MCherry
ایم چیری مونومیرک ریڈ فلوروسینٹ پروٹین (ایم آر ایف پی) کے ایم فروٹ خاندان کا ایک رکن ہے۔ آر ایف پی کے طور پر، ایم چیری کو سبز فلوروسینٹ پروٹین (جی ایف پیز) کے برعکس ڈسکوسوما سمندری انیمون کے ڈی ایس ریڈ سے اخذ کیا گیا تھا جو اکثر ایکوریا وکٹوریا جیلی فش سے اخذ کیے جاتے ہیں۔ فلوروسینٹ پروٹین کو خلیے میں اجزاء کو ٹیگ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، لہذا ان کا مطالعہ فلوروسینس سپیکٹروسکوپی اور فلوروسینس مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے کیا جا سکتا ہے۔ mCherry 540-590 nm کے درمیان روشنی جذب کرتا ہے اور 550-650 nm کی حد میں روشنی خارج کرتا ہے۔ ایم چیری کا تعلق فلوروسینٹ پروٹین کروموفورز کے گروپ سے ہے جو جینوں کو دیکھنے اور تجربات میں ان کے افعال کا تجزیہ کرنے کے آلات کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ بہت سے متنوع حیاتیات کے جینیاتی مواد میں ان فلوروسینٹ پروٹین ٹیگز کے عین مطابق اندراج کے ذریعے جینوم ایڈیٹنگ میں بہت بہتری آئی ہے۔ مختلف فلوروسینٹ پروٹین کی چمک اور فوٹوسٹیبلٹی کے درمیان زیادہ تر موازنہ وٹرو میں کیے گئے ہیں، جو حیاتیاتی متغیرات سے ہٹائے گئے ہیں جو خلیوں یا حیاتیات میں پروٹین کی کارکردگی کو متاثر کرتے ہیں۔ وٹرو میں سیلولر ماحول کو مکمل طور پر نقل کرنا مشکل ہے، اور ماحول میں فرق چمک اور فوٹوسٹیبلٹی پر اثر ڈال سکتا ہے۔ ایم آر ایف پیز-جیسے ایم چیری-مفید ہیں کیونکہ ان کا سالماتی وزن کم ہوتا ہے اور وہ ٹیٹریمرز سے زیادہ تیزی سے فولڈ ہوں گے، جس کے نتیجے میں ہدف کے نظام میں خلل کم ہوتا ہے۔ ڈویلپمنٹ ڈی ایس ریڈ ڈسکوسوما سمندری انیمون سے الگ کیا جاتا ہے، اور یہ ایک ٹیٹرامیرک پروٹین ہے۔ زیادہ تر سرخ فلوروسینٹ پروٹین ڈی ایس ریڈ سے آتے ہیں۔ ڈی ایس ریڈ میں کم فوٹوسٹیبلٹی (تابکار توانائی یا روشنی کے زیر اثر تبدیلی کے خلاف مزاحمت) اور سست پختگی کی شرح (آدھا پروٹین جوڑنے تک کا وقت) ہوتی ہے۔ ایم آر ایف پی 1 ڈی ایس ریڈ سے ماخوذ ہے اور یہ ایک مونومر ہے اس لیے یہ چھوٹا ہے، لیکن اس کی کوانٹم پیداوار اور فوٹوسٹیبلٹی ڈی ایس ریڈ سے کم ہے۔ ایم چیری اور دیگر ایم فروٹس میں ڈی ایس ریڈ اور ایم آر ایف پی 1 دونوں کے مقابلے میں چمک اور فوٹوسٹیبلٹی میں بہتری آئی ہے۔ ایم چیری کو رابرٹ ای کیمبل نے ایم آر ایف پی 1 سے ہدایت شدہ ارتقاء کے ذریعے تیار کیا تھا۔ عام طور پر ایم فروٹ تیار کیے گئے تھے کیونکہ جب کہ مختلف رنگین پروٹین دوسرے اینتھوزوان سے پائے جا سکتے ہیں، پروٹین زیادہ تر ٹیٹریمرز ہوں گے جن میں زیادہ تر امکان ڈی ایس ریڈ جیسے ہی مسائل ہوں گے۔ ان ٹیٹریمرز کو مفید فیوژن پارٹنر بنانے کے لیے ڈی ایس ریڈ سے کیے گئے مشتقات کی ضرورت ہوگی۔ نتیجے کے طور پر، ایم فروٹ کو ایم آر ایف پی 1 سے کلیدی امینو ایسڈ کو ایڈجسٹ کرکے حاصل کیا گیا تاکہ جوش و خروش اور اخراج کی طول موج کو ایڈجسٹ کیا جا سکے۔ مختلف رنگ مختلف خلیوں کی اقسام، نقل کی سرگرمی، اور پروٹین میں فیوژن کا سراغ لگانے کی اجازت دیتے ہیں۔ ایم چیری، تیار کردہ تمام حقیقی مونومرز میں سے، سب سے طویل طول موج، سب سے زیادہ فوٹوسٹیبلٹی، تیز ترین پختگی، بہترین پی ایچ مزاحمت رکھتا ہے، اور اپنے جوش و خروش اور اخراج میں ایم آر ایف پی 1 کے قریب ہے۔ تاہم، ایم چیری کی کوانٹم پیداوار ایم آر ایف پی 1 سے کم ہے۔ ساخت ایم چیری کے لیے جین 711 بی پی لمبا ہوتا ہے، اور پروٹین 236 باقیات سے بنا ہوتا ہے جس کی کمیت 26.722 کے ڈی اے ہوتی ہے۔ ایم چیری کے کرسٹل ڈھانچے کا تعین 2006 میں کیا گیا تھا۔ اس میں 3 الفا ہیلیکس اور 13 بیٹا شیٹس ہوتے ہیں جو بیٹا بیرل بناتے ہیں۔ ایم چیری میں کروموفور تین امینو ایسڈ، میتھیونائن، ٹائروسین اور گلائسین سے بنا ہوتا ہے، جو ترجمہ کے بعد امیڈازولینون میں تبدیل ہوتے ہیں۔ ترتیب میں ان باقیات کی تعداد بالترتیب 71، 72 اور 73 ہے۔ توسیعی پائی الیکٹران کنجگیشن ایم چیری کو اس کی سرخ شفٹ جذب اور اخراج فراہم کرتا ہے۔ کروموفور ایک مرکزی ہیلکس سے بنتا ہے جو 11 پھنسے ہوئے بیٹا بیرل میں سالوینٹ سے محفوظ ہوتا ہے۔ یہ ڈھانچہ تقریبا ڈی ایس ریڈ کے ترتیری ڈھانچے سے ملتا جلتا ہے جس میں 11 اسٹرینڈڈ بیٹا بیرل بھی ہے، اور یہ جی ایف پیز ترتیری ڈھانچے سے ملتا جلتا ہے۔ یہ ایم چیری میں کروموفور کے ارد گرد کے ماحول کو ڈی ایس ریڈ کے کروموفور کے ارد گرد کے ماحول سے زیادہ ہائیڈروفوبک بناتا ہے۔ ایم چیری پر اختتامی ٹرمینی جی ایف پی کی طرح ہیں جو اسے ایسے نظاموں میں شامل کرنے کی اجازت دیتا ہے جہاں جی ایف پی استعمال کیا جا سکتا ہے اور ایم آر ایف پی 1 استعمال نہیں کیا جا سکتا تھا۔ mCherry کا استعمال فلوروسینس مائکروسکوپی میں انٹرا سیلولر تحقیقات کے طور پر کیا جاتا ہے۔ تاہم، جب کسی پروٹین کو فلوروسینٹ پروٹین میں فیوژن کے ذریعے ٹیگ کیا جاتا ہے، تو ان کے درمیان تعاملات ناپسندیدہ طور پر ٹارگیٹنگ یا فنکشن میں خلل ڈال سکتے ہیں۔ ایم چیری کی قدر کی جاتی ہے جہاں آئینی جین کا اظہار مطلوب ہوتا ہے، اور دیگر تجرباتی طریقوں کے لیے متعدد جینوں کے مربوط کنٹرول کی ضرورت ہوتی ہے۔ اگرچہ ای کولی اور دیگر ماڈلز میں استعمال کے لیے متعدد مقامات تیار کیے گئے ہیں، اس طرح کی تکنیکوں کی افادیت اور فعالیت ہمیشہ دوسری انواع میں ترجمہ نہیں ہوتی ہے۔ مثال کے طور پر، گرام نیگیٹیو پیتھوجین، لیجیئنلا نیوموفلا کے لیے، جو کہ لیجیئنینیئرز بیماری کا ایک ویکٹر ہے، پی ٹی اے سی نظام واحد اچھی طرح سے قائم اظہار کنٹرول سسٹم کی نمائندگی کرتا ہے۔ ایل نیوموفلا میں بیکٹیریل جین کے اظہار کا مطالعہ کرنے کے لیے دستیاب ٹولز کو بڑھانے کے لیے، ایم چیری تیار کیا گیا تھا، جو میوٹیجنیزڈ لیسی بائنڈنگ سائٹ سے آئینی جین کا اظہار فراہم کرتا ہے۔ mCherry نہ تو دوسرے پلازمیڈز کے ساتھ مداخلت کرتا ہے جو ایک برقرار LacI-Ptac اظہار کے نظام کو پناہ دیتا ہے اور نہ ہی انٹرا سیلولر نشوونما کے دوران لیجیئنلا پرجاتیوں کی نشوونما کو تبدیل کرتا ہے۔ ایم چیری کی وسیع میزبان رینج پلازمیڈ ریڑھ کی ہڈی نے گرام منفی بیکٹیریل پرجاتیوں کی وسیع اقسام میں آئینی جین کے اظہار کی اجازت دی، جس سے ایم چیری بڑی تحقیقی برادری کے لیے ایک مفید ٹول بن گیا۔ اسے ہومو-ایف آر ای ٹی تجربات کے لیے طویل طول موج ہیٹرو-ایف آر ای ٹی (فلوروسینس گونج توانائی کی منتقلی) قبولیت اور تحقیقات کے طور پر بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ایف آر ای ٹی فلوروسینس توانائی کی منتقلی کی ایک قسم ہے جہاں کوئی انٹرمیڈیٹ فوٹون نہیں ہوتا ہے اور توانائی ڈونر سے قبول کنندہ کو منتقل کی جاتی ہے۔ اس کے ساتھ ساتھ بیکٹیریا کو لیبل لگانے کے لیے استعمال کیا جائے تاکہ انہیں اینٹی بائیوٹک دباؤ کے بغیر دیکھا جا سکے۔ دیگر آر ایف پیز اور ایم فروٹ اصل آر ایف پی: ڈی ایس ریڈ فرسٹ جنریشن آر ایف پی: ایم آر ایف پی 1 سیکنڈ جنریشن آر ایف پیز: ایم اسٹرا بیری، ایم اورنج، ڈی ٹومیٹو ایم فروٹ دوسری نسل کے مونومیرک ریڈ فلوروسینٹ پروٹین (ایم آر ایف پی) ہیں جن کی چمک اور فوٹوسٹیبلٹی پہلی نسل کے ایم آر ایف پی 1 کے مقابلے میں بہتر ہے۔ ان کے اخراج اور محرک طول موج بالترتیب تقریبا 550−650 اور 540−590 این ایم کی حد میں تقسیم ہیں۔ تاہم، ان کے سپیکٹرم میں تغیرات کا سراغ چند اہم امینو ایسڈ سے لگایا جا سکتا ہے۔ تین نمائندوں، mOrange، mStrawberry، اور mCherry کے سپیکٹروسکوپک اور ایٹم ریزولوشن کرسٹلگرافک تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ مختلف میکانزم ایکسائٹیشن اور ایمیشن میکسما کو قائم کرنے کے لیے کام کرتے ہیں۔ آکسیڈیشن کا دوسرا مرحلہ شروع کرتے ہوئے، ہر ایم فروٹ پولی پیپٹائڈ ریڑھ کی ہڈی میں ایک ایسیلیمائن ربط پیدا کرتا ہے۔ پروجینیٹر ڈی ایس ریڈ کے مقابلے میں، اس ربط (ایم اورنج) میں براہ راست کوولینٹ ترمیم اور کروموفور ماحول (ایم اسٹرابیری اور ایم چیری) کی بالواسطہ ترمیم مضبوط نیلے اور سرخ شفٹ شدہ اقسام پیدا کرتی ہے۔ مورانج کی نیلی شفٹ اس کی پروٹین ریڑھ کی ہڈی کی کوولینٹ ترمیم سے متاثر ہوتی ہے۔ الیکٹران کثافت کا نقشہ پولی پیپٹائڈ ریڑھ کی ہڈی کے ساتھ Thr 66 Oγ کے رد عمل پر تیسرے ہیٹروسائیکل، 2-ہائیڈروکسی-ڈائی ہائیڈرو آکسازول کی تشکیل کی نشاندہی کرتا ہے، جس کے نتیجے میں باقی کروموفور کے ساتھ پوزیشن 65 پر کاربونل کے امتزاج کو کم کر دیتا ہے۔ mStrawberry اور mCherry میں، چارج شدہ Lys 70 کی حرکت اور Glu 215 کے پروٹونشن کو کروموفور الیکٹران کثافت کی تقسیم میں ترمیم کرنے کے لیے تجویز کیا گیا ہے، جس سے ان کی دستخطی سرخ شفٹ پیدا ہوتی ہے۔ حوالہ جات فلوروسینٹ پروٹین ویڈیو کلپس پر مشتمل مضامین بیرونی لنکس ایف پی بیس پر ایم چیری، ایک فلوروسینٹ پروٹین ڈیٹا بیس