Ribosome profiling
رائبوسوم پروفائلنگ، یا رائبو سیک (جسے رائبوسوم فوٹ پرنٹنگ بھی کہا جاتا ہے)، تقریبا 50 سال پہلے جان اسٹٹز اور مارلن کوزک کی تیار کردہ ایک تکنیک کی موافقت ہے جسے نکولس انگولیا اور جوناتھن ویس مین نے اگلی نسل کی ترتیب کے ساتھ کام کرنے کے لیے ڈھال لیا ہے جو اس بات کا تعین کرنے کے لیے خصوصی میسنجر آر این اے (ایم آر این اے) ترتیب کا استعمال کرتا ہے کہ کون سے ایم آر این اے کا فعال طور پر ترجمہ کیا جا رہا ہے۔ ایک متعلقہ تکنیک جو اس بات کا تعین کرنے کے لیے بھی استعمال کی جا سکتی ہے کہ کون سے ایم آر این اے کا فعال طور پر ترجمہ کیا جا رہا ہے وہ ہے ٹرانسلیٹنگ رائبوسوم افینیٹی پیوریفکیشن (ٹی آر اے پی) طریقہ کار، جسے راکفیلر یونیورسٹی میں ناتھنیل ہینٹز نے (پال گرینگارڈ اور میریم ہیمن کے تعاون سے) تیار کیا تھا۔ ٹی آر اے پی میں رائبوسوم فٹ پرنٹنگ شامل نہیں ہے لیکن سیل کی قسم سے متعلق مخصوص معلومات فراہم کرتا ہے۔ تفصیل یہ تمام رائبوسومز کا ایک "گلوبل سنیپ شاٹ" تیار کرتا ہے جو ایک خاص لمحے میں سیل میں فعال طور پر ترجمہ کرتا ہے، جسے ٹرانسلاٹوم کہا جاتا ہے۔ نتیجتا، یہ محققین کو ٹرانسلیشن اسٹارٹ سائٹس کے مقام، سیل یا ٹشو میں ترجمہ شدہ او آر ایف کی تکمیل، میسنجر آر این اے پر رائبوسومز کی تقسیم، اور ترجمہ کرنے والے رائبوسومز کی رفتار کی نشاندہی کرنے کے قابل بناتا ہے۔ ربوسوم پروفائلنگ ترجمہ کے ذریعے ڈیکوڈنگ کے عمل کے دوران ربوسوم کے ذریعے محفوظ کردہ صرف ایم آر این اے ترتیب کو نشانہ بناتی ہے، جو نمونے میں موجود دی گئی ترتیب کے تمام ایم آر این اے کو ترتیب دیتی ہے۔ یہ تکنیک پولیسوم پروفائلنگ سے بھی مختلف ہے۔ رائبوسوم پروفائلنگ اس دریافت پر مبنی ہے کہ رائبوسوم کے اندر ایم آر این اے کو نیوکلیز کے استعمال کے ذریعے الگ کیا جا سکتا ہے جو غیر محفوظ ایم آر این اے کے علاقوں کو خراب کرتے ہیں۔ یہ تکنیک ایم آر این اے کے پروٹین میں تبدیل ہونے والے علاقوں کے ساتھ ساتھ عالمی جین کے اظہار کے بارے میں بصیرت فراہم کرنے کے لیے ہر خطے کے ترجمے کی سطح کا تجزیہ کرتی ہے۔ اس کی نشوونما سے پہلے، ویو میں ترجمہ کی پیمائش کرنے کی کوششوں میں پولیسومز سے الگ تھلگ آر این اے پر مائیکرو ارے تجزیہ کے ساتھ ساتھ ایپیٹوپ ٹیگڈ رائبوسومز کی وابستگی صاف کرنے کے ذریعے ٹرانسلیشنل پروفائلنگ شامل تھی۔ یہ مفید اور تکمیلی طریقے ہیں، لیکن نہ ہی رائبوسوم پروفائلنگ کے ذریعہ فراہم کردہ حساسیت اور پوزیشن کی معلومات کی اجازت دیتے ہیں۔ استعمال رائبوسوم پروفائلنگ کے تین اہم استعمال ہیں: ترجمہ شدہ ایم آر این اے کے علاقوں کی شناخت کرنا، یہ مشاہدہ کرنا کہ نیسنٹ پیپٹائڈز کو کس طرح جوڑ دیا جاتا ہے، اور مخصوص پروٹین کی مقدار کی پیمائش کرنا جو ترکیب شدہ ہوتے ہیں۔ ترجمہ شدہ ایم آر این اے خطوں کی شناخت مخصوص ادویات کا استعمال کرتے ہوئے، رائبوسوم پروفائلنگ ایم آر این اے کے ابتدائی خطوں، لمبے خطوں، اور ترجمہ رکنے کے علاقوں کی شناخت کر سکتی ہے۔ شروع کرنے والے علاقوں کا پتہ ہیرنگٹنائن یا لیکٹیڈومیسن شامل کرکے لگایا جا سکتا ہے تاکہ مزید آغاز کو روکا جا سکے۔ یہ سیل لائسیٹ میں ایم آر این اے کے ابتدائی کوڈن کا تجزیہ کرنے کی اجازت دیتا ہے، جسے غیر اے یو جی ترتیبات کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے جو ترجمہ شروع کرتے ہیں۔ دوسرے لمبے علاقوں کا پتہ اینٹی بائیوٹکس جیسے سائکلوہیکسیمائڈ جو ٹرانسلوکیشن کو روکتا ہے، کلورامفینکول جو رائبوسوم کے اندر پیپٹائڈز کی منتقلی کو روکتا ہے، یا غیر منشیات کے ذرائع جیسے تھرمل منجمد کرکے لگایا جا سکتا ہے۔ یہ لمبائی منجمد کرنے کے طریقے ترجمہ کی حرکیات کا تجزیہ کرنے کی اجازت دیتے ہیں۔ چونکہ متعدد رائبوسومز ترجمہ کے عمل کو تیز کرنے کے لیے ایک واحد ایم آر این اے مالیکیول کا ترجمہ کر سکتے ہیں، رائبوسیک ایم آر این اے کے اندر پروٹین کوڈنگ کے علاقوں کو ظاہر کرتا ہے اور یہ کتنی تیزی سے کیا جاتا ہے اس پر منحصر ہے کہ ایم آر این اے کی ترتیب کی جا رہی ہے۔ یہ رائبوسوم پروفائلنگ کو مخصوص کوڈن پر ٹرانسکرپٹوم کے اندر پوز سائٹس دکھانے کی بھی اجازت دیتا ہے۔ سست یا رکے ہوئے ترجمے کی یہ جگہیں رائبوسوم کی کثافت میں اضافے سے ظاہر ہوتی ہیں اور یہ وقفے مخصوص پروٹین کو خلیے کے اندر ان کے کردار سے جوڑ سکتے ہیں۔ چیپ کے ساتھ پیپٹائڈ فولڈنگ جوڑی رائبوسوم پروفائلنگ یہ واضح کر سکتی ہے کہ نئے ترکیب شدہ پروٹین کو کیسے اور کب جوڑ دیا جاتا ہے۔ ربو سیک کے فراہم کردہ قدموں کے نشانات کا استعمال کرتے ہوئے، عوامل سے وابستہ مخصوص ربوسومز، جیسے چیپرونز کو پاک کیا جا سکتا ہے۔ مخصوص وقت کے نکات پر رائبوسوم کو روکنا، اسے وقت کے ساتھ پولی پیپٹائڈ کا ترجمہ کرنے کی اجازت دینا، اور مختلف نکات کو چیپرون کے سامنے بے نقاب کرنا اور CHIP کا استعمال کرتے ہوئے باہر نکلنا ان نمونوں کو صاف کرتا ہے اور یہ ظاہر کر سکتا ہے کہ پیپٹائڈ کو کس وقت جوڑ دیا جا رہا ہے۔ پیمائش پروٹین کی ترکیب ریبو سیک کو ترجمہ کی کارکردگی کا اندازہ لگانے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے، جو پروٹین کی ترکیب کے لیے ایک پراکسی ہے۔ اس ایپلی کیشن کے لیے، رائبوسوم پروفائلنگ اور مماثل آر این اے سیکوینسنگ ڈیٹا تیار کیا جاتا ہے۔ ابتدائی اعداد و شمار کے تجزیے وقف شدہ کمپیوٹیشنل فریم ورک (مثال کے طور پر) کے ذریعے حاصل کیے جا سکتے ہیں۔ ترجمہ کی کارکردگی کو پھر اس کے آر این اے کے اظہار کو کنٹرول کرتے ہوئے ہر جین کے رائبوسوم کے قبضے کے طور پر شمار کیا جا سکتا ہے۔ اس نقطہ نظر کو پروٹین کی ہدایت شدہ خلل کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے جو آر این اے سے منسلک ہوتا ہے اور ترجمہ میں فرق کی پیمائش کے لیے رائبوسوم پروفائلنگ کا استعمال کرتا ہے۔ یہ خلل زدہ ایم آر این اے پروٹین کے ساتھ منسلک ہو سکتے ہیں، جن کے بائنڈنگ سائٹس کو پہلے ہی آر این اے پر نقشہ بنایا جا چکا ہے، تاکہ ضابطے کی نشاندہی کی جا سکے۔ طریقہ کار خلیوں یا بافتوں کو الگ کریں اور رائبوسومز سے منسلک ایم آر این اے مالیکیولز کو الگ کریں۔ کمپلیکس کو متحرک کریں۔ یہ عام طور پر سائکلوہیکسیمائڈ کے ساتھ انجام دیا جاتا ہے لیکن دیگر کیمیکل استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ ترجمہ کے نااہل لیسس کے حالات کے ساتھ ترجمہ کے روک تھام کو ترک کرنا بھی ممکن ہے۔ ربن نیوکلیز کا استعمال کرتے ہوئے، آر این اے کو ہضم کریں جو ربوسومز سے محفوظ نہیں ہے۔ سکروس گریڈینٹ ڈینسٹی سینٹری فیوگیشن یا خصوصی کرومیٹوگرافی کالموں کا استعمال کرتے ہوئے ایم آر این اے-رائبوسوم کمپلیکس کو الگ کریں۔ پروٹین کو ہٹانے کے لیے مرکب کی فینول/کلوروفارم طہارت۔ پہلے سے محفوظ ایم آر این اے ٹکڑوں کے لیے سائز کا انتخاب کریں۔ 3 'اڈاپٹر کو ٹکڑوں پر لگا دیں۔ معلوم آر آر این اے آلودگیوں کو گھٹا دیں (اختیاری)۔ ریورس ٹرانسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے آر این اے کو سی ڈی این اے میں ریورس ٹرانسکرائب کریں۔ اسٹرینڈ مخصوص انداز میں وسعت دیں۔ ترتیب پڑھتا ہے۔ ٹرانسلیشنل پروفائل کا تعین کرنے کے لیے ترتیب کے نتائج کو جینومک ترتیب سے ہم آہنگ کریں۔ خاص طور پر رائبوسوم پروفائلنگ کے لیے بنائے گئے کمپیوٹیشنل طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے نتیجے کے ڈیٹا کا تجزیہ کریں۔ مواد آر این اے-رائبوسوم کمپلیکس سائکلوہیکسیمائڈ نیوکلیز فینول/کلوروفارم ریورس ٹرانسکرپٹیس ڈی این ٹی پیز سیکوینسنگ میتھڈ-سی ڈی این اے لائبریری۔ حوالہ جات بیرونی روابط جی ڈبلیو آئی پی ایس-وز براؤزر ربو گیلیکسی آر پی ایف-ڈی بی ٹرپس-وی آئی زیڈ براؤزر ربو فلو، ربو آر، ربو پائی جینومکس تکنیک ربوزیمز مالیکیولر بائیولوجی تکنیک