Ribose-seq
ربوز-سیق ایک نقشہ سازی کی تکنیک ہے جو جینیاتی ڈی این اے میں سرایت شدہ ربنیوکلیوٹائڈز، خاص طور پر ربنیوکلیوسائڈ مونو فاسفیٹس (آر این ایم پیز) کی مکمل پروفائل کا تعین کرنے کے لیے جینیات کی تحقیق میں استعمال ہوتی ہے۔ سرایت شدہ ربن نیوکلیوٹائڈز کو خلیوں میں ڈی این اے میں سب سے عام تبدیلی سمجھا جاتا ہے، اور جینومک ڈی این اے میں ان کی موجودگی جینوم کے استحکام کو متاثر کر سکتی ہے۔ جیسا کہ حالیہ مطالعات نے تجویز کیا ہے کہ ماؤس کے ڈی این اے میں ربنیوکلیوٹائڈز بیماری کی بیماری کو متاثر کر سکتے ہیں، جینومک ڈی این اے میں ربنیوکلیوٹائڈ کا شامل ہونا طبی جینیات کی تحقیق کا ایک اہم ہدف بن گیا ہے۔ ربوز-سیق سائنسدانوں کو ربن نیوکلیوٹائڈز کے عین مقام اور قسم کا تعین کرنے کی اجازت دیتا ہے جو یوکرائیوٹک یا پروکیریوٹک ڈی این اے میں شامل کیے گئے ہیں۔ یہ تکنیک ربن نیوکلیوٹائڈز کے 2 'سرے میں پائے جانے والے اضافی ہائیڈروکسیل گروپس (او ایچ) کی موجودگی کا فائدہ اٹھاتی ہے، جو ڈی این اے کو مسخ اور غیر مستحکم کر سکتی ہے۔ یہ تکنیک جارجیا انسٹی ٹیوٹ آف ٹیکنالوجی کے محققین کے ایک گروپ کے تعاون سے تیار کی گئی تھی جس میں فرانسیسکا اسٹوریسی اور کیونگ ڈیوک کوہ (جو اب یونیورسٹی آف کیلیفورنیا سان فرانسسکو میں ہیں)، اور یونیورسٹی آف کولوراڈو اینشوٹز میڈیکل اسکول کے جے ہیسلبرتھ شامل ہیں۔ نیوکلک ایسڈ وہ ضروری میکرو مالیکیول ہیں جو تمام حیات کی شکلوں میں جینیاتی معلومات رکھتے ہیں۔ یہ بائیو پولیمر نیوکلیوٹائڈ مونومرز پر مشتمل ہوتے ہیں، جو نامیاتی مالیکیول ہوتے ہیں جو فاسفیٹ گروپ، نائٹروجن پر مشتمل بیس، اور پانچ کاربن شوگر (ربنیوکلیوٹائڈز میں رائبوس اور ڈی آکسی رائبونیوکلیوٹائڈز میں ڈی آکسی رائبوس) پر مشتمل ہوتے ہیں۔ اگرچہ ربن نیوکلیوٹائڈز عام طور پر ربن نیوکلک ایسڈ (آر این اے) میں واقع ہوتے ہیں، لیکن وہ ڈی آکسی ریب نیوکلک ایسڈ (ڈی این اے) میں بھی پائے جا سکتے ہیں۔ ڈی این اے میں سرایت شدہ ربن نیوکلیوسائڈ مونو فاسفیٹس (آر این ایم پیز) کی پہلی دریافت 1973 میں لارنس گروسمین، رابرٹ واٹسن، اور جیروم ونوگراڈ کے ذریعہ چوہے اور انسانی خلیوں سے مائٹوکونڈریل ڈی این اے میں ہوئی تھی۔ 2006 میں، شیزوساکیرومیسیس پومبے ("فشن خمیر") کے نیوکلیئر ڈی این اے میں آر این ایم پیز کی موجودگی کی تصدیق ہوئی، اور اس کے بعد سے دیگر انواع میں تلاش جاری ہے۔ ڈی این اے میں ربن نیوکلیوٹائڈز کو شامل کرنا متعدد مطالعات نے ایسے طریقہ کار کی نشاندہی کی ہے جس کے ذریعے ربن نیوکلیوٹائڈز کو ڈی این اے میں شامل کیا جا سکتا ہے، اس سے ہٹایا جا سکتا ہے یا اس سے پیدا کیا جا سکتا ہے۔ بنیادی طور پر، ربن نیوکلیوٹائڈز کو ڈی این اے کی ترکیب کے عمل کے دوران ڈی این اے میں شامل کیا جاتا ہے۔ ڈی این اے نقل شروع کرنے کے لیے، مختصر آر این اے پرائمرز کو تکمیلی ڈی این اے پر ترکیب کیا جاتا ہے تاکہ بنیادی نقل کرنے والے انزائم، ڈی این اے پولیمریز کے بعد کے بائنڈنگ اور نقل کے عمل کی اجازت دی جا سکے۔ عام طور پر، ان پرائمرز کو پھر نیوکلیز انزائمز، آر نیسز ایچ یا فلیپ اسٹرکچر مخصوص اینڈو نیوکلیز 1 (ایف ای این 1) کے ذریعے ہٹا دیا جاتا ہے۔ اس طرح، عارضی آر این ایم پیز کی کافی مقدار موجود ہے جو ڈی این اے میں آر این اے پرائمر کی شکل میں موجود ہوتی ہے اور پھر بعد میں ہٹا دی جاتی ہے۔ ڈی این اے کی نقل شروع ہونے کے بعد، آر این ایم پیز کو ڈی این اے پولیمریز کے ذریعے ڈی این اے میں مکمل طور پر شامل کیا جا سکتا ہے اور یہ ڈی این اے میں ربنیوکلیوٹائڈ کو شامل کرنے کے بڑے طریقہ کار کی نمائندگی کرتا ہے جس میں فی 1,000 ڈی آکسیریبونیوکلیوٹائڈز میں 1 سے زیادہ ربنیوکلیوٹائڈ شامل ہوتے ہیں۔ سرایت شدہ آر این ایم پیز کو اکثر ربن نیوکلیوٹائڈ ایکسژن مرمت (آر ای آر) میکانزم کے ذریعے ہٹانے کے لیے نشانہ بنایا جاتا ہے۔ تاہم، اگر آر ای آر صحیح طریقے سے کام نہیں کر رہا ہے، تو یہ ڈی این اے میں سرایت شدہ آر این ایم پیز کا زیادہ مستقل ذریعہ بن سکتا ہے۔ ایک اور طریقہ کار جس کے ذریعے ڈی این اے میں آر این ایم پی پیدا ہو سکتے ہیں وہ آکسیڈیٹیو تناؤ کے ذریعے ہے، جو ڈی این اے میں موجود ڈی آکسی رائیبوس یونٹ کو رائبوس میں تبدیل کر دیتا ہے۔ اگرچہ آر ای آر راستہ ڈی این اے سے آر این ایم پیز کو ہٹانے کے لیے سب سے موثر عمل ہے، لیکن ربنیوکلیوٹائڈز کو 3 '-5' ایکسونیوکلائز سرگرمی کے ذریعے بھی ہٹایا جا سکتا ہے جو ڈی این اے نقل کے دوران ڈی این اے پولیمرس کی پروف ریڈنگ سرگرمیوں کے ذریعے ترتیب دی جاتی ہے۔ آر این ایم پی کو ہٹانے کے اضافی طریقوں میں چیرا شامل ہیں جو آئسومیرس انزائم، ٹوپو آئسومیرس I کے ذریعہ ثالثی کرتے ہیں۔ ڈی این اے میں ربن نیوکلیوٹائڈز کے نتائج اگر ہٹائے اور تبدیل نہ کیے جائیں تو ڈی این اے میں ربن نیوکلیوٹائڈز سیلولر عمل پر ساختی، کیمیائی اور فعال اثرات مرتب کر سکتے ہیں۔ جیسا کہ سب سے پہلے ٹی این نے تسلیم کیا۔ 1993 میں جیسری اور دیگر، ربن نیوکلیوٹائڈز کی موجودگی ڈی این اے کی ہیلیکل شکل کو بی شکل سے اے شکل میں تبدیل کر سکتی ہے۔ یہ، متعدد دیگر کیمیائی نتائج کے علاوہ، ڈی این اے کے ساتھ پروٹین کے پابند ہونے کو متاثر کر سکتا ہے اور کرومیٹن ڈائنامکس، ڈی این اے ریپلیکیشن، ٹرانسکرپشن، مرمت، اور مییوسس جیسے عمل کے لیے مضمرات پیدا کر سکتا ہے۔ مزید برآں، کچھ ڈی این اے پولیمریز ڈی این اے کی نقل کے دوران سرایت شدہ آر این ایم پیز کو بائی پاس کرنے سے قاصر ہیں، جو آر این ایم پیز کے لمبے تاروں والی جگہوں پر مزید بڑھ جاتا ہے۔ یہ نقل کشیدگی کا سبب بن سکتا ہے جو ممکنہ طور پر نقل، کروموسوم کی علیحدگی، اور مستقبل کی نقل میں مداخلت کر سکتا ہے۔ مزید برآں، آر ای آر کے عمل میں بعض ضمنی مصنوعات یا ناکامیاں بھی ممکنہ طور پر ڈی این اے کے ٹوٹنے، دوبارہ ترتیب اور جینوم کے عدم استحکام کا باعث بن سکتی ہیں۔ ربنیوکلیوٹائڈ میپنگ 2015 تک، ڈی این اے میں آر این ایم پیز کو شامل کرنے کے لیے کچھ میکانزم، نتائج، اور تخمینہ کی شرحیں تیزی سے واضح ہو رہی تھیں۔ تاہم، جینوم میں آر این ایم پیز کے مقام کی شناخت کے لیے ایک تکنیک کا ابھی تک فقدان تھا۔ اگلی نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجیز کی بڑھتی ہوئی رسائی نے بڑے پیمانے پر جینومک ڈی این اے میں آر این ایم پیز کی زیادہ درست شناخت کے ہدف کی طرف پیشرفت میں سہولت فراہم کی۔ 2015 میں، کیونگ ڈیوک کوہ، ستیہ بالا چندر، جے آر ہیسلبرتھ اور فرانسیسکا اسٹوریسی نے رائبوس سیک پیش کیا، جو ڈی این اے میں آر این ایم پیز کی منظم پروفائلنگ کے لیے ایک نئی تیار کردہ تکنیک ہے۔ انہوں نے مائٹوکونڈریل اور نیوکلیئر ڈی این اے میں آر این ایم پیز کی جینوم وسیع شناخت، تعدد، اور لوکلائزیشن کو دستاویز کرنے کے لیے Saccharomyces cerevisiae جینوم پر رائبوس-سیق کا اطلاق کیا۔ ان نتائج نے بالآخر جینوم میں آر این ایم پی کو شامل کرنے کے نمونوں کے بارے میں نئی بصیرت فراہم کی۔ رائبوس-سیق کے متوازی، ڈی این اے میں سرایت شدہ آر این ایم پیز کی سائٹس کو پکڑنے کے لیے تین دیگر تکنیکیں تیار کی گئیں: ایم ریبو-سیق، ہائیڈ این-سیق، اور پیو-سیق۔ رائبوس-سیق طریقہ کار ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کی تیاری میں رائبونوکلیوٹائڈز کو پکڑنے اور ٹیگ کرنے کے لیے متعدد منفرد خصوصیات کا استعمال کرتا ہے۔ آر این ایم پی سائٹس کو براہ راست نشانہ بنانے کے لیے، مصنفین نے الکلی علاج کے عمل کا استعمال کیا جو آر این ایم پی سائٹس پر ڈی این اے کو خراب اور الگ کرتا ہے۔ ان مقامات پر کلیویج کی خاصیت ربن نیوکلیوٹائڈز پر موجود اضافی ہائڈرروکسیل گروپ کی وجہ سے اس خطے میں مالیکیول کی نسبتا حساسیت سے کارفرما ہے۔ ان چھوٹے ٹکڑوں کے استحکام اور افزودگی کی اجازت دینے اور پی سی آر امپلیفیکیشن سے پہلے ٹی 5 ایکسونکیولیز ڈائجشن سے تحفظ کے لیے، سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کے ٹکڑے-جن میں دلچسپی کا آر این ایم پی اور ایک منفرد سالماتی شناختی نمبر ہوتا ہے-سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے (ایس ایس ڈی این اے) حلقے بنانے کے لیے خود سے منسلک ہوتے ہیں۔ آر این ایم پی اور ڈی این اے کے اختتام کو آسان بنانے کے لیے، کوہ اور دیگر۔ 2 '-فاسفیٹ (آر این ایم پی سائیڈ) کو 5'-فاسفیٹ (ڈی این اے سائیڈ) سے جوڑنے کی اجازت دینے کے لیے عربیڈوپسس تھالیانا ٹی آر این اے لیگیز (اے ٹی آر این ایل) کی مخصوص لائیگیشن ایکشن کو بروئے کار لائیں۔ آخر میں، اس تکنیک سے پوری تیار شدہ لائبریری کی ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ تمام کیپچرڈ ایمبیڈڈ آر این ایم پیز کے جینومک کوآرڈینیٹس کی شناخت کرتی ہے۔ 2019 میں، اسٹوریسی لیب نے رائبوس-سیق کے لیے ایک تازہ ترین اور مزید بہتر پروٹوکول پیش کیا۔ ان ترامیم میں چھوٹے مالیکیولر بارکوڈ اڈاپٹرز، چھوٹے ٹکڑے، تبدیل شدہ پی سی آر سیٹنگز، اور جیل سے کاٹنے اور صاف کرنے کے لیے ایڈجسٹ سائز کی حدود کا استعمال شامل تھا۔ مجموعی طور پر، یہ تجویز کیا گیا تھا کہ بہتر پروٹوکول بڑے جینوموں میں ایپلی کیشنز کے لیے طریقہ کار کی کارکردگی میں کافی اضافہ کر سکتا ہے۔ طریقوں کی تیاری جینومک ڈی این اے نکالنے میں دلچسپی رکھنے والے خلیوں سے جینومک ڈی این اے نکالنے کے لیے، خلیوں کو پہلے مکینیکل یا کیمیائی طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے لیس کیا جانا چاہیے۔ اس سے ہر خلیے کے مرکزے سے ڈی این اے خارج ہوتا ہے، جس سے اسے پاک اور مقداری بنایا جا سکتا ہے۔ رائبوس-سیق پروٹوکول کے لیے کل 10 یو جی ڈی این اے کی ضرورت ہوتی ہے۔ رائبوس-سیق اڈاپٹر کی تیاری رائبوس-سیق اڈاپٹر ایک ڈی ٹی (ڈی آکسیریبونیوکلیوٹائڈ تھامین) سے بنا ہوتا ہے جس کے بعد ایک اینیلنگ سیکوینس، دو پرائمر سیکوینس، اور ایک منفرد مالیکیولر آئیڈینٹیفائر (یو ایم آئی) ہوتا ہے۔ رائبوس-سیق اڈاپٹر تیار کرنے کے لیے، تین اولیگونیوکلیوٹائڈز (اولیگوس) کو ایک محلول میں شامل کیا جاتا ہے اور 95-100 °C پر گرم کیا جاتا ہے۔ اس درجہ حرارت پر، اولیگو کے سلسلے ایک دوسرے سے مل جاتے ہیں، جس سے رائبوس-سیق اڈاپٹرز کی معطلی پیدا ہوتی ہے۔ اس کے بعد ڈی سالٹڈ ڈبل اسٹرینڈڈ رائبوس-سیق اڈاپٹر کی مقدار کا تعین کیا جاتا ہے۔ رائبوس-سیق کے لیے 10 یو ایم کا ارتکاز درکار ہوتا ہے۔ جینومک ڈی این اے جینومک ڈی این اے کا رائبوس-سیک فریگمینٹیشن بلٹ اینڈڈ ریسٹریکشن انزائم ڈائجشن کا استعمال کرتے ہوئے ٹکڑے ٹکڑے کیا جاتا ہے۔ ہاضمے کے بعد، بکھرے ہوئے ڈی این اے کو پاک اور مقداری بنایا جاتا ہے۔ آر این ایم پی کیپچر تکنیک (آر ای ایس سی او ٹی) کے لیے پابندی انزائم سیٹ اور امتزاج اصلاح کے اوزار آر این ایم پی کیپچر کی شرح کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے تیار کیے گئے تھے۔ نتیجے میں حل 500-سے 3,000-بی پی جینومک ٹکڑوں کی آبادی پر مشتمل ہوتا ہے جس کا اوسط سائز ~ 1.5 کے بی ہوتا ہے۔ اس کے بعد ڈی اے-ٹیلنگ اور اڈاپٹر لائیگیشن کے لیے 10 پیگ کے ٹکڑے ٹکڑے شدہ جینومک ڈی این اے کی ضرورت ہوتی ہے۔ ڈی اے-ٹیلنگ اور اڈاپٹر لائیگیشن ڈی اے مالیکیولز ہر ٹکڑے کی دم سے جڑے ہوتے ہیں، جس سے رائبوس-سیق اڈاپٹر کے ڈی ٹی کو اگلے مرحلے میں اس کی متعلقہ ڈی اے دم کو باندھنے کی اجازت ملتی ہے۔ اس عمل کے بعد، ڈی اے دم والے ڈی این اے کو صاف کیا جاتا ہے اور پانی سے خارج کیا جاتا ہے۔ رائبوس-سیق اڈاپٹر، جس میں اس کا بے ترتیب 8 بیس منفرد سالماتی شناخت کنندہ (یو ایم آئی) اور سنگل ڈی ٹی اوور ہینگ ہوتا ہے، پھر راتوں رات حل کو 15 سی پر ٹھنڈا کرکے ہدف کے ٹکڑے کے ڈی اے سرے سے منسلک کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد نمونے کو صاف کیا جاتا ہے اور الکلی علاج کے لیے تیار کیا جاتا ہے۔ الکلی علاج الکلی علاج کے دوران، ڈبل اسٹرینڈڈ ڈی این اے (ڈی ایس ڈی این اے) کا علاج سوڈیم ہائیڈروکسائڈ کے ساتھ کیا جاتا ہے، جو ایک مضبوط بیس ہے، تاکہ ڈی ایس ڈی این اے کو خراب کیا جا سکے اور سرایت شدہ ربنیوکلیوٹائڈ سائٹس پر ڈی این اے کو الگ کیا جا سکے۔ یہ بے نقاب دو سروں کے ساتھ سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے (ایس ایس ڈی این اے) کے ٹکڑے پیدا کرتا ہے: ایک 2′، 3′-سائیکلک فاسفیٹ اینڈ اور ایک مخالف 5′-ہائیڈروکسیل اینڈ۔ اس کے بعد الکلین محلول کو غیر جانبدار کیا جاتا ہے، اور ایس ایس ڈی این اے کو پاک کیا جاتا ہے۔ سیلف لائیگیشن (سرکلرائزیشن) اگلا، ایس ایس ڈی این اے پر مشتمل محلول کو عربی ڈوپسس تھالیانا ٹی آر این اے لیگس (اے ٹی آر این ایل 24) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ اے ٹی آر این ایل آر این اے کے 2 ′، 3 ′-سائیکلک فاسفیٹ سروں کو 2 ′-فاسفیٹ میں تبدیل کرکے اے تھلینانا آر آر این اے کی پختگی میں مدد کرتا ہے اور انہیں آر این اے یا ڈی این اے کے 5 ′-فاسفیٹ سروں سے جوڑتا ہے۔ اے ٹی آر این ایل کو ایس ایس ڈی این اے حل سے متعارف کرانا ایس ایس ڈی این اے کے سیلف لائیگیشن کو متحرک کرتا ہے کیونکہ 2 '، 3' سائیکلک فاسفیٹ اسی ایس ایس ڈی این اے اسٹرینڈ کے 5 'فاسفیٹ سرے پر لیگیٹ ہوتا ہے۔ نتیجے میں آنے والے سائیکلکل ایس ایس ڈی این اے ڈھانچے میں ٹارگٹڈ ایمبیڈڈ ربنیوکلیوٹائڈ سیکوینس، ایک یو ایم آئی، اور اولیگو سیکوینس ہوتے ہیں جو بقیہ سرکلر ایس ایس ڈی این اے ڈھانچہ بناتے ہیں۔ لکیری ایس ایس ڈی این اے کو ہٹانا سیلف لائیگیشن کے ذریعے بنائے گئے سرکلر ایس ایس ڈی این اے ڈھانچے اینزائم ٹی 5 ایکسونیوکلیز کے ذریعے انحطاط کے خلاف مزاحم ہیں۔ تاہم، غیر محدود، لکیری ایس ایس ڈی این اے نہیں ہے۔ لہذا، مصنوعات اور بقیہ ڈی این اے کے ٹکڑوں کا ٹی 5 ایکسونوکلیز کے ساتھ علاج کرنے سے منتخب طور پر غیر منسلک، لکیری ایس ایس ڈی این اے اسٹرینڈز کو کم کر دیتا ہے، جبکہ خود سے منسلک ایس ایس ڈی این اے کے حلقوں کو برقرار رکھتا ہے۔ اس طرح، ناپسندیدہ لکیری ایس ایس ڈی این اے کے ٹکڑے ٹکڑے ہو جاتے ہیں اور صرف کامیابی سے جڑے ہوئے ایس ایس ڈی این اے کے حلقے باقی رہتے ہیں۔ 2 'فاسفیٹ کو ہٹانا اس سے پہلے کہ پی سی آر ممکن ہو، ایس ایس ڈی این اے حلقوں کے منسلک جنکشنوں پر 2' فاسفیٹ گروپوں کو ہٹانا ضروری ہے۔ اس کو پورا کرنے کے لیے، سرکلر ایس ایس ڈی این اے محلول کو 2 'فاسفوٹ ٹرانسفرس، ٹی پی ٹی 1 کے ساتھ ٹریٹ کیا جاتا ہے، اور لائیگیشن جنکشن پر باقی 2' فاسفیٹ کو ہٹا دیا جاتا ہے۔ پولی میریز چین ری ایکشن (پی سی آر) رائبوس-سیق کے بعد، پی سی آر امپلیفکیشن کا استعمال کرتے ہوئے ہر ایس ایس ڈی این اے دائرے پر امپلیفکیشن کیا جاتا ہے۔ پی سی آر کے پہلے دور میں، سیکوینسنگ پرائمرز کو محلول میں متعارف کرایا جاتا ہے اور ایس ایس ڈی این اے کے حلقوں کو بڑھایا جاتا ہے۔ منتخب کردہ سیکوینسنگ پرائمرز کو اپنی پسند کی ٹارگٹ لائبریری کے مطابق ہونا چاہیے۔ تفصیلات کے لیے ایپلی کیشنز سیکشن دیکھیں۔ پی سی آر کے دوسرے دور میں، زیادہ مخصوص ترتیب والے پرائمر متعارف کرائے جاتے ہیں، اور ایس ایس ڈی این اے کے حلقوں کو مزید بڑھایا جاتا ہے۔ پولی ایکریلامائیڈ جیل الیکٹروفورسس (پی اے جی ای) رائبوس-سیق لائبریری کی موجودگی کی تصدیق کرنے اور مثبت اور منفی کنٹرول کی جانچ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ سائز کا انتخاب اور جیل صاف کرنا جیل صاف کرنے کا استعمال ترتیب سے پہلے رائبوس-سیق لائبریری کو صاف کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ اس مرحلے پر، ٹکڑوں کو لمبائی کے لحاظ سے منتخب کیا جاتا ہے تاکہ ان ٹکڑوں کو ختم کیا جا سکے جو دلچسپی کے ہدف سائز کی حد سے باہر ہیں۔ ڈاون اسٹریم ایپلی کیشنز کے لیے استعمال کریں دلچسپی کے سلسلے کو پکڑنے اور صاف کرنے کے بعد، نمونوں کو ترتیب دیا جا سکتا ہے اور ڈاؤن اسٹریم ایپلی کیشنز کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ تفصیلات کے لیے ایپلی کیشنز سیکشن دیکھیں۔ ربوز-سیق کا اطلاق متعدد حالات میں اور مختلف یوکرائیوٹک پرجاتیوں کی بہت سی خلیوں کی اقسام کے لیے کیا جا سکتا ہے (دیکھیں: فوائد اور حدود)۔ ابتدائی خصوصیت ربوز-سیق کو سب سے پہلے کوہ اور دیگر نے استعمال کیا تھا۔ (2015) RNase-H2 کی کمی (rnh201) ابھرتے ہوئے خمیر کے مائٹوکونڈریل اور نیوکلیئر ڈی این اے میں rNMPs کے مقام کی خصوصیت کے لیے۔ انہوں نے پایا کہ آر این ایم پیز نیوکلیئر جینوم میں 0.449 آر این ایم پیز فی کلو بیس (کے بی) اور مائٹوکونڈریل جینوم میں 19.5 آر این ایم پیز فی کے بی پر موجود تھے۔ مزید برآں، کوہ اور دیگر۔ (2015) ایک واضح تعصب کی نشاندہی کرنے میں کامیاب رہے جو ڈی این اے میں آر سی اور آر جی کو شامل کرنے کے لیے موجود ہے۔ انہوں نے پایا کہ خمیر کے خلیوں میں، آر سی اور آر جی کو جینومک ڈی این اے میں آر اے اور آر یو سے زیادہ تعدد پر برقرار رکھا جاتا ہے، جو تمام اڈوں کی متعلقہ متوقع تعدد سے متعلق ہے۔ بیس کی قسم سے قطع نظر، آر این ایم پیز اکثر ان جگہوں پر موجود ہوتے تھے جو جوہری اور مائٹوکونڈریل ڈی این اے دونوں میں ڈی اے کے فورا نیچے کی طرف ہوتے تھے۔ آر این ایم پی کو شامل کرنے کے لیے بہت سے اضافی "ہاٹ سپاٹ" کی شناخت بھی مخصوص جینومک خصوصیات کے حوالے سے کی گئی تھی (مثال کے طور پر۔ مخصوص جین سائٹس، اسٹرینڈز، یا کروموسومل علاقوں میں)۔ کثیر انواع کے موازنہ ابتدائی خصوصیت پر توسیع، بالا چندر اور دیگر۔ (2020) نے ان کے رائبوس-سیق پروٹوکول کو بہتر بنایا اور اسے تین خمیر پرجاتیوں کے متعدد تناؤ کے مائٹوکونڈریل اور نیوکلیئر ڈی این اے میں آر این ایم پیز کا نقشہ بنانے کے لیے بائیو انفارمیٹکس ٹول (رائبوس-میپ، جو https://github.com/agombolay/ribose-map پر دستیاب ہے) کے ساتھ مل کر استعمال کیا: Saccharomyces cerevisiae، Saccharomyces paradoxus، اور Schizosaccharomyces pombe۔ ان پرجاتیوں اور تناؤ میں سے ہر ایک سے مائٹوکونڈریل ڈی این اے (ایم ٹی ڈی این اے) میں، یہ ظاہر کیا گیا کہ آر این ایم پی کی قسم جو کسی دی گئی جینومک پوزیشن میں شامل ہوتی ہے وہ ڈی این ایم پی سے سب سے زیادہ متاثر ہوتی ہے جو فوری اپ اسٹریم پوزیشن (-1) پر واقع ہوتی ہے۔ متعدد جینوموں میں رائبوس-سیق کا استعمال کرتے ہوئے، بالا چندر اور دیگر۔ خمیر کے تناؤ اور انواع کے درمیان مختلف مماثلتوں اور اختلافات کو بھی واضح کرنے کے قابل تھے۔ تمام تناؤ کے ایم ٹی ڈی این اے میں آر این ایم پی کے نمونوں نے آر یو کی کم تعدد ظاہر کی۔ تاہم، ایس پیراڈوکسس اور ایس سیریوسیا آر سی کے لیے ترجیحات کی نشاندہی کرتے ہیں جبکہ ایس پومبے نے آر جی کے لیے ترجیحات کی نشاندہی کی۔ نیوکلیئر ڈی این اے میں خمیر کی تین انواع بڑی حد تک ایک جیسی تھیں۔ مزید برآں، آر این ایم پیز کو شارٹ نیوکلیوٹائڈ ریپیٹ سیکوینس میں نمایاں طور پر افزودہ کیا گیا۔ رائبوس-سیق کے اس اطلاق نے آر این ایم پی کو شامل کرنے کے نمونوں کی خصوصیت اور ترتیب کے تناظر میں اس عمل کے ممکنہ ڈرائیوروں کی شناخت کی اجازت دی۔ خمیر کے جینوم سے پرے غیر خمیر پرجاتیوں میں کیے جانے والے پہلے ربنیوکلیوٹائڈ نقشہ سازی کے مطالعے میں، ربوز-سیق کو ربوز-میپ کے ساتھ مل کر کلمیڈوموناس رینہارڈی کے جوہری، مائٹوکونڈریل، اور کلوروپلاسٹ جینومز میں آر این ایم پیز کا نقشہ بنانے کے لیے استعمال کیا گیا، جو ایک فوٹو سنتھیٹک یونی سیلولر گرین الگا ہے۔ اس نوع کے مائٹوکونڈریل اور کلوروپلاسٹ ڈی این اے میں، آر اے کو دیگر اڈوں پر ترجیحی طور پر شامل کیا گیا، جبکہ جوہری ڈی این اے نے آر جی اور آر سی کے انضمام کی طرف تعصب ظاہر کیا۔ تمام سی۔ رینہارڈی آرگنیلز میں، آر یو مستقل طور پر سب سے کم نمائندگی والا آر این ایم پی تھا، جو خمیر مائٹوکونڈریا کے نتائج سے مطابقت رکھتا ہے۔ خمیر پروفائلز کی طرح، سی۔ رین ہارڈٹی میں آر این ایم پیز کو شامل کرنا ڈی این ایم پی کے فوری طور پر اوپر کی طرف (پوزیشن-1) سے سب سے زیادہ متاثر ہوتا ہے۔ اس ترتیب میں، رائبوس-سیق کے اطلاق نے پہلی بار اس نوع میں آر این ایم پی انضمام کی تقسیم اور نمونوں کی شناخت کی اجازت دی۔ رائبوس-سیق کے فوائد اور حدود رائبوس-سیق خاص طور پر ڈی این اے میں سرایت شدہ ربنیوکلیوٹائڈز کو نشانہ بناتا ہے، اور آر این اے پرائمرز یا اوکازاکی کے ٹکڑوں کو نہیں پکڑتا ہے، یہ انتہائی قابل منتقلی ہے اور جینومک ڈی این اے کی وسیع اقسام میں سرایت شدہ ربنیوکلیوٹائڈز کو مؤثر طریقے سے نشانہ بنا سکتا ہے۔ لہذا، رائبوس-سیق مختلف قسم کے جینوموں میں آر این ایم پی میپنگ کی اجازت دیتا ہے، بشمول چھوٹے جینومک مالیکیولز یا بڑے نیوکلیئر جینوم، معیاری طریقہ کار کی ضرورت کے بغیر۔ مزید برآں، رائبوس-سیق کی خاصیت آر این ایم پیز کی نقشہ سازی کی اجازت دیتی ہے یہاں تک کہ ان حالات میں بھی جن میں ڈی این اے ماحولیاتی تناؤ کا شکار ہوتا ہے جو وقفے اور/یا اباسک سائٹس پیدا کرکے ڈی این اے کو نقصان پہنچاتے ہیں۔ رائبوس-سیق ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے لیے اڈاپٹرز میں یو ایم آئی کا استعمال کرتا ہے جو سیکوینسنگ ریڈز کی کٹوتی کرنے کی اجازت دیتا ہے، اور اس طرح آر این ایم پی ہاٹ سپاٹ کا زیادہ درست پتہ لگانے کے لیے فراہم کرتا ہے۔ رائبوس-سیق خمیر کے خلیوں کے لیے مخصوص نہیں ہے۔ یہ تکنیک ممکنہ طور پر کسی بھی نوع کے کسی بھی خلیے کی قسم پر لاگو کی جا سکتی ہے، جس سے یہ زیادہ تر حیاتیات میں آر این ایم پیز کے مقام اور نمونے کو واضح کرنے کے لیے ایک مفید ذریعہ بن جاتا ہے۔ رائبوس-سیق عام لیبارٹری کا سامان اور ریجینٹ استعمال کرتا ہے جو کافی حد تک آسان ہوتے ہیں، جو اسے بہت سی سالماتی حیاتیات کی لیبارٹریوں میں استعمال کے لیے ایک قابل رسائی تکنیک بناتا ہے۔ رائبوس-سیق کی حدود کیونکہ یہ واحد آر این ایم پیز کو نشانہ بناتا ہے، رائبوس-سیق طویل رائبونوکلیوٹائڈ ٹریکٹس پر قبضہ نہیں کر سکتا۔ لہذا، رائبوس-سیق آر این اے پرائمرز یا اوکازاکی کے ٹکڑوں کی نقشہ سازی کے لیے مناسب تکنیک نہیں ہوگی، جو ڈی این اے کی نقل یا ٹوٹنے کے دوران بن سکتے ہیں۔ ربوز-سیق میں جینومک ڈی این اے سے آر این ایم پی لائبریریوں کو تیار کرنے میں تقریبا 4 دن لگتے ہیں۔ پروٹوکول بھی نسبتا پیچیدہ ہے، جس میں متعدد مراحل کی ضرورت ہوتی ہے۔ تکمیلی طریقے ربوز-میپ ربوز-میپ بڑے، پیچیدہ آر این ایم پی خام ترتیب کے ڈیٹا سیٹوں کی پروسیسنگ اور تجزیہ کے لیے ایک بائیو انفارمیٹک ٹول ہے۔ ربوز-میپ ربوز-سیق، ایم ریبوسیک، پیو-سیق، الک-ہائیڈن-سیق، اور آر ایچ آئی آئی-ہائیڈن-سیق کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔ (دیکھیں: آر این ایم پی کیپچر کے لیے دیگر تکنیکیں)۔ ریسکاٹ (ریسٹریکشن انزیم سیٹ اینڈ کمبی نیشن آپٹیمائزیشن ٹولز) ریسکاٹ ایک کمپیوٹیشنل طریقہ ہے جو پابندی والے انزائموں کے دیئے گئے انتخاب کے لیے آر این ایم پی سے پکڑے گئے علاقوں کی جینومک کوریج کا حساب لگاتا ہے اور پھر آر ای سیٹوں کو بہتر بناتا ہے اور آر این ایم پی کی گرفتاری کی شرح کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے سب سے زیادہ کوریج کے ساتھ آر ای سیٹ کا انتخاب کرتا ہے۔ آر این ایم پی کیپچر ایم ریبوسیک کے لیے دیگر تکنیکیں: 5 'طرف سے سرایت شدہ آر این ایم پی کے اوپر کی طرف ڈی آکسی ریبونوکلیوٹائڈ کو پکڑنے کے لیے انسانی آر نیس ایچ 2 اور ٹی 4 کوئیک لیگیز کا استعمال کرتا ہے۔ RHII-HydEn-seq: سرایت شدہ rNMP کو اس کی 5 ′ طرف سے پکڑنے کے لیے Escherichia coli RNase HII اور T4 RNA ligase کا استعمال کرتا ہے۔ آر ایچ آئی آئی-ہائیڈن-سیق آر این ایم پی، اور اوکازاکی کے ٹکڑوں کے ساتھ ختم ہونے والی ڈی این اے کی ترتیب کو بھی حاصل کر سکتا ہے۔ پیو-سیق: 3 'طرف سے سرایت شدہ آر این ایم پی کے نیچے کی طرف ڈی آکسیریبونیوکلیوٹائڈ کو پکڑنے کے لیے الکلین حالات اور ٹی 4 آر این اے لیگس کا استعمال کرتا ہے۔ اوکازاکی کے ٹکڑوں کو پکڑ سکتا ہے۔ الک-ہائیڈن-سیق: الکلین حالات اور ٹی 4 آر این اے لیگس کا استعمال کرتے ہوئے 3 'طرف سے سرایت شدہ آر این ایم پی کے نیچے کی طرف ڈی آکسیریبونیوکلیوٹائڈ کو پکڑتا ہے۔ اوکازاکی کے ٹکڑوں کو بھی پکڑا جا سکتا ہے۔ ری ایس کیو-سی کیو (ربن نیوکلیوٹائڈ اسکیننگ کوانٹیفیکیشن سیکوینسنگ): آر این ایم پی کے اپ اسٹریم پڑوسی ڈی آکسی رائب نیوکلیوٹائڈ کو پکڑنے کے لیے مطلق مقدار کا استعمال کرتا ہے۔ حوالہ جات ربن نیوکلیز جینیاتی نقشہ سازی