Hi-C (genomic analysis technique)
ہائی-سی (یا معیاری ہائی-سی) ایک ہائی تھرو پٹ جینومک اور ایپیجینومک تکنیک ہے جسے سب سے پہلے 2009 میں لیبرمین-ایڈن اور دیگر نے بیان کیا تھا۔ کرومیٹن کی تشکیل کو پکڑنے کے لیے۔ عام طور پر، ہائی-سی کو کروموسوم کنفارمیشن کیپچر ٹیکنالوجیز کی ایک سیریز کا مشتق سمجھا جاتا ہے، جس میں 3 سی (کروموسوم کنفارمیشن کیپچر)، 4 سی (کروموسوم کنفارمیشن کیپچر-آن-چپ/سرکلر کروموسوم کنفارمیشن کیپچر)، اور 5 سی (کروموسوم کنفارمیشن کیپچر کاربن کاپی) شامل ہیں لیکن ان تک محدود نہیں ہیں۔ ہائی-سی 3 سی اور نیکسٹ جنریشن سیکوینسنگ (این جی ایس) کے طریقوں کو ملا کر سیل نیوکلئس میں جینوم وسیع کرومیٹن کے تعاملات کا جامع طور پر پتہ لگاتا ہے اور اسے سی-ٹیکنالوجی (کروموسوم کنفارمیشن کیپچر پر مبنی ٹیکنالوجیز) کی ترقی اور 3 ڈی جینومکس کے آغاز میں ایک معیاری چھلانگ سمجھا جاتا ہے۔ کلاسک 3 سی تکنیک کی طرح، ہائی-سی تعدد کی پیمائش کرتا ہے (سیل کی آبادی پر اوسط کے طور پر) جس پر دو ڈی این اے کے ٹکڑے جسمانی طور پر 3 ڈی اسپیس میں منسلک ہوتے ہیں، جو کروموسومل ڈھانچے کو براہ راست جینومک ترتیب سے جوڑتے ہیں۔ ہائی-سی کے عمومی طریقہ کار میں فارملڈیہائیڈ کا استعمال کرتے ہوئے کرومیٹن مواد کو پہلے کراس لنک کرنا شامل ہے۔ پھر، کرومیٹن کو گھلنشیل اور ٹکڑے ٹکڑے کیا جاتا ہے، اور تعامل کرنے والے لوکی کو ایک ساتھ دوبارہ منسلک کیا جاتا ہے تاکہ چیمیرک ڈی این اے مالیکیولز کی جینومک لائبریری بنائی جا سکے۔ ان چیمیرا، یا لائیگیشن مصنوعات کی نسبتا کثرت، اس امکان سے متعلق ہے کہ متعلقہ کرومیٹن کے ٹکڑے سیل کی آبادی میں 3D جگہ میں تعامل کرتے ہیں۔ جبکہ 3C دلچسپی کے کروموسوم کے علاقوں کی تشکیل کی "ایک بمقابلہ کچھ" تحقیقات پیش کرنے کے لیے پہلے سے طے شدہ جینومک لوکی کے ایک سیٹ کے تجزیے پر توجہ مرکوز کرتا ہے، ہائی-سی تمام بکھرے ہوئے کرومیٹن کو بائیوٹینیلیٹڈ نیوکلیوٹائڈ کے ساتھ لیبل لگا کر "آل بمقابلہ سب" تعامل پروفائلنگ کو قابل بناتا ہے۔ نتیجے کے طور پر، بائیوٹن کے نشان والے لائیگیشن جنکشنز کو سٹریپٹا ویڈن لیپت مقناطیسی موتیوں کے ذریعے زیادہ مؤثر طریقے سے صاف کیا جا سکتا ہے، اور کرومیٹن کے تعامل کے اعداد و شمار کو ہائی-سی لائبریری کی براہ راست ترتیب کے ذریعے حاصل کیا جا سکتا ہے۔ ہائی-سی ڈیٹا کے تجزیے نہ صرف ممالیہ کروموسوم کی مجموعی جینومک ساخت کو ظاہر کرتے ہیں، بلکہ کرومیٹن کی بائیو فزیکل خصوصیات کے ساتھ ساتھ دور کے جینومک عناصر کے درمیان زیادہ مخصوص، طویل فاصلے کے رابطوں کے بارے میں بصیرت بھی پیش کرتے ہیں۔ جین اور ریگولیٹری عناصر کے درمیان)۔ حالیہ برسوں میں، ہائی-سی نے مختلف قسم کے حیاتیاتی شعبوں میں اپنا اطلاق پایا ہے، جن میں خلیوں کی نشوونما اور تقسیم، نقل و حمل کے ضابطے، قسمت کا تعین، نشوونما، بیماری اور جینوم ارتقاء شامل ہیں۔ ہائی-سی ڈیٹا کو دوسرے ڈیٹا سیٹس جیسے کرومیٹن ترمیم کے جینوم وسیع نقشے اور جین کے اظہار کے پروفائلز کے ساتھ جوڑ کر، جینوم کے ضابطے اور استحکام میں کرومیٹن کی تشکیل کے فعال کرداروں کو بھی بیان کیا جا سکتا ہے۔ تاریخ اپنے آغاز میں، ہائی-سی ایک کم ریزولوشن، اعلی شور والی ٹیکنالوجی تھی جو صرف 1 ملین بیس جوڑوں (ایم بی) کے بن سائز کے اندر کرومیٹن کے تعامل کے علاقوں کو بیان کرنے کی صلاحیت رکھتی تھی۔ ہائی-سی لائبریری کی تعمیر کے لیے بھی کئی دن درکار تھے، اور ڈیٹا سیٹ خود آؤٹ پٹ اور تولیدی صلاحیت دونوں میں کم تھے۔ اس کے باوجود، ہائی-سی ڈیٹا نے کرومیٹن کی تشکیل کے ساتھ ساتھ جوہری اور جینومک آرکیٹیکچرز کے لیے نئی بصیرت پیش کی، اور ان امکانات نے سائنسدانوں کو گزشتہ دہائی کے دوران اس تکنیک میں ترمیم کرنے کی کوششیں کرنے کی ترغیب دی۔ 2012 اور 2015 کے درمیان، ہائی-سی پروٹوکول میں کئی ترامیم کی گئی ہیں، جس میں 4-کٹر ڈائجشن یا اعلی ریزولوشن حاصل کرنے کے لیے گہری ترتیب کی گہرائی کو ڈھال لیا گیا ہے۔ زیادہ کثرت سے کاٹنے والے پابندی والے اینڈو نیوکلیز کے استعمال، یا ڈی این اے ایس آئی اور مائیکروکوکل نیوکلیز نے بھی طریقہ کار کے حل میں نمایاں اضافہ کیا۔ حال ہی میں (2017)، بیلغزل اور دیگر۔ ایک ہائی-سی 2 پروٹوکول بیان کیا جو کلو بیس (کے بی) ریزولوشن حاصل کرنے کے قابل تھا۔ بیس پروٹوکول کے لیے کلیدی موافقت جوہری ڈھانچے کو محفوظ رکھنے اور برقرار مرکزوں کے اندر لائیگیشن کے ذریعے بکھرے ہوئے کرومیٹن کے درمیان بے ترتیب لائیگیشن کو روکنے کے لیے ہاضمے کے بعد ایس ڈی ایس گھلنشیل مرحلے کو ہٹانا تھا، جس نے ان سیٹو ہائی-سی کی بنیاد بنائی۔ 2021 میں، ہائی-سی 3 کو لافونٹین اور دیگر نے بیان کیا تھا، جس میں فارملڈیہائیڈ کے ساتھ کراس لنکنگ کو بڑھا کر اعلی ریزولوشن حاصل کیا گیا تھا جس کے بعد ڈسکوینیمیڈائل گلوٹاریٹ (ڈی ایس جی) تھا۔ جبکہ فارملڈیہائیڈ پروٹین اور ڈی این اے دونوں کے امینو اور امینو گروپوں کو پکڑتا ہے، ڈی ایس جی میں این ایچ ایس-ایسٹر پروٹین پر پرائمری امینوں کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتے ہیں اور امین-امین تعاملات کو پکڑ سکتے ہیں۔ بیس پروٹوکول کی ان اپ ڈیٹس نے سائنس دانوں کو کروموسومل کمپارٹمنٹ اور ٹاپولوجیکل ایسوسیٹنگ ڈومینز (ٹی اے ڈی) جیسے مزید تفصیلی تشکیلی ڈھانچوں کے ساتھ ساتھ ڈی این اے لوپس جیسی ہائی ریزولوشن تشکیلی خصوصیات کو دیکھنے کی اجازت دی۔ آج تک، ہائی-سی کے مختلف مشتقات پہلے ہی سامنے آ چکے ہیں، جن میں ان سیٹو ہائی-سی، لو ہائی-سی، سیف ہائی-سی، اور مائیکرو-سی شامل ہیں، جن میں معیاری ہائی-سی کے مختلف پہلوؤں سے متعلق مخصوص خصوصیات ہیں، لیکن بنیادی اصول وہی رہا ہے۔ روایتی ہائی-سی سب سے پہلے لیبرمین-ایڈن اور دیگر کے ذریعہ شائع کیا گیا۔ 2009 میں، کلاسیکی ہائی-سی ورک فلو کا خاکہ مندرجہ ذیل ہے: خلیات فارملڈیہائیڈ کے ساتھ کراس لنکڈ ہوتے ہیں ؛ کرومیٹن کو ایک پابندی والے انزائم کے ساتھ ہضم کیا جاتا ہے جو 5 'اوور ہینگ پیدا کرتا ہے ؛ 5' اوور ہینگ بائیوٹینیلیٹڈ اڈوں سے بھرا ہوتا ہے اور اس کے نتیجے میں بلٹ اینڈڈ ڈی این اے کو منسلک کیا جاتا ہے۔ جنکشن پر بائیوٹن کے ساتھ لائیگیشن پروڈکٹس کو سٹریپٹوڈین کے استعمال کے لیے منتخب کیا جاتا ہے اور اس کے بعد ترتیب کی کوششوں کے لیے لائبریری تیار کرنے کے لیے مزید کارروائی کی جاتی ہے۔ جوڑی کے لحاظ سے تعاملات جو ہائی-سی جینوم میں حاصل کر سکتا ہے وہ بہت زیادہ ہیں اور اس لیے یہ ضروری ہے کہ ایک مناسب طور پر بڑے نمونے کے سائز کا تجزیہ کیا جائے، تاکہ منفرد تعاملات کو پکڑا جا سکے جو صرف عام آبادی کی ایک اقلیت میں مشاہدہ کیے جا سکیں۔ لائیگیشن پروڈکٹس کی ایک اعلی پیچیدگی لائبریری حاصل کرنے کے لیے جو اعداد و شمار کی اعلی ریزولوشن اور گہرائی کو یقینی بنائے گی، ہائی-سی کے لیے ان پٹ کے طور پر 20-25 ملین خلیوں کا نمونہ درکار ہے۔ بنیادی انسانی نمونے، جو صرف کم خلیوں کی تعداد میں دستیاب ہو سکتے ہیں، کو معیاری ہائی-سی لائبریری کی تیاری کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جس میں 1 سے 5 ملین خلیات ہوں۔ تاہم، خلیوں کے اتنے کم ان پٹ کا استعمال لائبریری کی کم پیچیدگی سے منسلک ہو سکتا ہے جس کے نتیجے میں لائبریری کی تیاری کے دوران ڈپلیکیٹ ریڈز کا زیادہ فیصد ہوتا ہے۔ معیاری ہائی-سی 1 سے 10 ایم بی کے ریزولوشن پر جوڑی وار تعاملات پر ڈیٹا دیتا ہے، اعلی ترتیب کی گہرائی کی ضرورت ہوتی ہے اور پروٹوکول کو مکمل ہونے میں تقریبا 7 دن لگتے ہیں۔ فارملڈیہائیڈ کراس لنکنگ سیل اور نیوکلیئر جھلی فارملڈیہائیڈ کے لیے انتہائی پارगम्य ہیں۔ فارملڈیہائیڈ کراس لنکنگ کو اکثر ڈی این اے-پروٹین اور پروٹین-پروٹین تعاملات کا پتہ لگانے اور مقدار کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ ہائی-سی، اور تمام 3 سی پر مبنی طریقوں کے تناظر میں دلچسپی کا باعث، کرومیٹن کے دور دراز حصوں کے درمیان سی آئی ایس کروموسومل تعاملات کو پکڑنے کے لیے فارملڈیہائیڈ کی صلاحیت ہے۔ یہ مقامی طور پر ملحقہ کرومیٹن حصوں کے درمیان کوولینٹ لنکس بنا کر ایسا کرتا ہے۔ فارملڈیہائیڈ میکرو مالیکیولز کے ساتھ دو مراحل میں رد عمل ظاہر کر سکتا ہے: مثال کے طور پر یہ ڈی این اے بیس پر ایک نیوکلیوفیلک گروپ کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے، اور ایک میتھائلول ایڈکٹ بناتا ہے، جسے پھر شیف بیس میں تبدیل کر دیا جاتا ہے۔ دوسرے مرحلے میں، شیف بیس، جو تیزی سے سڑ سکتا ہے، دوسرے مالیکیول پر ایک دوسرے فعال گروپ کے ساتھ ایک میتھلین پل بناتا ہے۔ یہ اس میتھلین پل کو گلائسین جیسے محلول میں ایک چھوٹے مالیکیول کے ساتھ بھی بنا سکتا ہے، جو ہائی-سی میں فارملڈیہائیڈ کو بجھانے کے لیے زیادہ استعمال ہوتا ہے۔ بجھانے والے عام طور پر خلیے کے باہر سے فارملڈیہائیڈ پر اثر ڈال سکتے ہیں۔ اس دو مراحل والے فارملڈیہائیڈ کراس لنکنگ رد عمل کی ایک اہم خصوصیت یہ ہے کہ تمام رد عمل قابل واپسی ہوتے ہیں، جو کرومیٹن کی گرفت کے لیے اہم ہے۔ کراس لنکنگ کرومیٹن کیپچر ورک فلو کا ایک اہم قدم ہے کیونکہ تکنیک کا فنکشنل ریڈ آؤٹ وہ تعدد ہے جس پر دو جینومک علاقے ایک دوسرے سے جڑے ہوتے ہیں۔ اس طرح، اس مرحلے کی معیاری کاری اہم ہے اور اس کے لیے، کسی کو تغیر کے ممکنہ ذرائع پر غور کرنا چاہیے۔ کلچر میڈیا میں سیرم کی موجودگی، جس میں پروٹین کی زیادہ مقدار ہوتی ہے، کلچر میڈیا میں کرومیٹن کراس لنکنگ کے لیے دستیاب فارملڈیہائیڈ کو الگ کرکے اس کے موثر ارتکاز کو کم کر سکتی ہے۔ لہذا، ایسے معاملات میں جہاں کلچر میں سیرم کا استعمال کیا جاتا ہے، اسے کراس لنکنگ مرحلے کے لیے ہٹا دیا جانا چاہیے۔ خلیوں کی نوعیت، یعنی، چاہے وہ معطل ہوں یا مستقل، کراس لنکنگ مرحلے کے لیے بھی ایک مناسب غور ہے۔ مستقل خلیے سائٹوسکیلیٹن کے مالیکیولر میکانزم کی مدد سے سطحوں سے جڑے رہتے ہیں۔ یہ دکھایا گیا ہے کہ سائٹوسکیلیٹن کے زیر انتظام جوہری اور سیلولر مورفولوجی کے درمیان ایک تعلق ہے جسے اگر تبدیل کیا جائے تو عالمی جوہری تنظیم پر منفی اثر پڑ سکتا ہے۔ اس لیے مستقل خلیوں کو ان کی کلچر سطح سے منسلک رہتے ہوئے کراس لنک کیا جانا چاہیے۔ لائسیس، پابندی ڈائجسٹ اور بائیوٹینیلیشن خلیوں کو برف پر سوڈیم کلورائڈ پر مشتمل کولڈ ہائپوٹونک بفر کے ساتھ، پی ایچ 8 پر ٹرس-ایچ سی ایل، اور غیر آئنک ڈٹرجنٹ آئی جی ای پی اے ایل سی اے-630، پروٹیز انفیکٹرز کے ساتھ ضمیمہ کیا جاتا ہے۔ پروٹیز انفیکٹرز اور برف پر انکیوبیشن اینڈوجینس پروٹیز سے کراس لنکڈ کرومیٹن کمپلیکس کی سالمیت کو برقرار رکھنے میں مدد کرتے ہیں۔ لائسیس مرحلہ خلیوں سے نیوکلک مواد کو چھوڑنے میں مدد کرتا ہے۔ سیل لائسیس کے بعد، کرومیٹن کو پتلا ایس ڈی ایس کے ساتھ گھلنشیل کیا جاتا ہے تاکہ ان پروٹینوں کو ہٹایا جا سکے جو کراس لنک نہیں ہوئے ہیں اور کرومیٹن کو کھولا جا سکے اور اسے بعد میں پابندی والے اینڈو نیوکلیز-ثالثی ہاضمے کے لیے زیادہ قابل رسائی بنایا جا سکے۔ اگر ایس ڈی ایس کے ساتھ انکیوبیشن تجویز کردہ 10 منٹ سے زیادہ ہے، تو فارملڈیہائیڈ کراس لنکس کو الٹا کیا جا سکتا ہے اور اس لیے ایس ڈی ایس کے ساتھ انکیوبیشن کے فورا بعد برف پر انکیوبیشن ہونا چاہیے۔ ٹریٹن ایکس-100 نامی ایک غیر آئنک ڈٹرجنٹ ایس ڈی ایس کو بجھانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے تاکہ اگلے مرحلے میں انزائم کی انحطاط کو روکا جا سکے۔ کوئی بھی پابندی والا انزائم جو 5 'اوور ہینگ پیدا کرتا ہے، جیسے کہ ہند III کو اب قابل رسائی کرومیٹن کو راتوں رات ہضم کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ 5 'اوور ہینگ کرومیٹن کے ہضم شدہ سروں پر بائیوٹینیلیٹڈ سی ٹی پی یا اے ٹی پی شامل کرنے کے لیے ڈی این اے پولیمیرس I کے کلینو ٹکڑے کے لیے درکار ٹیمپلیٹ فراہم کرتا ہے۔ یہ مرحلہ لائبریری کی تیاری کے لیے ہائی-سی لائیگیشن پروڈکٹس کے انتخاب کی اجازت دیتا ہے۔ قربت لگاؤ ڈی این اے کے ٹکڑوں پر ایک ڈائلیوشن لگاؤ کیا جاتا ہے جو اب بھی ایک دوسرے سے جڑے ہوئے ہیں تاکہ مختلف کمپلیکس میں ٹکڑوں کے درمیان لگاؤ کے واقعات کے بجائے ایک ہی کرومیٹن کمپلیکس کے اندر ٹکڑوں کے انٹرا مالیکیولر لگاؤ کو ترجیح دی جا سکے۔ چونکہ یہ لائیگیشن مرحلہ دھندلے سرے والے ڈی این اے کے ٹکڑوں کے درمیان ہوتا ہے (چونکہ چپچپا سرے بائیوٹن لیبل والے اڈوں سے بھرے ہوئے ہیں)، اس رد عمل کو اس کی موروثی نااہلی کو پورا کرنے کے لیے 4 گھنٹے تک جاری رہنے دیا جاتا ہے۔ قربت کے تعلق کے نتیجے میں، ٹرمینل ہند III سائٹس ختم ہو جاتی ہیں اور ایک این ایچ ای آئی سائٹ پیدا ہوتی ہے۔ بائیوٹن ہٹانا، ڈی این اے کاٹنے، سائز کا انتخاب اور آخری مرمت بائیوٹن لیبل والے لائیگیشن مصنوعات کو فینول-کلوروفارم ڈی این اے نکالنے کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا جا سکتا ہے۔ بائیوٹن لیبل والے سروں والے کسی بھی ٹکڑے کو ہٹانے کے لیے جو منسلک نہیں کیے گئے ہیں، اس طرح کے ٹکڑوں کے سروں سے نیوکلیوٹائڈز کو ہٹانے کے لیے 3 'سے 5' ایکسونیوکلیز سرگرمی کے ساتھ T4 DNA پولیمیرس کا استعمال کیا جاتا ہے۔ یہ مرحلہ اس بات کو یقینی بناتا ہے کہ لائبریری کی تیاری کے لیے ان غیر محدود ٹکڑوں میں سے کسی کا انتخاب نہ کیا جائے۔ ای ڈی ٹی اے کے ساتھ رد عمل کو روک دیا جاتا ہے اور فینول-کلوروفارم ڈی این اے نکالنے کا استعمال کرتے ہوئے ڈی این اے کو ایک بار پھر صاف کیا جاتا ہے۔ سیکوینسنگ لائبریری کے لیے ڈی این اے کے ٹکڑوں کا مثالی سائز اس سیکوینسنگ پلیٹ فارم پر منحصر ہے جو استعمال کیا جائے گا۔ ڈی این اے کو پہلے سونکیشن کا استعمال کرتے ہوئے 300-500 بی پی کے ارد گرد کے ٹکڑوں میں کاٹا جا سکتا ہے۔ اس سائز کے ٹکڑے ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے لیے موزوں ہیں۔ سونکیشن کے بعد، ٹکڑوں کو بیک مین کولٹر سے اے ایم پیور ایکس پی موتیوں کا استعمال کرتے ہوئے سائز کا انتخاب کیا جا سکتا ہے تاکہ 150 اور 300 بی پی کے درمیان سائز کی تقسیم کے ساتھ لائیگیشن مصنوعات حاصل کی جا سکیں۔ یہ ہائیسیک کلسٹر کی تشکیل کے لیے ٹکڑے کے سائز کی بہترین ونڈو ہے۔ ڈی این اے شیئرنگ غیر متناسب ڈی این اے ٹوٹنے کا سبب بنتی ہے اور بائیوٹن پل ڈاؤن اور سیکوینسنگ اڈاپٹر لائیگیشن سے پہلے اس کی مرمت کی جانی چاہیے۔ یہ انزائموں کے امتزاج کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا جاتا ہے جو 5 'اوور ہینگز میں بھرتے ہیں، اور 5' فاسفیٹ گروپس اور اڈینائیلیٹ کو ٹکڑوں کے 3 'سروں پر شامل کرتے ہیں تاکہ سیکوینسنگ اڈاپٹرز کو منسلک کرنے کی اجازت دی جا سکے۔ سٹریپٹاڈین موتیوں کی زیادتی کا استعمال کرتے ہوئے، جیسے کہ ڈائنابیڈز سے مای ون سی 1 سٹریپٹا ویڈن موتیوں کا محلول، بائیوٹینیلیٹڈ ہائی سی لائیگیشن مصنوعات کو نیچے کھینچا اور افزودہ کیا جا سکتا ہے۔ الومینا پیئرڈ اینڈ اڈاپٹرز کی لائیگیشن کی جاتی ہے جب کہ ڈی این اے کے ٹکڑے سٹریپٹوڈین موتیوں سے جڑے ہوتے ہیں۔ موتیوں کو جذب کرنے سے ان دھندلے سرے والے ڈی این اے کے ٹکڑوں کو اڈاپٹرز سے منسلک کرنے کی کارکردگی میں اضافہ ہوتا ہے، کیونکہ اس سے ان کی نقل و حرکت میں کمی آتی ہے۔ لائبریری کی تیاری اور ترتیب اڈاپٹرز کی لائیگیشن مکمل ہونے کے بعد لائبریری کی پی سی آر امپلیفیکیشن کی جاتی ہے۔ پی سی آر مرحلہ زیادہ وسعت کے نتیجے میں کم پیچیدگی والے ہائی-سی لائیگیشن پروڈکٹ کے نمونے میں زیادہ تعداد میں نقلیں متعارف کرا سکتا ہے۔ اس کے نتیجے میں بہت کم تعاملات پکڑے جاتے ہیں اور اکثر، اس کی وجہ یہ ہے کہ ان پٹ نمونے کے سائز میں خلیوں کی مقدار کم ہوتی ہے۔ ترتیب کے لیے کم از کم 50 این جی ہائی-سی لائبریری ڈی این اے حاصل کرنے کے لیے درکار چکروں کی تعداد کو ٹائٹریٹ کرنا ضروری ہے۔ سائیکل نمبر جتنا کم ہوگا، اتنا ہی بہتر ہوگا کہ پی سی آر کے نمونے (جیسے آف ٹارگیٹ ایمپلیکنز، غیر مخصوصیت وغیرہ) نہ ہوں۔ پی سی آر چکروں کی مثالی حد 9-15 ہے اور ترتیب کے لیے کافی ڈی این اے حاصل کرنے کے لیے متعدد پی سی آر رد عمل کو جمع کرنا ایک پی سی آر رد عمل کے لیے چکروں کی تعداد بڑھانے سے زیادہ مثالی ہے۔ پی سی آر مصنوعات کو پرائمر ڈائمرز کو ہٹانے کے لیے اے ایم پیئر موتیوں کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ صاف کیا جاتا ہے اور پھر ترتیب دینے سے پہلے ان کی مقدار مقرر کی جاتی ہے۔ کرومیٹن کے وہ علاقے جو ایک دوسرے کے ساتھ تعامل کرتے ہیں ان کی شناخت بائیوٹینیلیٹڈ، لیگٹیڈ مصنوعات کی جوڑی کے آخر میں ترتیب کے ذریعے کی جاتی ہے۔ کوئی بھی پلیٹ فارم جو جڑے ہوئے ٹکڑوں کو این ایچ ای آئی جنکشن (روچے 454) کے پار ترتیب دینے کی اجازت دے سکتا ہے یا پیئرڈ اینڈ یا میٹ پیئرڈ ریڈز (الومینا جی اے اور ہائیسیک پلیٹ فارم) کے ذریعے ہائی-سی کے لیے موزوں ہوگا۔ ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ سے پہلے، لائبریری کے معیار کی تصدیق سینگر سیکوینسنگ کا استعمال کرتے ہوئے کی جانی چاہیے، جس میں طویل سیکوینسنگ ریڈ بائیوٹن جنکشن کے ذریعے پڑھے گی۔ چھتیس یا 50 بی پی ریڈز الومینا پیئرڈ اینڈ سیکوینسنگ کا استعمال کرتے ہوئے زیادہ تر کرومیٹن انٹرایکٹنگ جوڑوں کی شناخت کے لیے کافی ہیں۔ چونکہ لائبریری میں ٹکڑوں کا اوسط سائز 250 بی پی ہے، اس لیے 50 بی پی پیئرڈ اینڈ ریڈز کو ہائی-سی لائبریری سیکوینسنگ کے لیے بہترین پایا گیا ہے۔ ہائی-سی لائبریریوں کا کوالٹی کنٹرول ہائی-سی نمونے کی تیاری کے پورے ورک فلو میں کئی دباؤ کے نکات ہیں جو اچھی طرح سے دستاویزی اور رپورٹ کیے گئے ہیں۔ مختلف مراحل پر ڈی این اے کو 0.8 ٪ ایگروز جیل پر چلایا جا سکتا ہے تاکہ ٹکڑوں کے سائز کی تقسیم کا جائزہ لیا جا سکے۔ سائز کے انتخاب کے مراحل کو کاٹنے کے بعد یہ خاص طور پر اہم ہے۔ ڈی این اے کی انحطاط کی نگرانی اسمیئر کے طور پر بھی کی جا سکتی ہے جو جیل پر کم سالماتی وزن والی مصنوعات کے تحت ظاہر ہوتے ہیں۔ لیسیس کے دوران کافی پروٹیز انفیکٹرز کو شامل نہ کرنے، اینڈوجینس نیوکلیز سرگرمی یا غلط آئسنگ کی وجہ سے تھرمل انحطاط کی وجہ سے انحطاط ہو سکتا ہے۔ قربت لائیگیشن مصنوعات کی تشکیل کی جانچ کے لیے 3 سی پی سی آر رد عمل انجام دیے جا سکتے ہیں۔ متغیرات معیاری ہائی-سی میں ان پٹ سیل نمبر کی لاگت زیادہ ہوتی ہے، گہری ترتیب کی ضرورت ہوتی ہے، کم ریزولوشن ڈیٹا تیار کرتا ہے، اور بے کار مالیکیولز کی تشکیل سے دوچار ہوتا ہے جو سیل نمبر کم ہونے پر کم پیچیدگی لائبریریوں میں حصہ ڈالتے ہیں۔ ان مسائل سے نمٹنے کے لیے اس تکنیک کو ان سیاق و سباق میں لاگو کرنے کے قابل ہونے کے لیے جہاں خلیوں کی تعداد ایک محدود عنصر ہے، مثال کے طور پر، بنیادی انسانی خلیوں کے کام کے ساتھ، ہائی-سی کے پہلے تصور کے بعد سے کئی ہائی-سی اقسام تیار کی گئی ہیں۔ چار اہم کلاسیں جن کے تحت ہائی-سی متغیرات آتے ہیں وہ ہیں: ڈائلیوشن لائیگیشن، ان سیٹو لائیگیشن، سنگل سیل، اور کم شور میں بہتری کے نظام۔ معیاری ہائی-سی ڈائلیوشن لائیگیشن کی ایک قسم ہے اور دیگر ڈائلیوشن لائیگیشن میں ڈی این ایز ہائی-سی اور کیپچر ہائی-سی شامل ہیں۔ معیاری اور کیپچر ہائی-سی کے برعکس، ڈی این ایز ہائی-سی کو ان پٹ کے طور پر صرف 2 سے 5 ملین خلیوں کی ضرورت ہوتی ہے، کرومیٹن کے ٹکڑے ٹکڑے کرنے کے لیے ڈی این ایز آئی کا استعمال کرتا ہے اور ان جیل ڈائلیوشن پراکسیمیٹی لائیگیشن کا استعمال کرتا ہے۔ ڈی این اے ایس آئی کے استعمال سے ہائی-سی کی کارکردگی اور ریزولوشن میں بہت بہتری آئی ہے۔ کیپچر ہائی-سی ایک جینوم وسیع جانچ کی تکنیک ہے جو مخصوص لوکی کے کرومیٹن تعاملات کو دیکھنے کے لیے ھدف شدہ جینومک علاقوں کی ہائبرڈائزیشن پر مبنی گرفتاری کا استعمال کرتی ہے۔ اسے سب سے پہلے مفسود اور دیگر نے تیار کیا تھا۔ بائیوٹینیلیٹڈ آر این اے بیت لائبریری تیار کرکے انسانی خلیوں میں طویل فاصلے تک پروموٹر رابطوں کا نقشہ بنانا جس نے 21,841 پروموٹر علاقوں کو نشانہ بنایا۔ یہ متغیرات، دوسروں کے علاوہ (نیچے بیان کردہ)، معیاری ہائی-سی اور ایڈریس کی بنیادی تکنیک میں ترمیم کی نمائندگی کرتے ہیں اور اصل طریقہ کار کی ایک یا زیادہ حدود کو دور کرتے ہیں۔ سیٹو ہائی-سی میں سب سے پہلے راؤ اور دیگر کے ذریعے بیان کردہ، سیٹو میں ہائی-سی معیاری ہائی-سی کو نیوکلیئر لائیگیشن اسیس کے ساتھ جوڑتا ہے، یعنی قربت لائیگیشن جو برقرار مرکزوں میں انجام دی جاتی ہے۔ پروٹوکول بنیادی ورک فلو آؤٹ لائن کے لحاظ سے معیاری ہائی-سی سے ملتا جلتا ہے لیکن دوسرے طریقوں سے مختلف ہے۔ معیاری ہائی-سی کے لیے درکار مثالی 20 سے 25 ملین کے مقابلے میں سیٹو میں ہائی-سی کو 2 سے 5 ملین خلیوں کی ضرورت ہوتی ہے اور اس میں پروٹوکول کو مکمل کرنے کے لیے صرف 3 دن اور معیاری ہائی-سی کے لیے 7 دن درکار ہوتے ہیں۔ مزید برآں، قربت کا تعلق معیاری ہائی-سی کی طرح حل میں نہیں ہوتا ہے، جس سے بے ترتیب، حیاتیاتی طور پر غیر متعلقہ رابطوں اور لگایشن کی تعدد میں کمی آتی ہے، جیسا کہ قبضہ شدہ بائیوٹینیلیٹڈ ڈی این اے میں مائٹوکونڈریل اور نیوکلیئر ڈی این اے رابطوں کی کم تعدد سے ظاہر ہوتا ہے۔ یہ لیگیشن مرحلے کے لیے نیوکلئی کو برقرار چھوڑ کر حاصل کیا جاتا ہے۔ خلیوں کو اب بھی ایک بفر کے ساتھ بند کیا جاتا ہے جس میں ٹرس-ایچ سی ایل پی ایچ 8 پر ہوتا ہے، سوڈیم کلورائڈ، اور ڈٹرجنٹ آئی جی ای پی اے ایل سی اے 630 لائیگیشن سے پہلے، لیکن سیل لائسیٹ کو یکساں بنانے کے بجائے، سیل نیوکلئی کو سیل جھلی کو خراب کرنے کے لیے ابتدائی لائسیس کے بعد بند کر دیا جاتا ہے۔ قربت کا تعلق مکمل ہونے کے بعد، خلیے کے مرکزوں کو جوہری جھلی کو پار کرنے اور اس کے جوہری مواد کو جاری کرنے کے لیے 68 ڈگری سیلسیس پر کم از کم 1.5 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ معیاری ہائی-سی کے 1 سے 10 ایم بی ریزولوشن اور ڈی این ایز ہائی-سی کے 100 کے بی ریزولوشن کے مقابلے میں جو ریزولوشن ان سیٹو ہائی-سی کے ساتھ حاصل کیا جا سکتا ہے وہ 950 سے 1000 بی پی تک ہو سکتا ہے۔ جبکہ معیاری ہائی-سی پابندی ڈائجسٹ مرحلے کے لیے 6-بی پی کٹر جیسے ہند III کا استعمال کرتا ہے، سیٹو میں ہائی-سی کارکردگی اور ریزولوشن کو بڑھانے کے لیے 4-بی پی کٹر جیسے ایم بی او آئی یا اس کے آئسوشیزومر ڈی پی این آئی آئی (جو سی پی جی میتھیلیشن کے لیے حساس نہیں ہے) کا استعمال کرتا ہے (کیونکہ ایم بی او آئی اور ڈی پی این آئی آئی کے پابندی والے مقامات جینوم میں زیادہ کثرت سے پائے جاتے ہیں)۔ ان سیٹو ہائی-سی کے لیے نقلوں کے درمیان ڈیٹا مستقل اور انتہائی دوبارہ پیش کرنے کے قابل ہے، جس میں بہت کم پس منظر کا شور اور واضح کرومیٹن تعاملات کا مظاہرہ ہوتا ہے۔ تاہم یہ ممکن ہے کہ کچھ قبضہ شدہ تعاملات درست بین سالماتی تعاملات نہ ہوں کیونکہ نیوکلئس پروٹین اور ڈی این اے سے گھنے طور پر بھرا ہوا ہے لہذا برقرار نیوکلئی میں قربت کی لگایشن انجام دینے سے الجھن پیدا کرنے والے تعاملات کو کم کیا جا سکتا ہے جو صرف نیوکلیئر پیکیجنگ کی نوعیت کی وجہ سے بن سکتے ہیں اور سیلولر فنکشنل اثر کے ساتھ اتنے منفرد کروموسومل تعاملات نہیں۔ اس کے لیے راؤ اور دیگر کے بیان کردہ اعداد و شمار کے حل کو حاصل کرنے کے لیے فی نمونہ تقریبا 5 بلین پیئرڈ اینڈ ریڈز کی انتہائی اعلی ترتیب کی گہرائی کی بھی ضرورت ہوتی ہے۔ ان سیٹو ہائی-سی کے تصور کو ڈھالنے والی کئی تکنیکیں موجود ہیں، جن میں سس ہائی-سی، او سی ای اے این-سی اور ان سیٹو کیپچر ہائی-سی شامل ہیں۔ ذیل میں سیٹو ہائی-سی پر مبنی دو سب سے نمایاں تکنیکیں بیان کی گئی ہیں۔ 1. لو-سی لو-سی ایک ان سیٹو ہائی-سی پروٹوکول ہے جو کم سیل نمبروں پر استعمال کے لیے ڈھال لیا گیا ہے، جو خاص طور پر ان سیاق و سباق میں مفید ہے جہاں سیل نمبر ایک محدود ایجنٹ ہے، مثال کے طور پر، بنیادی انسانی سیل کلچر میں۔ یہ طریقہ معمولی تبدیلیوں کا استعمال کرتا ہے، بشمول استعمال شدہ حجم اور ارتکاز اور کچھ تجرباتی اقدامات کا وقت اور ترتیب تاکہ سیل نمبروں سے 1000 خلیوں تک اعلی معیار کی ہائی-سی لائبریریوں کی تخلیق کی اجازت دی جا سکے۔ کم از کم 1000 خلیوں کے ساتھ قابل استعمال اور اعلی ریزولوشن ڈیٹا تیار کرنے کی صلاحیت کے باوجود، ڈیاز اور دیگر۔ پھر بھی اگر ممکن ہو تو کم از کم 1 سے 2 ملین خلیات استعمال کرنے کی سفارش کرتے ہیں، یا اگر کم از کم 500 کے خلیات نہیں۔ لائبریری کے معیار کا سب سے پہلے Illumina MiSeq (2x84 np پیئرڈ اینڈ ریڈز) پلیٹ فارم پر جائزہ لیا گیا اور ایک بار کوالٹی کنٹرول کے معیار (بشمول کم پی سی آر ڈپلیکیٹ) کو پاس کرنے کے بعد لائبریری کو Illumina NextSeq (2x80 bp پیئرڈ اینڈ) پر ترتیب دیا گیا۔ مجموعی طور پر، یہ تکنیک ہائی-سی کے لیے اعلی سیل نمبر ان پٹ کی ضرورت اور ہائی ریزولوشن ڈیٹا حاصل کرنے کے لیے درکار اعلی ترتیب کی گہرائی کے مسئلے کو روکتی ہے، لیکن صرف 5 کے بی تک کے ریزولوشن حاصل کر سکتی ہے اور متغیر نوعیت کی وجہ سے ہمیشہ دوبارہ پیش نہیں کی جا سکتی ہے۔ استعمال شدہ نمونے کے سائز اور اس سے تیار کردہ ڈیٹا۔ 2. سیف ہائی-سی سیف ہائی-سی، یا آسان، تیز، اور اقتصادی طور پر موثر ہائی-سی، ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے لیے ایمپلیفیکیشن کے بغیر کافی لگٹیڈ ٹکڑے پیدا کرتا ہے۔ سیٹو میں ہائی-سی ڈیٹا جو شائع کیا گیا ہے اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ امپلیفکیشن (لائبریری کی تیاری کے لیے پی سی آر مرحلے پر) فاصلے پر منحصر امپلیفکیشن بائیس متعارف کراتا ہے، جس کے نتیجے میں جینومک فاصلے کے مقابلے میں شور اور سگنل کا تناسب زیادہ ہوتا ہے۔ سیف ہائی-سی کو 250 ہزار کے 562 خلیوں سے ایمپلیفیکیشن فری، ان سیٹو ہائی-سی لائیگیشن لائبریری بنانے کے لیے کامیابی سے استعمال کیا گیا۔ لگاون کے ٹکڑے 200 اور 500 بی پی کے درمیان لمبے ہوتے ہیں، جن کی اوسط تقریبا 370 بی پی ہوتی ہے۔ تمام لائیگیشن پروڈکٹ لائبریریوں کو الومینا ہائیسیک پلیٹ فارم (2x150 بی پی پیئرڈ اینڈ ریڈز) کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا گیا تھا۔ اگرچہ سیف ہائی-سی کو 250 ہزار سے کم سیل ان پٹ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، نیو اور دیگر۔ 1 سے 2 ملین خلیات استعمال کرنے کی سفارش کریں۔ نمونے ایک لین کے ایک چوتھائی حصے پر ترتیب دینے کے لیے کافی لیگٹس تیار کرتے ہیں۔ پی سی آر ڈپلیکیٹس کو ہٹانے کی وجہ سے لائبریری کی پیچیدگی کو بڑھانے کے لیے سیف ہائی-سی کا مظاہرہ کیا گیا ہے جو منفرد جوڑے والے ریڈز کے مجموعی فیصد کو کم کرتا ہے۔ مجموعی طور پر، سیف ہائی-سی کروموسومل تعاملات کی سالمیت کو برقرار رکھتا ہے جبکہ اعلی ترتیب کی گہرائی کی ضرورت کو بھی کم کرتا ہے اور مجموعی لاگت اور محنت کو بچاتا ہے۔ مائیکرو-سی مائیکرو-سی ہائی-سی کا ایک ورژن ہے جس میں نیوکلیوسومز کے جوڑوں کے درمیان تعاملات کو دیکھنے کے لیے ایک مائیکروکوکل نیوکلیز (ایم این اے ایس) ہاضمہ مرحلہ شامل ہے، اس طرح 1 سے 100 نیوکلیوسوم پیمانے پر ذیلی جینومک ٹی اے ڈی ڈھانچوں کے حل کو قابل بناتا ہے۔ یہ سب سے پہلے خمیر میں استعمال کے لیے تیار کیا گیا تھا اور اسے ایک معیاری ہائی-سی سے حاصل کردہ ساختی ڈیٹا کو محفوظ رکھنے کے لیے دکھایا گیا تھا لیکن زیادہ سگنل سے شور کے تناسب کے ساتھ۔ جب انسانی جنین اسٹیم سیلز اور فائبربلاسٹ کے ساتھ استعمال کیا جاتا ہے، تو فی نمونہ 2.6 سے 4.5 بلین منفرد نقشہ شدہ ریڈز حاصل کیے گئے تھے۔ Hsieh et al. ماؤس کے جنین اسٹیم خلیوں سے 2.64 بلین ریڈز کا تجزیہ کیا گیا اور یہ ظاہر کیا گیا کہ مختصر فاصلے کے تعاملات کا پتہ لگانے کے لیے طاقت میں اضافہ ہوا ہے۔ سنگل سیل ہائی-سی کو بھی سنگل سیل کے ساتھ استعمال کے لیے ڈھال لیا گیا ہے لیکن ان تکنیکوں کو انجام دینے کے لیے اعلی سطح کی مہارت کی ضرورت ہوتی ہے اور یہ کم ڈیٹا کوالٹی، کوریج اور ریزولوشن جیسے مسائل سے دوچار ہیں۔ ڈیٹا تجزیہ ہائی-سی کے ذریعہ تیار کردہ چیمیرک ڈی این اے لائیگیشن پروڈکٹ نیوکلئس کے اندر جوڑی کے لحاظ سے کرومیٹن کے تعاملات یا جسمانی 3 ڈی رابطوں کی نمائندگی کرتے ہیں، اور مختلف قسم کے نیچے کی طرف کے طریقوں سے تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ مختصر طور پر، گہری ترتیب کے اعداد و شمار کا استعمال غیر جانبدار جینوم وسیع کرومیٹن تعامل نقشے بنانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ پھر کروموسومل ساختی نمونوں اور ان کی حیاتیاتی تشریحات کی شناخت کے لیے ان نقشوں کا تجزیہ کرنے کے لیے کئی مختلف طریقے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ ان میں سے بہت سے ڈیٹا تجزیہ کے نقطہ نظر 3C ترتیب یا دیگر مساوی ڈیٹا پر بھی لاگو ہوتے ہیں۔ ڈیپ سیکوینسنگ کے ذریعے تیار کردہ ریڈ میپنگ ہائی-سی ڈیٹا روایتی ایف اے ایس ٹی کیو فائل کی شکل میں ہے، اور ریڈز کو سیکوینس الائنمنٹ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے دلچسپی کے جینوم سے منسلک کیا جا سکتا ہے (جیسے۔ بوٹی، بی ڈبلیو اے، وغیرہ)۔ کیونکہ ہائی-سی لائیگیشن مصنوعات سینکڑوں میگا بیسز پر محیط ہو سکتی ہیں اور مختلف کروموسوم پر لوکی کو پل کر سکتی ہیں، ہائی-سی ریڈ الائنمنٹ اکثر اس معنی میں چیمیرک ہوتی ہے کہ ریڈ کے مختلف حصوں کو لوکی سے دور، ممکنہ طور پر مختلف سمتوں میں منسلک کیا جا سکتا ہے۔ طویل پڑھنے والے صف بندی (مثال کے طور پر۔ منی میپ 2) اکثر چیمیرک صف بندی کی حمایت کرتا ہے اور براہ راست طویل پڑھنے والے ہائی-سی ڈیٹا پر لاگو کیا جا سکتا ہے۔ مختصر پڑھنے والی ہائی-سی صف بندی زیادہ مشکل ہے۔ خاص طور پر، ہائی-سی مختلف سائز کے لائیگیشن جنکشن پیدا کرتا ہے، لیکن لائیگیشن سائٹ کی صحیح پوزیشن کی پیمائش نہیں کی جاتی ہے۔ اس مسئلے کو روکنے کے لیے، ریڈز کو دو حصوں میں تقسیم کرنے اور تعامل کے جوڑوں کی شناخت کے لیے ان کی الگ سے نقشہ سازی کرنے سے پہلے جنکشن سائٹ کی تلاش سے بچنے کے لیے تکراری نقشہ سازی کا استعمال کیا جاتا ہے۔ تکراری نقشہ سازی کے پیچھے خیال یہ ہے کہ جنکشن سائٹ تک پہنچنے سے پہلے تعامل کے جوڑوں کی منفرد شناخت کو یقینی بنانے کے لیے ہر ممکن حد تک مختصر ترتیب کا نقشہ بنانا ہے۔ نتیجے کے طور پر، 5 'سرے سے شروع ہونے والے 25-بی پی لمبے ریڈز کو پہلے جینوم میں نقشہ بنایا جاتا ہے، اور وہ ریڈز جو منفرد طور پر کسی ایک لوکی کا نقشہ نہیں بناتے ہیں انہیں اضافی 5 بی پی تک بڑھایا جاتا ہے اور پھر دوبارہ نقشہ بنایا جاتا ہے۔ یہ عمل اس وقت تک دہرایا جاتا ہے جب تک کہ سب منفرد نقشے کو نہیں پڑھتے، یا جب تک کہ ریڈز کو مکمل طور پر بڑھایا نہ جائے۔ صرف پیئرڈ اینڈ ریڈز رکھے جاتے ہیں جن میں ہر طرف منفرد طور پر ایک جینومک لوکی پر نقشہ بنایا جاتا ہے۔ دیگر تمام جوڑے والے اختتامی ریڈز کو خارج کر دیا جاتا ہے۔ پڑھنے کی نقشہ سازی کی تکنیکوں کے کئی تغیرات کو بہت سی بائیو انفارمیٹکس پائپ لائنوں میں نافذ کیا جاتا ہے، جیسے کہ ICE، HiC-Pro، HIPPIE، HiCUP، اور TADbit، جوڑے کے سرے کے دو حصوں کو الگ سے پڑھنے کے لیے، اس صورت میں جب دونوں حصے الگ الگ جینومک پوزیشنوں سے ملتے ہیں، اس طرح اس چیلنج سے نمٹا جاتا ہے جہاں ریڈز لائیگیشن جنکشنوں میں پھیلے ہوتے ہیں۔ پڑھنے کی لمبائی میں اضافے کے ساتھ، حالیہ پائپ لائنز (جیسے۔ جوسر اور 4 ڈی-نیوکلیوسوم ڈیٹا پورٹل) اکثر مختصر ہائی-سی ریڈز کو ایک صف بندی الگورتھم کے ساتھ صف بندی کرتے ہیں جو چیمیرک صف بندی کے قابل ہوتا ہے، جیسے کہ بی ڈبلیو اے-میم، کرومیپ اور ڈریگ میپ۔ یہ طریقہ کار صف بندی کو ایک بار کال کرتا ہے اور تکراری نقشہ سازی سے آسان ہے۔ ٹکڑے کی تفویض اور فلٹرنگ نقشہ شدہ ریڈز کے بعد ہر ایک کو جینوم میں اس کی 5 'نقشہ شدہ پوزیشن کے مطابق ایک واحد جینومک صف بندی کا مقام تفویض کیا جاتا ہے۔ ہر پڑھنے والے جوڑے کے لیے، پابندی کے ٹکڑوں میں سے صرف ایک کو ایک مقام تفویض کیا جاتا ہے، اس طرح اسے پابندی والے مقام کے قریب اور زیادہ سے زیادہ مالیکیول کی لمبائی سے کم ہونا چاہیے۔ قریب ترین پابندی والے مقامات سے زیادہ سے زیادہ انو کی لمبائی سے زیادہ نقشہ شدہ ریڈز کرومیٹن یا غیر کینونکل نیوکلیز سرگرمیوں کے جسمانی ٹوٹنے کے نتائج ہیں۔ چونکہ یہ ریڈز کرومیٹن کے تعاملات کے بارے میں معلومات کو بھی ہدایت دیتے ہیں، انہیں ضائع نہیں کیا جاتا ہے، لیکن ڈیٹا سیٹ میں تکنیکی شور کو دور کرنے کے لیے جینومک مقامات تفویض کرنے کے بعد مناسب فلٹرنگ ہونی چاہیے۔ اس بات پر منحصر ہے کہ آیا پڑھنے والا جوڑا ایک ہی یا مختلف پابندی کے ٹکڑوں میں آتا ہے، فلٹرنگ کے مختلف معیارات لاگو ہوتے ہیں۔ اگر جوڑا اسی پابندی کے ٹکڑے پر نقشہ پڑھتا ہے، تو وہ ممکنہ طور پر غیر منسلک لٹکنے والے سروں یا سرکلرائزڈ ٹکڑوں کی نمائندگی کرتے ہیں جو غیر معلوماتی ہیں، اور اس وجہ سے ڈیٹا سیٹ سے ہٹا دیے جاتے ہیں۔ یہ ریڈز پی سی آر نمونوں، غیر ہضم شدہ کرومیٹن کے ٹکڑوں کی نمائندگی بھی کر سکتے ہیں، یا صرف کم صف بندی کے معیار کے ساتھ پڑھ سکتے ہیں۔ ان کی اصل جو بھی ہو، ایک ہی ٹکڑے سے نقشہ شدہ ریڈز کو "جعلی اشارے" سمجھا جاتا ہے اور عام طور پر نیچے کی طرف پروسیسنگ سے پہلے خارج کر دیا جاتا ہے۔ باقی جوڑے والے ریڈز کو مختلف پابندی کے ٹکڑوں پر نقشہ بند کیا جاتا ہے تاکہ یکساں/بے کار پی سی آر مصنوعات کو خارج کیا جا سکے، اور یہ اسی ترتیب یا 5 'صف بندی کی پوزیشنوں کو شیئر کرنے والے ریڈز کو ہٹا کر حاصل کیا جاتا ہے۔ تجرباتی مقصد کو پورا کرنے کے لیے فلٹرنگ کی اضافی سطحوں کا بھی اطلاق کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، ممکنہ غیر ہضم شدہ پابندی والے مقامات کو غیر فعال طور پر شناخت کرنے کے بجائے، درمیان میں ایک چھوٹے سے فاصلے (صارف سے متعین، تجربے پر مبنی) کے ساتھ ایک ہی کروموسومل اسٹرینڈ پر نقشہ بند ریڈز کو ہٹا کر، خاص طور پر فلٹر کیا جا سکتا ہے۔ بائننگ اور بن لیول فلٹرنگ ان کے مڈ پوائنٹ کوآرڈینیٹس کی بنیاد پر، ہائی-سی پابندی کے ٹکڑوں کو مقررہ جینومک وقفوں میں بائن کیا جاتا ہے، جس میں بن کے سائز 40 کے بی سے 1 ایم بی تک ہوتے ہیں۔ اس نقطہ نظر کے پیچھے استدلال یہ ہے کہ اعداد و شمار کی پیچیدگی کو کم کرنے اور فی بن امیدوار جینوم وسیع تعاملات کی تعداد کو کم کرنے سے، جینومک ڈبے زیادہ مضبوط اور کم شور والے اشاروں کی تعمیر کی اجازت دیتے ہیں، رابطے کی تعدد کی شکل میں، ریزولوشن کی قیمت پر (حالانکہ پابندی کے ٹکڑے کی لمبائی اب بھی ہائی-سی ریزولوشن کی حتمی جسمانی حد ہے)۔ بن سے بن تعاملات کو محض رقم لے کر جمع کیا جاتا ہے، حالانکہ سگنل کو مزید بڑھانے کے لیے برسوں کے دوران زیادہ مرکوز اور معلوماتی طریقے بھی تیار کیے گئے ہیں۔ ایسا ہی ایک طریقہ راؤ اور دیگر نے بیان کیا ہے۔ اس کا مقصد ڈبے کے سائز کی حد کو چھوٹے اور چھوٹے ڈبوں تک پہنچانا ہے، بالآخر 80 ٪ سے زیادہ ڈبوں کو 1000 ریڈز سے ڈھکنا ہے، جس سے حتمی تجزیہ کے نتائج کے ریزولوشن میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ بن سطح کی فلٹرنگ، ٹکڑے کی سطح کی فلٹنگ کی طرح، حاصل کردہ ڈیٹا سے تجرباتی نمونوں کو بہانے کے لیے بھی ہوتی ہے۔ زیادہ شور اور کم اشاروں والے ڈبے کو ہٹا دیا جاتا ہے کیونکہ وہ عام طور پر ٹیلومیرس اور سینٹرومیرس کے ارد گرد انتہائی تکراری جینومک مواد کی نمائندگی کرتے ہیں۔ یہ انفرادی ڈبے کی رقم کا موازنہ تمام ڈبوں کے مجموعے سے کرکے اور نیچے کے 1 فیصد ڈبوں کو ہٹا کر، یا شور کی پیمائش کے طور پر تغیر کو استعمال کرکے کیا جاتا ہے۔ کم کوریج والے ڈبے، یا ڈبے لاگ نارمل ڈسٹری بیوشن کے مرکز سے نیچے تین معیاری انحراف (جو فی جینومک ڈبے میں رابطوں کی کل تعداد کے مطابق ہوتے ہیں)، کو ایم اے ڈی میکس (زیادہ سے زیادہ اجازت شدہ میڈین مطلق انحراف) فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے ہٹا دیا جاتا ہے۔ بائننگ کے بعد، ہائی-سی ڈیٹا کو سمیٹریکل میٹرکس فارمیٹ میں محفوظ کیا جائے گا۔ حال ہی میں، مختلف ہائی-سی تجربات کے لیے بہترین ڈبے کے سائز کا پہلے سے تعین کرنے کے لیے بہت سے طریقے تجویز کیے گئے ہیں۔ لی اور دیگر۔ 2018 میں ڈی ڈاک کو بیان کیا گیا، ایک ایسا طریقہ جہاں بن سائز کو اس کے طور پر منتخب کیا جاتا ہے جس پر ہائی-سی میٹرکس کی ساختی اینٹروپی مستحکم کم از کم تک پہنچ جاتی ہے۔ دوسری طرف کواسار قدرے زیادہ معیار کی تشخیص پیش کرتا ہے، اور زیادہ سے زیادہ قابل استعمال حل تلاش کرنے کے لیے نمونوں کے نقل اسکور کا موازنہ کرتا ہے (یہ دیکھتے ہوئے کہ نقل واقعی تجرباتی مقصد کے لیے شامل ہیں)۔ کچھ اشاعتوں نے سنگل فریگمنٹ کی سطح پر تعامل کی تعدد کو اسکور کرنے کی بھی کوشش کی، جہاں کم تعداد میں ریڈز کے ساتھ بھی زیادہ کوریج حاصل کی جا سکتی ہے۔ ہائی سی پلس، ایک ٹول ہے جسے ژانگ اور دیگر نے تیار کیا ہے۔ 2018 میں، اصل ریڈز کے صرف 1/16 کا استعمال کرتے ہوئے اصل سے ملتے جلتے ہی ہائی-سی میٹرکس لگانے کے قابل ہے۔ بیلنسنگ/نارملائزیشن بیلنسنگ سے مراد حاصل کردہ ہائی-سی ڈیٹا کی تعصب کی اصلاح کا عمل ہے، اور یہ واضح یا مضمر ہو سکتا ہے۔ واضح توازن کے طریقوں کے لیے تعصبات کی واضح تعریفوں کی ضرورت ہوتی ہے جو ہائی-سی ریڈز (یا عام طور پر کسی بھی ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ تکنیک) سے وابستہ ہونے کے لیے جانا جاتا ہے جس میں ریڈ میپیبلٹی، جی سی مواد کے ساتھ ساتھ انفرادی ٹکڑے کی لمبائی بھی شامل ہے۔ پہلے ہر ایک سمجھے جانے والے تعصبات کے لیے ایک اصلاحی عنصر کا حساب لگایا جاتا ہے، اس کے بعد ان کے ہر ایک امتزاج کا حساب لگایا جاتا ہے، اور پھر فی جینومک بن پڑھنے کی گنتی پر لاگو کیا جاتا ہے۔ تاہم، کچھ تعصبات نامعلوم اصل سے آ سکتے ہیں، اس صورت میں اس کے بجائے ایک مضمر توازن کا نقطہ نظر استعمال کیا جاتا ہے۔ مضمر توازن اس مفروضے پر منحصر ہے کہ ہر جینومک لوکس کی "مساوی مرئیت" ہونی چاہیے، جس سے پتہ چلتا ہے کہ ہائی-سی ڈیٹا میں ہر جینومک لوکس پر تعامل سگنل کو ایک ہی کل رقم میں شامل ہونا چاہیے۔ ایک نقطہ نظر جسے تکراری اصلاح کہا جاتا ہے وہ سنکھورن-نوپ بیلنسنگ الگورتھم کا استعمال کرتا ہے اور مذکورہ بالا مفروضے کا استعمال کرتے ہوئے سمیٹریکل میٹرکس کو متوازن کرنے کی کوشش کرتا ہے (میٹرکس میں ہر ایک قطار اور کالم کے مجموعے کو برابر کرکے)۔ الگورتھم بار بار دو مراحل کے درمیان بدلتا ہے: 1) ہر صف کو اس کے اوسط سے تقسیم کرنا، اور 2) ہر کالم کو اس کے اوسط سے تقسیم کرنا، جو آخر میں یکجا ہونے کی ضمانت دیتے ہیں اور تعامل میٹرکس میں کوئی واضح طور پر اونچی قطاریں یا کالم نہیں چھوڑتے ہیں۔ ہائی-سی ڈیٹا میں موروثی تعصبات کو معمول پر لانے کے لیے دیگر کمپیوٹیشنل طریقے بھی موجود ہیں، جن میں سیکوینشیل کمپونینٹ نارملائزیشن (ایس سی این)، نائٹ-روئز میٹرکس بیلنسنگ اپروچ، اور آئجین ویکٹر ڈکمپزیشن (آئی سی ای) نارملائزیشن شامل ہیں۔ آخر میں، واضح اور مضمر تعصب کی اصلاح کے دونوں طریقے تقابلی نتائج دیتے ہیں۔ تجزیہ اور ڈیٹا کی تشریح ایک ڈبے دار، جینوم وسیع تعامل میٹرکس کے ساتھ، ممالیہ جینوموں میں مشاہدہ کیے جانے والے عام تعامل کے نمونوں کی شناخت اور تشریح حیاتیاتی طور پر کی جا سکتی ہے، جبکہ زیادہ نایاب، کم کثرت سے مشاہدہ کیے جانے والے نمونوں جیسے سرکلر کروموسوم اور سینٹرومیر کلسٹرنگ کی شناخت کے لیے اضافی خصوصی طور پر موزوں طریقوں کی ضرورت پڑ سکتی ہے۔ 1. سی آئی ایس/ٹرانس تعامل کا تناسب سی آئی ایس/ٹرانس تعاملات ہائی-سی نقشوں میں مشاہدہ کیے جانے والے دو مضبوط تعامل کے نمونوں میں سے ایک ہیں۔ وہ لوکس کے لیے مخصوص نہیں ہیں، اور اس طرح انہیں جینوم کی سطح کا نمونہ سمجھا جاتا ہے۔ عام طور پر، ایک ہی کروموسوم (سی آئی ایس میں) پر رہنے والے لوکی کے جوڑوں کے لیے مختلف کروموسوم (ٹرانس میں) پر رہنے والے لوکی کے جوڑوں کے مقابلے، اوسطا، ایک اعلی تعامل تعدد کا مشاہدہ کیا جاتا ہے۔ ہائی-سی تعامل میٹرکس میں، سی آئی ایس/ٹرانس تعاملات مربع بلاکس کے طور پر ظاہر ہوتے ہیں جو ایک اخترن کے ساتھ مرکوز ہوتے ہیں، جو ایک ہی وقت میں انفرادی کروموسوم سے ملتے ہیں۔ چونکہ یہ نمونہ مختلف انواع اور خلیوں کی اقسام میں نسبتا مستقل ہے، اس لیے اسے اعداد و شمار کے معیار کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ بے ترتیب پس منظر کی جکڑن یا کسی نامعلوم عنصر کی وجہ سے ایک شور مچانے والا تجربہ، سی آئی ایس سے ٹرانس تعامل کے تناسب کو کم کرے گا (کیونکہ شور سے سی آئی ایس اور ٹرانس تعاملات دونوں کو اسی حد تک متاثر کرنے کی توقع کی جاتی ہے)، اور اعلی معیار کے تجربات میں عام طور پر انسانی جینوم کے لیے 40 اور 60 کے درمیان سی آئی ایس/ٹرانس تعامل کا تناسب ہوتا ہے۔ 2. فاصلے پر منحصر تعامل تعدد یہ نمونہ جینوم کی سطح پر تعامل تعدد کے فاصلے پر منحصر انحطاط سے مراد ہے، اور دو مضبوط ترین ہائی-سی تعامل نمونوں میں سے دوسرے کی نمائندگی کرتا ہے۔ جیسے جیسے سی آئی ایس-انٹرایکٹنگ لوکی کے درمیان تعامل تعدد میں کمی آتی ہے (ان کے درمیان مزید فاصلے کے نتیجے میں)، تعامل تعدد میں بتدریج کمی کو تعامل میٹرکس میں اخترن سے دور ہوتے ہوئے دیکھا جا سکتا ہے۔ مختلف پولیمر ماڈل اعداد و شمار کے لحاظ سے لوکی جوڑوں کی خصوصیات کو نمایاں کرنے کے لیے موجود ہیں جو ایک مقررہ فاصلے سے الگ ہوتے ہیں، لیکن مجرد بائننگ اور فٹنگ مسلسل افعال ڈیٹا پوائنٹس کے درمیان فاصلے پر منحصر تعامل تعدد کا تجزیہ کرنے کے دو عام طریقے ہیں۔ سب سے پہلے، تعامل تعدد کو ان کے جینومک فاصلے کی بنیاد پر بائن کیا جا سکتا ہے، پھر ہر بن کی اوسط کی معلومات کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا میں ایک مسلسل فنکشن نصب کیا جاتا ہے۔ نتیجے میں ہونے والی ڈیک فنکشن کو لاگ لاگ پلاٹ پر پلاٹ کیا جاتا ہے تاکہ پولیمر ماڈلز کے ذریعہ پیش کردہ پاور لا ڈیکوں کی نمائندگی کے لیے ایک لکیری لائن استعمال کی جا سکے۔ تاہم، اکثر اوقات ایک سادہ پولیمر ماڈل فاصلے پر منحصر تعامل تعدد کی مکمل نمائندگی کرنے کے لیے کافی نہیں ہوگا، جس مقام پر زیادہ پیچیدہ ڈیک افعال کا نتیجہ ہو سکتا ہے، جو ہائی-سی میٹرکس میں مشاہدہ کیے گئے جینوم وسیع نمونوں کے بجائے لوکس مخصوص کی موجودگی کی وجہ سے ڈیٹا کی تولید کو متاثر کر سکتا ہے (جسے پولیمر ماڈل کے ذریعے مدنظر نہیں رکھا جاتا ہے)۔ 3. کرومیٹن کمپارٹمنٹس ہائی-سی نقشوں میں پایا جانے والا سب سے مضبوط لوکس مخصوص پیٹرن کرومیٹن کمپارٹمنٹس ہے، جو انٹرایکشن میٹرکس پر پلیڈ یا "چیکر بورڈ" جیسے پیٹرن کی شکل اختیار کرتا ہے، جس میں متبادل بلاکس ہوتے ہیں جو سائز میں 1 اور 10 ایم بی کے درمیان ہوتے ہیں (جس سے انہیں انسانی جینوم میں بہت کم نمونے لینے والے تجربات میں بھی نکالنا آسان ہوتا ہے)۔ یہ نمونہ اعلی اور کم دونوں تعدد پر پایا جا سکتا ہے۔ چونکہ کروموسوم دو قسم کے جینومک خطوں پر مشتمل ہوتے ہیں جو انفرادی کروموسوم کی لمبائی کے ساتھ بدلتے ہیں، اسی قسم کے دو خطوں کے درمیان تعامل کی تعدد اور مختلف اقسام کے دو خطوں کے درمیان تعامل کی تعدد بالکل مختلف ہو سکتی ہے۔ فعال (اے) اور غیر فعال (بی) کرومیٹن کمپارٹمنٹس کی تعریف بنیادی اجزاء کے تجزیے پر مبنی ہے، جسے سب سے پہلے لیبرمین-ایڈن اور دیگر نے قائم کیا تھا۔ 2009 میں۔ ان کے نقطہ نظر نے مشاہدہ شدہ بمقابلہ متوقع سگنل (فاصلے کے معمول کے رابطے کے میٹرکس سے حاصل کردہ) تناسب کے ہائی-سی میٹرکس کے ارتباط کا حساب لگایا، اور نتیجے میں پلاٹ کے مثبت اور منفی حصوں کو بالترتیب اے اور بی کمپارٹمنٹس کے طور پر ظاہر کرنے کے لیے پہلے آئجین ویکٹر کی علامت کا استعمال کیا۔ بہت سے جینومک مطالعات نے اشارہ کیا ہے کہ کرومیٹن کے حصے کرومیٹن کی حالتوں کے ساتھ مربوط ہیں، جیسے جین کی کثافت، ڈی این اے تک رسائی، جی سی مواد، نقل کا وقت، اور ہسٹون کے نشانات۔ لہذا، ٹائپ اے کمپارٹمنٹس کو زیادہ خاص طور پر یوکرومیٹن کے جین گھنے علاقوں کی نمائندگی کرنے کے لیے بیان کیا گیا ہے، جبکہ ٹائپ بی کمپارٹمنٹس کم جین سرگرمیوں والے ہیٹروکرومیٹک علاقوں کی نمائندگی کرتے ہیں۔ مجموعی طور پر، کرومیٹن کے حصے دلچسپی کے جینوم کے عمومی تنظیمی اصولوں پر بصیرت پیش کرتے ہیں۔ پچھلی دہائی کے دوران کمپارٹمنٹ کالنگ انجام دینے کے قابل زیادہ سے زیادہ بائیو انفارمیٹکس ٹولز تیار کیے گئے ہیں، جن میں ہومر، ہائی ٹی سی آر، اور سی اسکور ٹول شامل ہیں۔ اگرچہ 2009 کے اصل نقطہ نظر پر ان میں سے ہر ایک کے اپنے اختلافات اور اصلاحات ہیں، لیکن ان کے بنیادی پروٹوکول اب بھی بنیادی جزو کے تجزیے پر انحصار کرتے ہیں۔ 4. ٹوپوولوجیکل طور پر منسلک ڈومینز (ٹی اے ڈی) ٹی اے ڈی ذیلی ایم بی ڈھانچے ہیں جو جین ریگولیٹری خصوصیات کو فروغ دے سکتے ہیں، جیسے کہ مقامی پروموٹر-بڑھانے والے تعاملات۔ زیادہ عام طور پر، ٹی اے ڈی کو بنیادی حیاتیاتی میکانزم کی ایک ابھرتی ہوئی خاصیت سمجھا جاتا ہے، جو ٹی اے ڈی کو جینوم کی جامد ساختی خصوصیت کے بجائے لوپ اخراج، کمپارٹمنٹائزیشن، یا کسی بھی متحرک جینومک پیٹرن کے طور پر بیان کرتا ہے۔ اس طرح، ٹی اے ڈی ریگولیٹری مائیکرو ماحولیات کی نمائندگی کرتے ہیں اور عام طور پر ہائی-سی نقشے پر انتہائی خود تعامل والے علاقوں کے بلاکس کے طور پر ظاہر ہوتے ہیں جن میں خطے کے اندر تعامل کی تعدد دو ملحقہ علاقوں کے درمیان تعامل کی تعدد سے نمایاں طور پر زیادہ ہوتی ہے۔ ہائی-سی تعامل میٹرکس میں، ٹی اے ڈی بلند تعامل تعدد کے مربع بلاکس ہوتے ہیں جو اخترن کے ساتھ مرکوز ہوتے ہیں۔ تاہم، یہ محض ایک حد سے زیادہ آسان وضاحت ہے، اور اصل نمونے کی شناخت کے لیے بہت زیادہ شماریاتی پروسیسنگ اور تخمینے کی ضرورت ہوتی ہے۔ ٹی اے ڈی کی شناخت کے لیے ایک نقطہ نظر کو ڈکسن اور دیگر نے بیان کیا، جہاں انہوں نے سب سے پہلے (کچھ جینومک رینج کے اندر) میٹرکس میں ہر بن کے اوسط اوپر کی طرف تعاملات اور اوسط نیچے کی طرف تعاملات کے درمیان فرق کا حساب لگایا۔ اس فرق کو پھر ہڈن مارکوف ماڈل پر مبنی ایک چی مربع شدہ اعداد و شمار میں تبدیل کر دیا گیا، اور اس چی مربع شدہ قدر میں کوئی بھی تیز تبدیلی، جسے ڈائرکشنالیٹی انڈیکس کہا جاتا ہے، ٹی اے ڈی کی حدود کی وضاحت کرے گی۔ متبادل طور پر، کوئی بھی ٹی اے ڈی حدود کی وضاحت کے لیے اوسط اوپر کی طرف اور نیچے کی طرف تعاملات کے درمیان تناسب لے سکتا ہے، جیسا کہ نومووا اور دیگر نے کیا۔ ایک اور طریقہ یہ ہے کہ ہر ڈبے سے گزرنے والی اوسط تعامل تعدد کا حساب لگانا، پھر کچھ پہلے سے طے شدہ جینومک رینج کے اندر۔ نتیجے میں آنے والی قیمت کو موصلیت اسکور کہا جاتا ہے اور اسے میٹرکس (کرین اور دیگر) کے اخترن کے ساتھ سلائڈنگ مربع کی اوسط کے طور پر سوچا جا سکتا ہے۔ یہ قدر ٹی اے ڈی حدود پر کم ہونے کی توقع ہے ؛ اس طرح، کوئی بھی مقامی منیما (حدود) کو تلاش کرنے کے لیے معیاری شماریاتی تکنیکوں کا استعمال کر سکتا ہے، اور مسلسل حدود کے درمیان کے علاقوں کو ٹی اے ڈی قرار دے سکتا ہے۔ تاہم، جیسا کہ آج تیزی سے تسلیم کیا جاتا ہے، ٹی اے ڈی ڈھانچوں کی ایک درجہ بندی کی سیریز کی نمائندگی کرتے ہیں جو پچھلے طریقوں کے ذریعہ دیئے گئے ایک جہتی اسکور سے مکمل طور پر نمایاں نہیں ہوسکتے ہیں۔ نئے ڈیٹا سیٹس میں دستیاب بڑھتی ہوئی ریزولوشن اب واضح طور پر ملٹی اسکیل تجزیہ کے طریقوں کے ساتھ ٹی اے ڈی کو حل کر سکتی ہے۔ جیسا کہ سب سے پہلے ارمیٹس نے متعارف کرایا تھا، ریزولوشن مخصوص ڈومینز کی شناخت کی جا سکتی ہے اور ریزولوشنز میں محفوظ ڈومینز کے ایک متفقہ سیٹ کا حساب لگایا جا سکتا ہے، جو ٹی اے ڈی کالنگ کے مسئلے کو ان کے مقامی تعامل کی کثافت کی بنیاد پر اسکورنگ افعال کی اصلاح میں تبدیل کر دیتا ہے۔ مختلف معروضی افعال کے ساتھ اس نقطہ نظر کے تغیرات، جیسے کہ لاوابرسٹ، مسٹر ٹی اے ڈی فائنڈر، تھری ڈی نیٹ موڈ، اور میٹریوشکا، بھی اعلی ریزولوشن والے ڈیٹا سیٹوں پر بہتر کمپیوٹنگ کارکردگی حاصل کرنے کے لیے تیار کیے گئے ہیں۔ 