Illumina dye sequencing
الومینا ڈائی سیکوینسنگ ایک ایسی تکنیک ہے جو ڈی این اے میں بیس جوڑوں کی سیریز کا تعین کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے، جسے ڈی این اے سیکوینسنگ بھی کہا جاتا ہے۔ ریورسیبل ٹرمینڈ کیمسٹری کا تصور برونو کینارڈ اور سائمن سرفتی نے پیرس کے پاسچر انسٹی ٹیوٹ میں ایجاد کیا تھا۔ اسے کیمبرج یونیورسٹی کے شنکر بالاسبرامنین اور ڈیوڈ کلینرمین نے تیار کیا تھا، جنہوں نے بعد میں سولیکسا کی بنیاد رکھی، جسے بعد میں الومینا نے حاصل کیا۔ یہ ترتیب کا طریقہ ریورسیبل ڈائی ٹرمینیٹرز پر مبنی ہے جو واحد نیوکلیوٹائڈز کی شناخت کو قابل بناتا ہے کیونکہ وہ ڈی این اے اسٹرینڈز پر دھوئے جاتے ہیں۔ اسے پورے جینوم اور خطے کی ترتیب، ٹرانسکرپٹوم تجزیہ، میٹاجنومکس، چھوٹے آر این اے کی دریافت، میتھیلیشن پروفائلنگ، اور جینوم وسیع پروٹین-نیوکلک ایسڈ تعامل تجزیہ کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ جائزہ یہ تین بنیادی مراحل میں کام کرتا ہے: وسعت، ترتیب اور تجزیہ۔ یہ عمل صاف شدہ ڈی این اے سے شروع ہوتا ہے۔ ڈی این اے ٹکڑے ٹکڑے کیا جاتا ہے اور اڈاپٹر شامل کیے جاتے ہیں جن میں ایسے حصے ہوتے ہیں جو امپلیفیکیشن، سیکوینسنگ اور تجزیہ کے دوران حوالہ پوائنٹس کے طور پر کام کرتے ہیں۔ ترمیم شدہ ڈی این اے کو فلو سیل پر لوڈ کیا جاتا ہے جہاں امپلیفکیشن اور سیکوینسنگ ہوگی۔ فلو سیل میں نینو ویل ہوتے ہیں جو ٹکڑوں کو باہر نکالتے ہیں اور زیادہ بھیڑ میں مدد کرتے ہیں۔ ہر نینو ویل میں اولیگونیوکلیوٹائڈز ہوتے ہیں جو اڈاپٹرز کو منسلک کرنے کے لیے ایک اینکرنگ پوائنٹ فراہم کرتے ہیں۔ ایک بار جب ٹکڑے جڑ جاتے ہیں، تو ایک مرحلہ شروع ہوتا ہے جسے کلسٹر جنریشن کہا جاتا ہے۔ یہ مرحلہ ڈی این اے کے ہر ٹکڑے کی تقریبا ایک ہزار کاپیاں بناتا ہے اور پل امپلیفکیشن پی سی آر کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد، پرائمرز اور ترمیم شدہ نیوکلیوٹائڈز کو چپ پر دھویا جاتا ہے۔ ان نیوکلیوٹائڈز میں ایک ریورسیبل فلوروسینٹ بلاکر ہوتا ہے لہذا ڈی این اے پولیمرس ڈی این اے کے ٹکڑے پر ایک وقت میں صرف ایک نیوکلیوٹائڈ شامل کر سکتا ہے۔ ترکیب کے ہر دور کے بعد، ایک کیمرہ چپ کی تصویر لیتا ہے۔ کمپیوٹر اس بات کا تعین کرتا ہے کہ فلوروسینٹ ٹیگ کی طول موج سے کون سی بنیاد شامل کی گئی تھی اور اسے چپ پر ہر جگہ کے لیے ریکارڈ کرتا ہے۔ ہر چکر کے بعد، غیر مربوط مالیکیول بہہ جاتے ہیں۔ اس کے بعد 3 'فلوروسینٹ ٹرمینل بلاکنگ گروپ کو ہٹانے کے لیے کیمیائی ڈی بلاکنگ مرحلہ استعمال کیا جاتا ہے۔ یہ عمل اس وقت تک جاری رہتا ہے جب تک کہ مکمل ڈی این اے مالیکیول کی ترتیب نہ ہو جائے۔ اس ٹیکنالوجی کے ساتھ، پورے جینوم میں ہزاروں مقامات کو بڑے پیمانے پر متوازی ترتیب کے ذریعے ایک ساتھ ترتیب دیا جاتا ہے۔ ڈی این اے کو پاک کرنے کے بعد ڈی این اے لائبریری، جینومک لائبریری، تیار کرنے کی ضرورت ہے۔ جینومک لائبریری بنانے کے دو طریقے ہیں، سونکیشن اور ٹیگ مینٹیشن۔ ٹیگ مینٹیشن کے ساتھ، ٹرانسپوسز بے ترتیب طور پر ڈی این اے کو 50 اور 500 بی پی کے ٹکڑوں کے درمیان سائز میں کاٹتے ہیں اور بیک وقت اڈاپٹرز کا اضافہ کرتے ہیں۔ جینومک ڈی این اے کو ٹکڑے ٹکڑے کرنے کے لیے سونکیشن کا استعمال کرکے بھی جینیاتی لائبریری تیار کی جا سکتی ہے۔ الٹراسونک صوتی لہروں کا استعمال کرتے ہوئے سونکیشن ڈی این اے کو اسی طرح کے سائز میں ٹکڑے ٹکڑے کرتا ہے۔ سونکیشن کے بعد دائیں اور بائیں اڈاپٹرز کو ٹی 7 ڈی این اے پولیمیرس اور ٹی 4 ڈی این اے لیگیز کے ذریعے منسلک کرنے کی ضرورت ہوگی۔ وہ تار جو اڈاپٹر کو منسلک کرنے میں ناکام رہتے ہیں وہ بہہ جاتے ہیں۔ اڈاپٹر ایڈاپٹر تین مختلف حصوں پر مشتمل ہوتے ہیں: ٹھوس سپورٹ (فلو سیل پر اولیگونیوکلیوٹائڈز)، بارکوڈ سیکوینس (انڈیکس)، اور سیکوینسنگ پرائمر کے لیے بائنڈنگ سائٹ کی تکمیلی ترتیب۔ اشارے عام طور پر چھ بیس جوڑے لمبے ہوتے ہیں اور نمونوں کی شناخت کے لیے ڈی این اے ترتیب کے تجزیے کے دوران استعمال ہوتے ہیں۔ انڈیکس 96 مختلف نمونوں کو ایک ساتھ چلانے کی اجازت دیتے ہیں، اسے ملٹی پلیکسنگ بھی کہا جاتا ہے۔ تجزیہ کے دوران، کمپیوٹر تمام ریڈز کو ایک ہی انڈیکس کے ساتھ گروپ کرے گا۔ الومینا "ترتیب کی طرف سے ترکیب" کے نقطہ نظر کا استعمال کرتا ہے۔ یہ عمل ایکریلامائیڈ لیپت شیشے کے بہاؤ کے خلیے کے اندر ہوتا ہے۔ بہاؤ کے خلیے میں اولیگونیوکلیوٹائڈز (مختصر نیوکلیوٹائڈ ترتیب) ہوتے ہیں جو خلیے کے نچلے حصے کو کوٹنگ کرتے ہیں، اور وہ ترتیب کے دوران ڈی این اے اسٹرینڈز کو اپنی جگہ پر رکھنے کے لیے ٹھوس معاون کے طور پر کام کرتے ہیں۔ جیسا کہ بکھرے ہوئے ڈی این اے کو بہاؤ سیل کے اوپر دھویا جاتا ہے، مناسب اڈاپٹر تکمیلی ٹھوس سپورٹ سے منسلک ہوتا ہے۔ پل کی توسیع ایک بار منسلک ہونے کے بعد، کلسٹر کی نسل شروع ہو سکتی ہے۔ مقصد یہ ہے کہ ڈی این اے کے سینکڑوں ایک جیسے تار بنائے جائیں۔ کچھ فارورڈ اسٹرینڈ ہوں گے ؛ باقی، الٹا۔ یہی وجہ ہے کہ دائیں اور بائیں اڈاپٹر استعمال کیے جاتے ہیں۔ پل کو وسعت دینے کے ذریعے کلسٹرز تیار کیے جاتے ہیں۔ ڈی این اے پولیمریز ڈی این اے کے ایک اسٹرینڈ کے ساتھ چلتا ہے، جس سے اس کا تکمیلی اسٹرینڈ بنتا ہے۔ اصل اسٹرینڈ کو دھو دیا جاتا ہے، جس سے صرف الٹا اسٹرینڈ رہ جاتا ہے۔ ریورس اسٹرینڈ کے اوپری حصے میں ایک اڈاپٹر سیکوینس ہوتا ہے۔ ڈی این اے اسٹرینڈ جھکتا ہے اور اولیگو سے منسلک ہوتا ہے جو ٹاپ اڈاپٹر سیکوینس کی تکمیل کرتا ہے۔ پولیمیرس ریورس اسٹرینڈ سے منسلک ہوتے ہیں، اور اس کا تکمیلی اسٹرینڈ (جو اصل سے ملتا جلتا ہے) بنایا جاتا ہے۔ اب ڈبل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کو غیر فطری بنایا جاتا ہے تاکہ ہر اسٹرینڈ علیحدہ طور پر فلو سیل میں لنگر انداز اولیگونیوکلیوٹائڈ ترتیب سے منسلک ہو سکے۔ ایک ریورس اسٹرینڈ ہوگا ؛ دوسرا، فارورڈ۔ اس عمل کو برج ایمپلیفکیشن کہا جاتا ہے، اور یہ ایک ہی وقت میں بہاؤ سیل میں ہزاروں کلسٹروں کے لیے ہوتا ہے۔ کلونل امپلیفکیشن بار بار، ڈی این اے اسٹرینڈز جھکیں گے اور ٹھوس سپورٹ سے منسلک ہوں گے۔ ڈی این اے پولیمریز ایک ڈبل اسٹرینڈڈ سیگمنٹ بنانے کے لیے ایک نئے اسٹرینڈ کی ترکیب کرے گا، اور اسے غیر فطری بنایا جائے گا تاکہ ایک علاقے میں موجود تمام ڈی این اے اسٹرینڈز ایک ہی ماخذ (کلونل امپلیفکیشن) سے ہوں۔ کوالٹی کنٹرول کے مقاصد کے لیے کلونل امپلیفکیشن اہم ہے۔ اگر کسی اسٹرینڈ میں عجیب ترتیب پائی جاتی ہے، تو سائنس دان ریورس اسٹرینڈ کی جانچ کر سکتے ہیں تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ اس میں ایک ہی عجیب پن کی تکمیل ہے۔ آگے اور پیچھے کے تار نوادرات کے خلاف حفاظت کے لیے چیک کے طور پر کام کرتے ہیں۔ چونکہ الومینا سیکوینسنگ ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کرتی ہے، اس لیے بنیادی متبادل کی غلطیاں مشاہدہ کی گئی ہیں، خاص طور پر 3 'سرے پر۔ کلسٹر جنریشن کے ساتھ مل کر جوڑے والے اینڈ ریڈز اس بات کی تصدیق کر سکتے ہیں کہ غلطی ہوئی ہے۔ ریورس اور فارورڈ اسٹرینڈز ایک دوسرے کے تکمیلی ہونے چاہئیں، تمام ریورس ریڈز ایک دوسرے سے ملنے چاہئیں، اور تمام فارورڈ ریڈز ایک دوسرے سے ملنے چاہئیں۔ اگر کوئی ریڈ اپنے ہم منصبوں سے کافی مماثل نہیں ہے (جس کے ساتھ اسے کلون ہونا چاہیے)، تو ایک غلطی واقع ہو سکتی ہے۔ کچھ لیبز کے تجزیے میں 97 فیصد مماثلت کی کم از کم حد کا استعمال کیا گیا ہے۔ ترتیب بذریعہ ترکیب کلونل امپلیفکیشن کے اختتام پر، تمام ریورس اسٹرینڈز بہاؤ سیل سے دھوئے جاتے ہیں، جس سے صرف آگے کے اسٹرینڈز رہ جاتے ہیں۔ ایک پرائمر فارورڈ اسٹرینڈز اڈاپٹر پرائمر بائنڈنگ سائٹ سے منسلک ہوتا ہے، اور ایک پولیمرس ڈی این اے اسٹرینڈ میں فلوروسینٹ ٹیگ شدہ ڈی این ٹی پی کا اضافہ کرتا ہے۔ فلورفور کے بلاکنگ گروپ کے طور پر کام کرنے کی وجہ سے فی راؤنڈ صرف ایک بیس شامل کیا جا سکتا ہے ؛ تاہم، بلاکنگ گروپ ریورسیبل ہے۔ چار رنگوں کی کیمسٹری کا استعمال کرتے ہوئے، چاروں اڈوں میں سے ہر ایک کا ایک منفرد اخراج ہوتا ہے، اور ہر دور کے بعد، مشین ریکارڈ کرتی ہے کہ کون سا اڈہ شامل کیا گیا تھا۔ ایک بار رنگ ریکارڈ ہونے کے بعد فلوروفور کو دھو دیا جاتا ہے اور ایک اور ڈی این ٹی پی کو فلو سیل پر دھویا جاتا ہے اور اس عمل کو دہرایا جاتا ہے۔ نیکسٹسیک اور بعد میں منیسیک کے آغاز سے شروع کرتے ہوئے، الومینا نے ایک نئی دو رنگوں کی ترتیب کی کیمسٹری متعارف کرائی۔ نیوکلیوٹائڈز کو دو رنگوں میں سے کسی ایک (سرخ یا سبز)، کوئی رنگ ("سیاہ") یا دونوں رنگوں کے امتزاج (سرخ اور سبز کے درمیان مرکب کے طور پر نارنجی دکھائی دینے) سے ممتاز کیا جاتا ہے۔ ایک بار ڈی این اے اسٹرینڈ کو پڑھنے کے بعد، جو اسٹرینڈ ابھی شامل کیا گیا تھا وہ بہہ جاتا ہے۔ پھر، انڈیکس 1 پرائمر منسلک ہوتا ہے، انڈیکس 1 کی ترتیب کو پولیمرائز کرتا ہے، اور دھویا جاتا ہے۔ اسٹرینڈ دوبارہ ایک پل بناتا ہے، اور ڈی این اے اسٹرینڈ کا 3 'سرے بہاؤ سیل پر ایک اولیگو سے منسلک ہوتا ہے۔ انڈیکس 2 پرائمر منسلک ہوتا ہے، ترتیب کو پولیمرائز کرتا ہے، اور دھویا جاتا ہے۔ ایک پولیمرس آرچڈ اسٹرینڈ کے اوپر تکمیلی اسٹرینڈ کو ترتیب دیتا ہے۔ وہ الگ ہو جاتے ہیں، اور ہر اسٹرینڈ کے 3 'سرے کو بلاک کر دیا جاتا ہے۔ فارورڈ اسٹرینڈ دھل جاتا ہے، اور ترکیب کے ذریعے ترتیب کا عمل ریورس اسٹرینڈ کے لیے دہرایا جاتا ہے۔ اعداد و شمار کا تجزیہ سیکوینسنگ ایک ہی وقت میں لاکھوں کلسٹرز کے لیے ہوتی ہے، اور ہر کلسٹر میں ڈی این اے کے اندراج کی ~ 1,000 ایک جیسی کاپیاں ہوتی ہیں۔ ترتیب کے اعداد و شمار کا تجزیہ اوور لیپنگ علاقوں کے ساتھ ٹکڑوں کو ڈھونڈ کر کیا جاتا ہے، جنہیں کونٹگس کہا جاتا ہے، اور انہیں لائن اپ کیا جاتا ہے۔ اگر ایک حوالہ ترتیب معلوم ہے، تو متغیر شناخت کے لیے کونٹگس کا اس سے موازنہ کیا جاتا ہے۔ یہ ٹکڑے ٹکڑے کا عمل سائنس دانوں کو مکمل ترتیب کو دیکھنے کی اجازت دیتا ہے حالانکہ ایک غیر منقسم ترتیب کبھی نہیں چلائی گئی تھی۔ تاہم، کیونکہ الومینا پڑھنے کی لمبائی بہت لمبی نہیں ہوتی ہے (ہائیسیک ترتیب تقریبا 90 بی پی لمبی پڑھنے کی لمبائی پیدا کر سکتی ہے)، یہ مختصر ٹینڈم ریپیٹ علاقوں کو حل کرنے کے لیے ایک جدوجہد ہو سکتی ہے۔ نیز، اگر ترتیب ڈی نووو ہے اور کوئی حوالہ موجود نہیں ہے، تو بار بار علاقے ترتیب اسمبلی میں بہت مشکل کا سبب بن سکتے ہیں۔ اضافی مشکلات میں غلط پولیمیرس، چیمیرک سیکوینس، اور پی سی آر-بیاس کے ذریعہ بیس متبادل (خاص طور پر ریڈز کے 3 'سرے پر) شامل ہیں، یہ سب غلط ترتیب پیدا کرنے میں معاون ثابت ہوسکتے ہیں۔ ترتیب کے دیگر طریقوں کے ساتھ موازنہ یہ تکنیک ترتیب کے روایتی طریقوں جیسے سینگر ترتیب کے مقابلے میں کئی فوائد پیش کرتی ہے۔ سینگر ترتیب کے لیے دو رد عمل کی ضرورت ہوتی ہے، ایک فارورڈ پرائمر کے لیے اور دوسرا ریورس پرائمر کے لیے۔ ایلیومینا کے برعکس، سینگر سیکوینسنگ ڈی این اے ٹکڑے کی ترتیب کا تعین کرنے کے لیے فلوروسینٹ لیبلڈ ڈائیڈوکسینوکلیوسائڈ ٹرائی فاسفیٹس (ڈی ڈی این ٹی پیز) کا استعمال کرتی ہے۔ ڈی ڈی این ٹی پیز 3 'او ایچ گروپ سے محروم ہیں اور ڈی این اے کی ترکیب کو مستقل طور پر ختم کر دیتے ہیں۔ ہر ری ایکشن ٹیوب میں ڈی این ٹی پیز اور ڈی ڈی این ٹی پیز کو ڈی این اے پولیمریز اور پرائمرز کے ساتھ شامل کیا جاتا ہے۔ ڈی ڈی این ٹی پیز اور ڈی این ٹی پیز کا تناسب اہم ہے کیونکہ ٹیمپلیٹ ڈی این اے کو مکمل طور پر ترکیب کرنے کی ضرورت ہے، اور ڈی ڈی این ٹی پیز کی کثرت ڈی این اے ٹیمپلیٹ کے ایک ہی سائز اور پوزیشن کے متعدد ٹکڑے بنائے گی۔ جب ڈی این اے پولیمریز ڈی ڈی این ٹی پی کا اضافہ کرتا ہے تو ٹکڑا ختم ہو جاتا ہے اور ایک نیا ٹکڑا ترکیب کیا جاتا ہے۔ ترکیب شدہ ہر ٹکڑا آخری سے ایک نیوکلیوٹائڈ لمبا ہوتا ہے۔ ایک بار جب ڈی این اے ٹیمپلیٹ کو مکمل طور پر ترکیب کیا جاتا ہے، تو ٹکڑوں کو کیپلری الیکٹروفورسس کے ذریعے الگ کیا جاتا ہے۔ کیپلری ٹیوب کے نچلے حصے میں ایک لیزر فلوروسینٹ لیبل والے ڈی ڈی این ٹی پیز کو متحرک کرتا ہے اور ایک کیمرہ خارج ہونے والے رنگ کو پکڑتا ہے۔ الومینا ڈائی سیکوینسنگ کی خودکار نوعیت کی وجہ سے ایک ہی وقت میں متعدد تاروں کو ترتیب دینا اور اصل ترتیب کا ڈیٹا تیزی سے حاصل کرنا ممکن ہے۔ سینگر سیکوینسنگ کے ساتھ، ایک وقت میں صرف ایک اسٹرینڈ کو سیکوینس کیا جا سکتا ہے اور یہ نسبتا سست ہے۔ الیومینا صرف ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کرتا ہے جو کہ ترتیب کی دیگر تکنیکوں کے لیے درکار متعدد، مہنگے انزائموں کے برعکس ہے (یعنی۔ پائروسیکوینسنگ)۔ حوالہ جات ڈی این اے ترتیب کے طریقے