Single particle analysis
سنگل پارٹیکل تجزیہ متعلقہ کمپیوٹرائزڈ امیج پروسیسنگ تکنیکوں کا ایک گروپ ہے جو ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (ٹی ای ایم) سے تصاویر کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ یہ طریقے ذرات کے نمونوں، عام طور پر پروٹین یا دیگر بڑے حیاتیاتی اداروں جیسے وائرس کی ٹی ای ایم تصاویر سے حاصل ہونے والی معلومات کو بہتر بنانے اور بڑھانے کے لیے تیار کیے گئے تھے۔ داغدار یا غیر داغدار ذرات کی انفرادی تصاویر بہت شور مچاتی ہیں، اور ان کی تشریح کرنا بہت مشکل ہے۔ اسی طرح کے ذرات کی کئی ڈیجیٹائزڈ تصاویر کو ایک ساتھ جوڑنے سے ایک ایسی تصویر ملتی ہے جس میں مضبوط اور زیادہ آسانی سے قابل تشریح خصوصیات ہوتی ہیں۔ اس تکنیک کی توسیع ذرہ کی سہ جہتی تعمیر نو کے لیے واحد ذرہ طریقوں کا استعمال کرتی ہے۔ کریو الیکٹران خوردبین کا استعمال کرتے ہوئے سب نینومیٹر ریزولوشن اور قریب جوہری ریزولوشن کے ساتھ تعمیر نو کرنا ممکن ہو گیا ہے پہلے انتہائی ہم آہنگ وائرس کے معاملے میں، اور اب چھوٹے، غیر متناسب پروٹین میں بھی۔ واحد ذرہ تجزیہ انڈیوسڈ کپلڈ پلازما ماس سپیکٹروسکوپی (آئی سی پی-ایم ایس) کے ذریعے بھی کیا جا سکتا ہے۔ تکنیکیں ایک ذرہ تجزیہ منفی داغدار اور وٹریس آئس ایمبیڈڈ ٹرانسمیشن الیکٹران کریومیکروسکوپی (کریو ٹی ای ایم) نمونوں دونوں پر کیا جا سکتا ہے۔ واحد ذرہ تجزیہ کے طریقے، عام طور پر، نمونے کے یکساں ہونے پر منحصر ہوتے ہیں، حالانکہ تشخیصی متفرقیت سے نمٹنے کے لیے تکنیکیں تیار کی جا رہی ہیں۔ تصاویر (مائیکرو گراف) کو الیکٹران خوردبین سے چارجڈ جوڑے والے ڈیوائس (سی سی ڈی) ڈٹیکٹرز کا استعمال کرتے ہوئے لیا جاتا ہے جو فاسفورسنٹ پرت سے جڑے ہوتے ہیں (ماضی میں، انہیں فلم پر جمع کیا جاتا تھا اور اعلی معیار کے اسکینرز کا استعمال کرتے ہوئے ڈیجیٹائز کیا جاتا تھا)۔ امیج پروسیسنگ خصوصی سافٹ ویئر پروگراموں کا استعمال کرتے ہوئے کی جاتی ہے، جو اکثر ملٹی پروسیسر کمپیوٹر کلسٹرز پر چلتے ہیں۔ نمونے یا مطلوبہ نتائج پر منحصر ہے، دو یا تین جہتی پروسیسنگ کے مختلف مراحل کیے جا سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، واحد ذرہ تجزیہ آئی سی پی-ایم ایس یونٹ کا استعمال کرتے ہوئے انفرادی ذرہ موڈ میں بھی کیا جا سکتا ہے۔ صف بندی اور درجہ بندی حیاتیاتی نمونے، اور خاص طور پر پتلی شیشے کی برف میں سرایت شدہ نمونے، تابکاری کے لیے انتہائی حساس ہوتے ہیں، اس طرح نمونے کی تصویر کے لیے صرف کم الیکٹران کی خوراکیں استعمال کی جا سکتی ہیں۔ یہ کم خوراک، نیز استعمال شدہ دھات کے داغ میں تغیرات (اگر استعمال کیا جائے) کا مطلب ہے کہ تصاویر میں مشاہدہ کیے جانے والے ذرہ کے دیئے گئے سگنل کے مقابلے میں زیادہ شور ہوتا ہے۔ اسی طرح کی کئی تصاویر کو ایک دوسرے کے ساتھ صف بندی کرکے تاکہ وہ رجسٹر میں ہوں اور پھر ان کا اوسط بنا کر، زیادہ سگنل سے شور کے تناسب والی تصویر حاصل کی جا سکتی ہے۔ چونکہ شور زیادہ تر تصادفی طور پر تقسیم کیا جاتا ہے اور بنیادی تصویر مستقل خصوصیات رکھتی ہے، اس لیے ہر پکسل کی شدت کو کئی تصاویر پر اوسط کرنے سے صرف مستقل خصوصیات کو تقویت ملتی ہے۔ عام طور پر، ایک تصویر کو دوسری تصویر پر نقش کرنے کے لیے زیادہ سے زیادہ صف بندی (ترجمہ اور ہوائی جہاز میں گردش) کا حساب کراس ارتباط کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ تاہم، ایک مائیکرو گراف اکثر متعدد مختلف سمتوں اور/یا تشکیلوں میں ذرات پر مشتمل ہوتا ہے، اور اس لیے زیادہ نمائندہ تصویری اوسط حاصل کرنے کے لیے، اسی طرح کی ذرہ تصاویر کو متعدد سیٹوں میں گروپ کرنے کے لیے ایک طریقہ درکار ہوتا ہے۔ یہ عام طور پر کئی اعداد و شمار کے تجزیے اور تصویری درجہ بندی کے الگورتھم میں سے ایک کا استعمال کرتے ہوئے کیا جاتا ہے، جیسے کہ کثیر متغیر شماریاتی تجزیہ اور درجہ بندی چڑھائی کی درجہ بندی، یا k-کا مطلب کلسٹرنگ۔ اکثر دسیوں ہزار ذرہ تصاویر کے ڈیٹا سیٹ استعمال کیے جاتے ہیں، اور ایک بہترین حل تک پہنچنے کے لیے صف بندی اور درجہ بندی کا ایک تکراری طریقہ کار استعمال کیا جاتا ہے، جس کے تحت درجہ بندی کے ذریعے تیار کردہ مضبوط تصویری اوسط کو پورے ڈیٹا سیٹ کی بعد کی صف بندی کے لیے حوالہ تصاویر کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ امیج فلٹرنگ امیج فلٹرنگ (بینڈ پاس فلٹرنگ) اکثر امیجز میں اعلی اور/یا کم مقامی تعدد کی معلومات کے اثر کو کم کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، جو صف بندی اور درجہ بندی کے طریقہ کار کے نتائج کو متاثر کر سکتا ہے۔ یہ خاص طور پر منفی داغ کی تصاویر میں مفید ہے۔ الگورتھم فاسٹ فورئیر ٹرانسفارمز (ایف ایف ٹی) کا استعمال کرتے ہیں، جو اکثر مخصوص فریکوئنسی کی حدود کو دبانے کے لیے باہمی جگہ میں گوسیائی شکل کے نرم کنارے والے ماسک کا استعمال کرتے ہیں۔ ہائی پاس فلٹر کم مقامی تعدد (جیسے ریمپ یا گریڈینٹ اثرات) کو ہٹا دیتے ہیں، اور اعلی تعدد کو برقرار رکھتے ہیں۔ لو پاس فلٹر اعلی مقامی تعدد کی خصوصیات کو ہٹا دیتے ہیں اور عمدہ تفصیلات پر دھندلا اثر ڈالتے ہیں۔ کانٹریسٹ ٹرانسفر فنکشن الیکٹران خوردبین میں امیج کی تشکیل کی نوعیت کی وجہ سے، برائٹ فیلڈ TEM امیجز اہم انڈر فوکس کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی جاتی ہیں۔ یہ، خوردبین کے لینس سسٹم میں موروثی خصوصیات کے ساتھ، جمع شدہ تصاویر کی دھندلاپن پیدا کرتا ہے جو پوائنٹ اسپریڈ فنکشن کے طور پر نظر آتی ہے۔ امیجنگ کے حالات کے مشترکہ اثرات کو کانٹراسٹ ٹرانسفر فنکشن (سی ٹی ایف) کے نام سے جانا جاتا ہے، اور ریاضیاتی طور پر باہمی جگہ میں ایک فنکشن کے طور پر اندازہ لگایا جا سکتا ہے۔ خصوصی امیج پروسیسنگ تکنیک جیسے فیز فلپنگ اور ایمپلیٹیوڈ کریکشن/وینر فلٹرنگ سی ٹی ایف کے لیے (کم از کم جزوی طور پر) درست کر سکتی ہیں، اور ہائی ریزولوشن کی تعمیر نو کی اجازت دیتی ہیں۔ تین جہتی تعمیر نو ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی امیجز اس شے کے تخمینے ہیں جو طبی ایکس رے کی طرح شے کے ذریعے کثافت کی تقسیم کو ظاہر کرتے ہیں۔ پروجیکشن سلائس تھیوریم کا استعمال کرتے ہوئے دیکھنے کے زاویوں کی ایک رینج سے لی گئی شے کی بہت سی تصاویر (2 ڈی پروجیکشنز) کو ملا کر شے کی تین جہتی تعمیر نو کی جا سکتی ہے۔ وٹریس آئس میں پروٹین مثالی طور پر سمتوں (یا دیکھنے کے زاویوں) کی بے ترتیب تقسیم کو اپناتے ہیں، جس سے اگر بڑی تعداد میں ذرہ تصاویر استعمال کی جائیں تو کافی حد تک آئسوٹروپک تعمیر نو کی اجازت ملتی ہے۔ یہ الیکٹران ٹومگرافی سے متصادم ہے، جہاں دیکھنے کے زاویے نمونے/امیجنگ سیٹ اپ کی جیومیٹری کی وجہ سے محدود ہوتے ہیں، جس سے انیسوٹروپک تعمیر نو ہوتی ہے۔ فلٹرڈ بیک پروجیکشن واحد ذرہ تجزیہ میں 3D تعمیر نو پیدا کرنے کا عام طور پر استعمال ہونے والا طریقہ ہے، حالانکہ بہت سے متبادل الگورتھم موجود ہیں۔ تعمیر نو سے پہلے، ہر تصویر میں موجود شے کی سمت کا اندازہ لگانے کی ضرورت ہے۔ ہر تصویر کے متعلقہ اویلر زاویوں کو معلوم کرنے کے لیے کئی طریقے تیار کیے گئے ہیں۔ کچھ عام لائنوں (عام 1 ڈی پروجیکشنز اور سینوگرامز) پر مبنی ہیں، دوسرے تکراری پروجیکشن مماثل الگورتھم استعمال کرتے ہیں۔ مؤخر الذکر ایک سادہ، کم ریزولوشن والے 3D اسٹارٹنگ ماڈل سے شروع کر کے کام کرتا ہے اور تجرباتی تصاویر کا موازنہ ماڈل کے پروجیکشن سے کرتا ہے اور حل کی طرف بوٹسٹریپ کرنے کے لیے ایک نیا 3D بناتا ہے۔ موروثی ہیلیکل سمیٹری کا فائدہ اٹھاتے ہوئے ہیلیکل نمونوں (جیسے تمباکو موزیک وائرس) کی تھری ڈی تعمیر نو کے طریقے بھی دستیاب ہیں۔ ان نمونوں کے لیے حقیقی خلائی طریقے (ہیلکس کے حصوں کو واحد ذرات کے طور پر سمجھنا) اور باہمی خلائی طریقے (ڈفریکشن پیٹرن کا استعمال کرتے ہوئے) دونوں استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ جھکاؤ کے طریقے خوردبین کے نمونے کے مرحلے کو جھکایا جا سکتا ہے (عام طور پر ایک محور کے ساتھ)، جس سے واحد ذرہ تکنیک کو بے ترتیب مخروطی جھکاؤ کہا جاتا ہے۔ نمونے کا ایک رقبہ صفر اور اعلی زاویہ (~ 60-70 ڈگری) جھکاؤ دونوں پر، یا آرتھوگنل جھکاؤ کی تعمیر نو کے متعلقہ طریقہ کار کی صورت میں، + 45 اور-45 ڈگری پر دکھایا جاتا ہے۔ دو مختلف جھکاؤ (جھکاؤ والے جوڑے) پر ایک ہی شے سے مطابقت رکھنے والے ذرات کے جوڑوں کا انتخاب کیا جاتا ہے، اور بعد میں صف بندی اور درجہ بندی کے مراحل میں استعمال ہونے والے پیرامیٹرز پر عمل کرکے تین جہتی تعمیر نو نسبتا آسانی سے پیدا کی جا سکتی ہے۔ اس کی وجہ یہ ہے کہ ہر ذرہ کا دیکھنے کا زاویہ (تین اویلر زاویوں کے طور پر بیان کیا گیا ہے) جھکاؤ جیومیٹری سے معلوم ہوتا ہے۔ بے ترتیب مخروطی جھکاؤ سے 3D تعمیر نو محرکات کی محدود رینج کے نتیجے میں گمشدہ معلومات کا شکار ہوتی ہے۔ گمشدہ شنک کے طور پر جانا جاتا ہے (باہمی جگہ میں شکل کی وجہ سے)، یہ 3D نقشوں میں مسخ کا سبب بنتا ہے۔ تاہم، گمشدہ شنک کے مسئلے پر اکثر کئی جھکاؤ کی تعمیر نو کو ملا کر قابو پایا جا سکتا ہے۔ جھکاؤ کے طریقے منفی داغ والے نمونوں کے لیے بہترین موزوں ہیں، اور ان ذرات کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں جو ترجیحی سمتوں میں کاربن سپورٹ فلم کو جذب کرتے ہیں۔ چارجنگ یا بیم سے چلنے والی حرکت کے نام سے جانا جانے والا رجحان شیشے کی برف میں نمونوں کی اونچی جھکی ہوئی تصاویر کو جمع کرنا مشکل بنا دیتا ہے۔ نقشہ تصور اور فٹنگ مختلف سافٹ ویئر پروگرام دستیاب ہیں جو تھری ڈی نقشے دیکھنے کی اجازت دیتے ہیں۔ یہ اکثر صارف کو الیکٹران کی کثافت میں ذیلی اکائیوں کے پروٹین کوآرڈینیٹس (ایکس رے کرسٹلگرافی یا این ایم آر کے ڈھانچے) میں دستی طور پر ڈاک کرنے کے قابل بناتے ہیں۔ کئی پروگرام ذیلی اکائیوں کو کمپیوٹیشنل طور پر بھی فٹ کر سکتے ہیں۔ سنگل پارٹیکل آئی سی پی-ایم ایس سنگل پارٹیکل انڈیوسڈ پیپلڈ پلازما ماس سپیکٹروسکوپی (ایس پی-آئی سی پی-ایم ایس) کا استعمال کئی ایسے علاقوں میں کیا جاتا ہے جہاں ماحولیاتی سیالوں کے نمونوں میں معطل ذرات کا پتہ لگانے اور ان کی مقدار کا تعین کرنے، ان کی نقل مکانی کا اندازہ لگانے، ذرات کے سائز اور ان کی تقسیم کا اندازہ لگانے اور کسی مخصوص ماحول میں ان کے استحکام کا تعین کرنے کا امکان ہوتا ہے۔ ایس پی-آئی سی پی-ایم ایس کو 2000 میں کلاڈ ڈیگویلڈر نے ذرہ معطلی کے لیے ڈیزائن کیا تھا۔ انہوں نے سب سے پہلے اس نئے طریقہ کار کا تجربہ جنیوا یونیورسٹی کے فورل انسٹی ٹیوٹ میں کیا اور 2002 کے موسم بہار میں ای ایم آر ایس کے اجلاس کے دوران 'کولائڈ 2 او او 2' سمپوزیم میں اور 2003 میں کارروائی میں یہ نیا تجزیاتی نقطہ نظر پیش کیا۔ یہ مطالعہ ایس پی آئی سی پی-ایم ایس کا نظریہ اور مٹی کے ذرات (مونٹموریلونائٹ) کے ساتھ ساتھ کولائڈز کے دیگر معطلی پر کیے گئے ٹیسٹ کے نتائج پیش کرتا ہے۔ اس طریقہ کار کا تجربہ تھوریم ڈائی آکسائیڈ نینو پارٹیکلز پر ڈیگوئلڈر اینڈ فیورجر (2004)، زرکونیم ڈائی آکسائیڈ پر ڈیگوئلڈر ایٹ ال (2004) اور گولڈ نینو پارٹیکلز کے ذریعے کیا گیا، جو نینو فارمیسی میں سبسٹریٹ کے طور پر استعمال ہوتے ہیں، اور ڈیگوئلڈر ایٹ ال (2006) کے ذریعے شائع کیا گیا۔ اس کے بعد، یورینیم ڈائی آکسائیڈ نینو اور مائیکرو ذرات کے مطالعہ نے ایک تفصیلی اشاعت، ریف کو جنم دیا۔ ڈیگویلڈری اور دیگر (2006)۔ 2010 سے ایس پی آئی سی پی-ایم ایس کے لیے دلچسپی پھٹ گئی ہے۔ مثال کے طور پر پروٹین کی ترکیب، لگینڈ بائنڈنگ اور آر این اے کے تعامل سے متعلق اہم معلومات اس نئی تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے 7.5 سے 25 Å کے درمیانے ریزولوشن پر حاصل کی جا سکتی ہیں۔ میتھانوکوکس میریپالوڈس چیپرونن، 0.43 نینومیٹر ریزولوشن پر دوبارہ تعمیر کیا گیا۔ یہ بیکٹیریل پروٹین کمپلیکس دوسرے پروٹین کو جوڑنے کے لیے ایک مشین ہے، جو خول کے اندر پھنس جاتے ہیں۔ 0. 09 نینو میٹر ریزولوشن پر خمیر سے فیٹی ایسڈ سنتھس۔ یہ بہت بڑا انزائم کمپلیکس سیلولر لائف کے لیے ضروری لمبی زنجیر والے فیٹی ایسڈ کی تعمیر کے لیے ذمہ دار ہے۔ ایکویریو وائرس کی 0.3 نینو میٹر تعمیر نو۔ یہ وائرس مچھلیوں اور دیگر آبی جانوروں کو متاثر کرتے ہیں۔ تعمیر نو میں اتنا زیادہ ریزولوشن ہے کہ امینو ایسڈ سائیڈ چین کی کثافت آسانی سے نظر آتی ہے۔ پرائمری ڈیٹا بیس ای ایم ڈیٹا بینک (ای ایم ڈیٹا بینک) حوالہ جات بیرونی روابط خوردبین پروٹین ڈھانچہ امیج پروسیسنگ