Digital transcriptome subtraction
ڈیجیٹل ٹرانسکرپٹوم سبٹریکشن (ڈی ٹی ایس) میزبان ترتیبات کے کمپیوٹیشنل ہٹانے کے ذریعے نئے پیتھوجین ٹرانسکرپٹس کی موجودگی کا پتہ لگانے کے لیے بائیو انفارمیٹکس کا ایک طریقہ ہے۔ ڈی ٹی ایس ویٹ لیب اپروچ ریپریزنٹیشنل ڈفریینس اینالیسس (آر ڈی اے) کا براہ راست ان سلیکو اینالاگ ہے، اور غیر جانبدار ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ اور میزبان کے اعلی معیار، اینوٹیٹڈ ریفرنس جینوم کی دستیابی سے ممکن ہوا ہے۔ یہ طریقہ خاص طور پر متعدی بیماریوں کے ایٹولوجیکل ایجنٹ کا معائنہ کرتا ہے اور میرکل سیل پولیما وائرس کو دریافت کرنے کے لیے جانا جاتا ہے، جو میرکل سیل کارسنوما کا مشتبہ سبب بنتا ہے۔ نوول پیتھوجینز کو دریافت کرنے کے لیے کمپیوٹیشنل سبٹریکشن کا استعمال کرنے کی تجویز سب سے پہلے 2002 میں میئرسن اور دیگر نے پیش کی تھی۔ ہیومن ایکسپریسڈ سیکوینس ٹیگ (ای ایس ٹی) ڈیٹا سیٹس کا استعمال کرتے ہوئے۔ اصول تجربے کے ثبوت میں، میئرسن اور دیگر۔ یہ ظاہر کیا کہ یہ پوسٹ ٹرانسپلانٹ لیمفوپرولیفیریٹو ڈس آرڈر (پی ٹی ایل ڈی) میں ایپسٹین-بار وائرس سے متاثرہ لیمفوسائٹس کا استعمال کرتے ہوئے ایک قابل عمل نقطہ نظر تھا۔ 2007 میں، "ڈیجیٹل ٹرانسکرپٹوم سبٹریکشن" کی اصطلاح چانگ مور گروپ نے تیار کی تھی، اور اسے میرکل سیل کارسنوما میں میرکل سیل پولیما وائرس کو دریافت کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ایم سی وی کی دریافت کے ساتھ ساتھ، اس نقطہ نظر کو ایک ایسے معاملے میں موت کی وجہ کے طور پر ایک نئے ارینا وائرس کو شامل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا جہاں ایک ہی عطیہ دہندہ سے اعضاء کی پیوند کاری کے فورا بعد تین مریض اسی طرح کی بیماریوں سے مر گئے۔ طریقہ کار سی ڈی این اے لائبریری کی تعمیر انسانی جینومک ڈی این اے کو ختم کرنے کے لیے ڈی این ایز I کے ساتھ علاج کے بعد، بنیادی متاثرہ ٹشو سے کل آر این اے نکالا جاتا ہے۔ اس کے بعد میسنجر آر این اے کو اولیگو-ڈی ٹی کالم کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا جاتا ہے جو پولی-اے دم سے جڑا ہوتا ہے، یہ سگنل خاص طور پر نقل شدہ جینوں پر پایا جاتا ہے۔ بے ترتیب ہیکسامرس پرائمنگ کا استعمال کرتے ہوئے، ریورس ٹرانسکرپٹیس (آر ٹی) تمام ایم آر این اے کو سی ڈی این اے میں تبدیل کرتا ہے اور بیکٹیریل ویکٹرز میں کلون کرتا ہے۔ بیکٹیریا، عام طور پر ای کولی، پھر سی ڈی این اے ویکٹرز کا استعمال کرتے ہوئے تبدیل کیے جاتے ہیں اور ایک مارکر کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کیے جاتے ہیں، تبدیل شدہ کلونوں کا مجموعہ سی ڈی این اے لائبریری ہے۔ یہ ٹشو ایم آر این اے کا ایک سنیپ شاٹ پیدا کرتا ہے جو مستحکم ہے اور بعد کے مرحلے میں ترتیب دیا جا سکتا ہے۔ ترتیب اور کوالٹی کنٹرول سی ڈی این اے لائبریری کو بہت گہرائی میں ترتیب دیا جانا چاہیے (یعنی۔ کلون کی ترتیب کی تعداد) ایک نظریاتی نایاب پیتھوجین ترتیب (ٹیبل 1) کا پتہ لگانے کے لیے، خاص طور پر اگر غیر ملکی ترتیب نئی ہو۔ چانگ مور متعدد ترتیب کے پلیٹ فارم کا استعمال کرتے ہوئے 200,000 نقل یا اس سے زیادہ کی ترتیب کی گہرائی کی سفارش کرتے ہیں۔ اس کے بعد غلط مثبت نتائج کو کم سے کم کرنے کے لیے خام ترتیبات پر سخت کوالٹی کنٹرول لگایا جاتا ہے۔ ابتدائی معیار کی اسکرین مبہم ترتیبات کو خارج کرنے کے لیے کئی عمومی پیرامیٹرز کا استعمال کرتی ہے، جس سے ہائی فیڈیلیٹی (ہائی فائی) ریڈز کا ڈیٹا سیٹ پیچھے رہ جاتا ہے۔ کم فریڈ اسکور کٹ آف کا استعمال کم معیار کے اختتامی ترتیب کو ہٹانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ عام طور پر، ہر بیس کالنگ میں 99%-99.9% درستگی کو یقینی بنانے کے لیے 20 یا 30 کا فریڈ اسکور کٹ آف استعمال کیا جاتا ہے۔ ویکٹر اور اڈاپٹر ہٹانا۔ کم پیچیدگی-ترتیب کا پیچیدگی اسکور ایک سیریز (ہومو پولیمر) جیسے پولی-ڈی ٹی یا پولی-ڈی اے میں یکساں اڈوں کی تعداد کی عکاسی کرتا ہے۔ انسانی تکراری ڈی این اے۔ لمبائی-پیرامیٹر کا انحصار ترتیب کی ٹیکنالوجی کے لیے مخصوص بہتر پڑھنے کی لمبائی پر ہوتا ہے جو استعمال کی گئی تھی۔ E. کولی جینوم کی ترتیب کو پھینکیں اور خارج کریں۔ جینوم کی میزبانی کے لیے بلاسٹ میگا بلاسٹ کا استعمال کرتے ہوئے، ہائی فائی ریڈز کو پھر اینوٹیٹڈ ڈیٹا بیس میں ترتیب کے ساتھ ملایا جاتا ہے اور کسی بھی مثبت میچ کو پھر ڈیٹا سیٹ سے گھٹا دیا جاتا ہے۔ انسانی ترتیب کے مثبت مماثلت کے لیے کم از کم ہٹ لمبائی عام طور پر 30 مسلسل ایک جیسی بیسز ہوتی ہے، جو 60 کے BLAST اسکور کے برابر ہوتی ہے۔ عام طور پر، باقی ترتیب کو کم سخت پیرامیٹرز کے ساتھ دوبارہ BLAST کیا جاتا ہے تاکہ معمولی عدم مطابقت (20 میں سے 1 نیوکلیوٹائڈ) کی اجازت دی جا سکے۔ اس مرحلے پر ترتیبات کی اکثریت (> 99 ٪) کو ڈیٹا سیٹ سے ہٹا دیا جانا چاہیے۔ گھٹاؤ ترتیبات میں عام طور پر شامل ہیں: حوالہ انسانی نقل-اظہار لائبریری سیٹوں سے کسی بھی معروف انسانی نقل کو ختم کرتا ہے۔ انسانی جینوم کا حوالہ-سی ڈی این اے لائبریری کی تعمیر کے دوران ان جینوں کو ختم کرتا ہے جو تشریح کے عمل اور کسی بھی آلودہ جینومک ترتیب سے چھوٹ گئے ہیں۔ مائٹوکونڈریل ڈی این اے-مائٹوکونڈریل ڈی این اے تیزی سے تغیر کی شرح کی وجہ سے انتہائی وافر اور پولیمرفک ہوتے ہیں۔ امیونوگلوبلین کا علاقہ-امیونوگلوبلین لوکی انتہائی پولیمرفک ہے اور بصورت دیگر حوالہ جینوم کے ساتھ ناقص صف بندی کی وجہ سے غلط مثبت ثابت ہوتا ہے۔ دیگر ریڑھ کی ہڈی والے سلسلے "غیر میزبان" امیدواروں کا غیر متناسب ترتیبات کا تجزیہ پیتھوجین ڈیٹا بیس سے صف بندی گھٹاؤ کے سخت دوروں کے بعد، بقیہ ترتیبات کو غیر کٹوتی والے کونٹیگس میں کلسٹر کیا جاتا ہے اور کم سختی کے پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے معروف پیتھوجین ترتیبات سے منسلک کیا جاتا ہے۔ جیسے جیسے پیتھوجین جینوم تیزی سے تبدیل ہوتے ہیں، نیوکلیوٹائڈ-نیوکلیوٹائڈ صف بندی، یا بلاسٹن، عام طور پر غیر معلوماتی ہوتا ہے کیونکہ کوڈون انحطاط کی وجہ سے امینو ایسڈ کے باقیات کو تبدیل کیے بغیر بعض اڈوں پر تغیرات ممکن ہیں۔ تمام 6 اوپن ریڈنگ فریموں کے ان سلیکو ترجمہ شدہ پروٹین کے سلسلے کو امینو ایسڈ کے سلسلے سے اینوٹیٹڈ پروٹین، یا بلاسٹکس سے ملانا ترجیحی صف بندی کا طریقہ ہے کیونکہ اس سے متعلقہ تناؤ/پرجاتیوں سے مل کر ایک نئے پیتھوجین کی شناخت کا امکان بڑھ جاتا ہے۔ مثبت مماثلت کے امکانات کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے اس مرحلے پر امیدوار کے سلسلے کی تجرباتی توسیع کا بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ڈی نووو اسمبلی ایسے معاملات میں جہاں معلوم پیتھوجینز کے ساتھ صف بندی غیر معلوماتی یا مبہم ہے، امیدوار ترتیب کے کونٹیگس کو مکمل پیتھوجین جینوم ترتیب پیدا کرنے کے لیے بنیادی متاثرہ ٹشو میں پرائمر چلنے کے لیے ٹیمپلیٹس کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ چونکہ وائرل ٹرانسکرپٹس انتہائی نایاب تناسب ٹشو ایم آر این اے (1 ملین میں 10 ٹرانسکرپٹس) ہیں، اس لیے کم کوریج کی وجہ سے صرف اصل امیدوار کے سلسلے کی بنیاد پر ٹرانسکرپٹوم تیار کرنے کا امکان نہیں ہے۔ پیتھوجین کی توثیق ایک بار ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ ڈیٹا میں ایک پوٹیٹو پیتھوجین کی شناخت ہو جانے کے بعد، زیادہ حساس تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے متاثرہ مریضوں میں پیتھوجین کی موجودگی کی توثیق کرنا ضروری ہے، جیسے: آر ٹی-پی سی آر اور مشتق طریقے، بشمول 3 '-اور 5'-آر اے سی ای پیتھوجین ایم آر این اے کے وجود کی تصدیق کے لیے۔ ٹشوز میں پیتھوجین کے وجود کا تعین کرنے کے لیے متعلقہ پیتھوجین کے لیے اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے امیونوہسٹو کیمسٹری۔ پیتھوجین مخصوص اینٹی باڈی ٹائٹر کی پیمائش کے لیے سیرولوجیکل ٹیسٹ۔ بیکٹیریل کلچر/وائرل کلچر، جسے لیبارٹری تشخیص میں گولڈ اسٹینڈرڈ سمجھا جاتا ہے۔ ڈی ٹی ایس کے لیے بنیادی اطلاق کینسر میں پیتھوجینک وائرس کی شناخت میں ہے۔ اس کا استعمال غیر کینسر سے متعلق بیماری میں وائرل پیتھوجینز کی شناخت کے لیے بھی کیا جا سکتا ہے۔ مستقبل کی طبی ایپلی کیشنز میں افراد میں معمول کی بنیاد پر ڈی ٹی ایس کا استعمال شامل ہو سکتا ہے۔ ڈی ٹی ایس زراعت پر بھی لاگو ہو سکتا ہے، ان پیتھوجینز کی نشاندہی کرتا ہے جو پیداوار پر اثر ڈالتے ہیں۔ کمپیوٹیشن گھٹاؤ پہلے سے ہی ایک میٹاجنومکس مطالعہ میں استعمال کیا گیا تھا جس نے آئی اے پی وی کے ذریعے وائرل انفیکشن کو شہد کی مکھیوں میں کالونی کے گرنے کی خرابی سے منسلک کیا تھا۔ فوائد پیتھوجین کی ترتیب کے بارے میں کسی پیشگی علم کی ضرورت نہیں ہے۔ پہلے سے غیر وابستہ، ممکنہ طور پر قابل علاج پیتھوجینز کی شناخت کر سکتے ہیں۔ پہلے سے دستیاب سالماتی طریقوں اور وسائل کا استعمال کرتا ہے۔ نقصانات پیتھوجین کی موجودگی کی شناخت کرتے ہیں لیکن بیماری سے وجہ کا تعلق قائم نہیں کرتے ہیں۔ کوچ کا مفروضہ اور بریڈفورڈ ہل کے معیارات دیکھیں۔ مطالعہ کیے جانے والے جاندار کے لیے ایک انتہائی قابل اعتماد، مکمل حوالہ ٹرانسکرپٹوم ہونا چاہیے۔ غیر ملکی ترتیب کی شناخت کی کمی کسی روگجنک غیر ملکی جسم کو مکمل طور پر خارج نہیں کر سکتی۔ حوالہ جات بائیو انفارمیٹکس