ دلچسپی کے پروٹین کو امیونوپریسیپیٹ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد ڈی این اے پی سی آر اڈاپٹرز کو سروں پر لگا دیا جاتا ہے، جو ایکسونیوکلیز ہاضمہ کے بعد دوسرے اسٹرینڈ ڈی این اے کی ترکیب کے لیے ایک ابتدائی نقطہ کے طور پر کام کرتے ہیں۔ لیمبڈا ایکسونکیولیز پھر 5 'سرے سے ڈبل ڈی این اے اسٹرینڈز کو ہضم کرتا ہے جب تک کہ پروٹین-ڈی این اے کوولینٹ تعامل کی سرحد پر ہاضمہ بند نہ ہو جائے۔ زیادہ تر آلودہ کرنے والے ڈی این اے کو دوسرے سنگل اسٹرینڈ مخصوص ایکسونکیولیز کے اضافے سے خراب کیا جاتا ہے۔ کراس لنکنگ کے الٹ جانے کے بعد، پی سی آر اڈاپٹرز کے پرائمرز کو ڈبل اسٹرینڈڈ ڈی این اے بنانے کے لیے بڑھایا جاتا ہے، اور ایک دوسرے اڈاپٹر کو 5 'سروں پر لگا دیا جاتا ہے تاکہ ایکسونیوکلیز ہاضمہ کے خاتمے کے عین مقام کی حد بندی کی جا سکے۔ اس کے بعد لائبریری کو پی سی آر کے ذریعے بڑھایا جاتا ہے، اور مصنوعات کی شناخت ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے ذریعے کی جاتی ہے۔ یہ طریقہ کسی بھی جینوم کے اندر کسی بھی پروٹین بائنڈنگ سائٹ کے لیے ایک بیس جوڑی تک کے ریزولوشن کی اجازت دیتا ہے، جو کہ چپ چپ یا چپ سیک کے مقابلے میں بہت زیادہ ریزولوشن ہے۔ فوائد CHIP-exo کو پروٹین بائنڈنگ مقامات کی شناخت میں سنگل بیس جوڑی ریزولوشن تک چھوڑنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ یہ CHIP-SEQ کے برعکس ہے جو صرف ±300 بیس جوڑوں کے ساتھ پروٹین کی بائنڈنگ سائٹ کا پتہ لگا سکتا ہے۔ غیر پروٹین سے منسلک ڈی این اے کے ٹکڑوں کی آلودگی کے نتیجے میں CHIP تجربات میں غلط مثبت اور منفی کی شرح زیادہ ہو سکتی ہے۔ اس عمل میں ایکسونیوکلیسیس کا اضافہ نہ صرف بائنڈنگ سائٹ کالنگ کے حل کو بہتر بناتا ہے، بلکہ ترتیب سے پہلے محلول سے آلودہ ڈی این اے کو ہٹا دیتا ہے۔ پروٹین جو غیر موثر طور پر نیوکلیوٹائڈ کے ٹکڑے سے جڑے ہوتے ہیں ان کا پتہ چپ-ایکسو کے ذریعے لگانے کا زیادہ امکان ہوتا ہے۔ اس نے، مثال کے طور پر، پہلے دریافت کردہ سے زیادہ سی ٹی سی ایف ٹرانسکرپشن فیکٹر بائنڈنگ سائٹس کی شناخت کی اجازت دی ہے۔ اعلی ریزولوشن اور کم پس منظر کی وجہ سے، Chip-exo کا استعمال کرتے وقت ترتیب کوریج کی کم گہرائی کی ضرورت ہوتی ہے۔ حدود اگر کسی پروٹین-ڈی این اے کمپلیکس میں ایک ہی بائنڈنگ ایونٹ کے اندر کراس لنکنگ کے متعدد مقامات ہیں، تو یہ اس طرح ظاہر ہو سکتا ہے جیسے متعدد الگ بائنڈنگ ایونٹس ہیں۔ یہ ممکنہ طور پر ان پروٹینوں کے ایک ہی واقعہ کے اندر دستیاب بائنڈنگ سائٹس میں سے کسی ایک پر ڈی نیچرڈ اور کراس لنک ہونے کے نتیجے میں ہوتا ہے۔ اس کے بعد ایکسونوکلیز باؤنڈ سائٹس میں سے کسی ایک پر رک جائے گا، اس پر منحصر ہے کہ پروٹین کس سائٹ سے کراس لنک ہے۔ کسی بھی چیپ پر مبنی طریقہ کار کی طرح، اس تکنیک کو استعمال کرنے کے لیے دلچسپی کے پروٹین کے لیے ایک موزوں اینٹی باڈی دستیاب ہونا ضروری ہے۔ ایپلی کیشنز ری اور پگ نقل کے عوامل کے ایک چھوٹے سے مجموعے پر تجزیہ کر کے چپ-ایکسو متعارف کراتے ہیں: خمیر میں ریب 1، گیل 4، پی ایچ ڈی 1، ریپ 1 اور انسان میں سی ٹی سی ایف۔ ریب 1 سائٹس اکثر کلسٹرز میں پائی جاتی تھیں اور ان کلسٹرز میں توقع سے 10 گنا زیادہ قبضہ تھا۔ کلسٹرز میں ثانوی سائٹس ایک بنیادی بائنڈنگ سائٹ سے ~ 40 بی پی پائی گئیں۔ گیل 4 کے بائنڈنگ موفٹس نے چار میں سے تین نیوکلیوٹائڈز کے لیے مضبوط ترجیح ظاہر کی، جس سے گیل 4 اور خارج شدہ نیوکلیوٹائڈ کے درمیان منفی تعامل کا پتہ چلتا ہے۔ پی ایچ ڈی 1 تین مختلف نقشوں کو تسلیم کرتا ہے جو پی ایچ ڈی 1 کے بائنڈنگ نقش کی ابہام کی پچھلی رپورٹوں کی وضاحت کرتا ہے۔ ریپ 1 کو چار نقشوں کو پہچانتے ہوئے پایا گیا۔ اس پروٹین سے جڑے رائبوسومل پروٹین جینوں میں ایک مضبوط اتفاق رائے کے سلسلے کے ساتھ ایک خاص موٹف کا استعمال کرنے کا رجحان تھا۔ دوسرے جین اکثر کمزور اتفاق رائے کے نقشوں کے کلسٹرز کا استعمال کرتے تھے، ممکنہ طور پر اسی طرح کا قبضہ حاصل کرنے کے لیے۔ سی ٹی سی ایف کے بائنڈنگ موفٹس نے چار "ماڈیولز" کا استعمال کیا۔ باؤنڈ سی ٹی سی ایف سائٹس میں سے نصف نے ماڈیول 1 اور 2 کا استعمال کیا، جبکہ باقی نے چاروں کے کچھ امتزاج کا استعمال کیا۔ یہ خیال کیا جاتا ہے کہ سی ٹی سی ایف ان ماڈیولز کے مختلف امتزاج کو پہچاننے کے لیے اپنی زنک انگلیوں کا استعمال کرتا ہے۔ ری اور پگ نے ساکرومیسیس جینومز میں پری انیشی ایشن کمپلیکس (پی آئی سی) کی ساخت اور تنظیم کا تجزیہ کیا۔ Chip-exo کا استعمال کرتے ہوئے، وہ دیگر دریافتوں کے علاوہ، پروموٹروں میں ٹاٹا جیسی خصوصیات کی درست شناخت کرنے میں کامیاب رہے جن کی اطلاع ٹاٹا سے کم ہے۔ یہ بھی دیکھیں کہ کرومیٹن امیونوپریسیپیٹیشن چپ-سیکوینسنگ چپ-آن-چپ پروٹین-ڈی این اے تعامل حوالہ جات بیرونی روابط ہائی ڈیفینیشن میں ڈی این اے-پروٹین تعاملات ہائی ریزولوشن کرومیٹن امیونوپریسیپیٹیشن کو حل کرنے والے ٹرانسکرپشن فیکٹر بائنڈنگ اہم جین-ریگولیشن پروٹین نئے طریقہ سیکسور کے ذریعہ نشان زد ہیں: ایک آر/بائیو کنڈکٹر پیکیج تاکہ چپ-ایکسو میں ہائی ریزولوشن پروٹین-ڈی این اے تعاملات کو بے نقاب کیا جا سکے۔