5. نقطہ تعاملات حیاتیاتی طور پر، ریگولیٹری تعاملات عام طور پر ٹی اے ڈی کے مقابلے میں بہت چھوٹے پیمانے پر ہوتے ہیں، اور دو جینومک عناصر 1 کے بی کے طور پر چھوٹے فاصلے کے اندر جین کے اظہار کو چالو/روک سکتے ہیں۔ لہذا، ہائی-سی نقشوں کی تشریح میں نقطہ تعاملات اہم ہیں، اور توقع کی جاتی ہے کہ رابطے کے امکان میں مقامی افزودگی کے طور پر ظاہر ہوں گے۔ تاہم، نقطہ تعاملات کی شناخت کے لیے موجودہ طریقہ کار فطرت میں مضمر ہیں، اس میں وہ یہ ہدایت نہیں دیتے کہ نقطہ تعامل کیسا ہونا چاہیے۔ اس کے بجائے، نقطہ تغیرات کی شناخت ہائی-سی میٹرکس کے اندر توقع سے زیادہ تعامل تعدد کے ساتھ آؤٹ لیئر کے طور پر کی جاتی ہے، یہ دیکھتے ہوئے کہ پس منظر کا ماڈل صرف مضبوط ترین اشاروں پر مشتمل ہوتا ہے جیسے فاصلہ-زوال کے افعال۔ پس منظر کے ماڈل کا اندازہ لگایا جا سکتا ہے اور مقامی سگنل کی تقسیم اور عالمی نقطہ نظر دونوں کا استعمال کرتے ہوئے بنایا جا سکتا ہے (یعنی۔ کروموسوم وسیع/جینوم وسیع)۔ مذکورہ بالا بائیو انفارمیٹکس پیکجوں میں سے بہت سے نقطہ تعاملات کی شناخت کے لیے الگورتھم کو شامل کرتے ہیں۔ مختصرا، انفرادی جوڑی کے لحاظ سے تعامل کی اہمیت کا حساب لگایا جاتا ہے، اور نمایاں طور پر اعلی آؤٹ لیئرز کو متعدد جانچ کے لیے درست کیا جاتا ہے اس سے پہلے کہ وہ واقعی معلوماتی نقطہ تعاملات کے طور پر پہچانے جائیں۔ اضافی شواہد جیسے افزودگی کے اسکور اور حیاتیاتی نقلوں کے تجزیے کے ساتھ شناخت شدہ نقطہ تعاملات کی تکمیل کرنا مددگار ہے، تاکہ یہ ظاہر کیا جا سکے کہ یہ تعاملات درحقیقت حیاتیاتی اہمیت کے حامل ہیں۔ ڈویلپمنٹ 1 کا استعمال کریں۔ سیل ڈویژن ہائی-سی سیل ڈویژن کے دوران کرومیٹن کی تشکیل میں ہونے والی تبدیلیوں کو ظاہر کر سکتا ہے۔ انٹرفیس میں، کرومیٹن عام طور پر ڈھیلے اور متحرک ہوتے ہیں تاکہ ٹرانسکرپشن ریگولیشن اور دیگر ریگولیٹری سرگرمیاں ہو سکیں۔ مائٹوسس اور سیل ڈویژن میں داخل ہوتے وقت، کرومیٹن گھنے سلنڈریکل کروموسوم میں کمپیکٹ طور پر جوڑ جاتے ہیں۔ پچھلے پانچ سالوں میں، سنگل سیل ہائی-سی کی ترقی نے پورے سیل سائیکل میں کرومیٹنز/کروموسوم کے پورے تھری ڈی ساختی منظر نامے کی عکاسی کو قابل بنایا ہے، اور بہت سے مطالعات سے پتہ چلا ہے کہ یہ شناخت شدہ جینومک ڈومینز انٹرفیس میں تبدیل نہیں ہوتے ہیں، اور جب سیل مائٹوسس میں داخل ہوتا ہے تو میکانیزم کو خاموش کرنے سے مٹ جاتے ہیں۔ جب مائٹوٹک تقسیم مکمل ہو جاتی ہے اور خلیہ انٹرفیس میں دوبارہ داخل ہوتا ہے، تو کرومیٹن 3D ڈھانچے کو دوبارہ قائم ہونے کا مشاہدہ کیا جاتا ہے، اور نقل و حمل کے ضابطے کو بحال کیا جاتا ہے۔ 2. ٹرانسکرپشن ریگولیشن اور قسمت کا تعین یہ شبہ کیا گیا ہے کہ مختلف بالغ خلیوں کے نسلوں میں جنین اسٹیم سیلز (ای ایس سی) اور انڈیوسڈ پلور پوٹینٹ اسٹیم سیلز (آئی پی ایس سی) کی تفریق کروموسومل ڈھانچوں میں عالمی تبدیلیوں اور اس کے نتیجے میں تعامل کی حرکیات کے ساتھ ہوتی ہے تاکہ ٹرانسکرپشنل ایکٹیویشن/سائلنسنگ کے ضابطے کی اجازت دی جا سکے۔ اس تحقیقی سوال کی تحقیقات کے لیے معیاری ہائی-سی کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔ 2015 میں، ڈکسن اور دیگر۔ اعلی پانچ خلیوں میں ان کی تفریق کے دوران انسانی ای ایس سی میں عالمی تھری ڈی حرکیات کو حاصل کرنے کے لیے معیاری ہائی-سی کا اطلاق کیا۔ تفریق سے متعلق ٹی اے ڈی میں متحرک تعاملات کو ظاہر کرنے کی ہائی-سی کی صلاحیت کی وجہ سے، محققین نے ڈی ایچ ایس سائٹس کی تعداد میں اضافہ، سی ٹی سی ایف بائنڈنگ کی صلاحیت، فعال ہسٹون میں ترمیم، اور دلچسپی کے ان ٹی اے ڈی کے اندر ہدف جین کے تاثرات کو دریافت کیا، اور سومیٹک سیل ری پروگرامنگ کے دوران تعاملی نیٹ ورک میں او سی ٹی 4، این اے این او جی، اور ایس او ایکس 2 جیسے بڑے پلوری پوٹینسی عوامل کی نمایاں شرکت پائی۔ اس کے بعد سے، ہائی-سی کو ٹرانسکرپشنل ریگولیٹری سرگرمیوں کی تحقیقات کے معیاری طریقوں میں سے ایک کے طور پر تسلیم کیا گیا ہے، اور اس بات کی تصدیق کی ہے کہ کروموسوم فن تعمیر کا خلیوں کی قسمت سے گہرا تعلق ہے۔ 3. ممالیہ کی جسمانی نشوونما اور نشوونما سپرم اور اووسائٹ کی فرٹیلائزیشن سے شروع ہوتی ہے، اس کے بعد زیگوٹ مرحلہ، 2 خلیے، 4 خلیے، اور 8 خلیے کا مرحلہ، بلاسٹوسسٹ مرحلہ، اور آخر میں جنین کا مرحلہ ہوتا ہے۔ ہائی-سی نے نشوونما اور نشوونما کے دوران جامع جینومک فن تعمیر کو تلاش کرنا ممکن بنایا، کیونکہ ایس آئی ایس-ہائی-سی اور ان سیٹو ہائی-سی دونوں نے اطلاع دی ہے کہ ٹی اے ڈی اور جینومک اے اور بی کمپارٹمنٹ واضح طور پر موجود نہیں ہیں اور اووسائٹ خلیوں میں کم منظم دکھائی دیتے ہیں۔ کرومیٹن کی یہ ساختی خصوصیات صرف بتدریج فرٹیلائزیشن کے بعد کمزور تعدد سے صاف اور زیادہ بار بار ڈیٹا پوائنٹس تک قائم ہوتی ہیں، جیسے جیسے ترقیاتی مراحل ترقی کرتے ہیں۔ جیسے جیسے حالیہ برسوں میں تھری ڈی جینوم ڈھانچوں کے اعداد و شمار زیادہ سے زیادہ مقبول ہوتے جا رہے ہیں، ہائی-سی کو ارتقائی ساختیاتی خصوصیات/تبدیلیوں کو ٹریک کرنے کے لیے ایک ذریعہ کے طور پر استعمال کرنا شروع ہو جاتا ہے۔ جینومک سنگل نیوکلیوٹائڈ پولیمرفزم (ایس این پی) اور ٹی اے ڈی عام طور پر کرومیٹن ڈومین ارتقاء میں سی ٹی سی ایف عنصر کے ساتھ ساتھ تمام انواع میں محفوظ ہیں۔ تاہم، تھری ڈی فن تعمیر میں ساختی ارتقاء کا تجربہ کرنے کے لیے ہائی-سی تکنیکوں کے ذریعے دیگر عوامل کا انکشاف ہوا ہے۔ ان میں کوڈن کے استعمال کی تعدد مماثلت (سی یو ایف ایس)، پیرالاگ جین کو ریگولیشن، اور مقامی طور پر مشترکہ طور پر تیار ہونے والے آرتھولوگس ماڈیولز (ایس سی او ایم) شامل ہیں۔ بڑے پیمانے پر ڈومین ارتقاء کے لیے، کروموسومل ٹرانسلوکیشنز، سنٹینک ریجنز کے ساتھ ساتھ جینومک ریارنگمنٹ ریجنز سبھی نسبتا محفوظ تھے۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ہائی-سی ٹیکنالوجیز زندگی کے یوکرائیوٹک درخت میں ایک متبادل نقطہ نظر فراہم کرنے کی صلاحیت رکھتی ہیں۔ کینسر کئی مطالعات نے مختلف کینسروں میں کرومیٹن فن تعمیر اور بیماری کے پیتھوجینسیس پر ان کے اثرات کو بیان کرنے اور ان کا مطالعہ کرنے کے لیے ہائی-سی کے استعمال کو استعمال کیا ہے۔ Kloetgen et al. ٹی سیل ایکیوٹ لیمفوبلاسٹک لیوکیمیا (ٹی-اے ایل ایل) کا مطالعہ کرنے کے لیے سیٹو ہائی-سی میں استعمال کیا گیا اور ایک ٹی اے ڈی فیوژن ایونٹ پایا جس نے سی ٹی سی ایف موصلیت سائٹ کو ہٹا دیا، جس سے اونکوجین ایم وائی سی کے پروموٹر کو براہ راست ڈسٹل سپر بڑھانے والے کے ساتھ بات چیت کرنے کی اجازت ملی۔ فینگ اور دیگر۔ انہوں نے یہ بھی دکھایا ہے کہ کس طرح کرومیٹن موصلیت کا T-ALL مخصوص فائدہ یا نقصان ہوتا ہے، جو ان سیٹو ہائی-سی کا استعمال کرتے ہوئے جینوم کے TAD فن تعمیر کی طاقت کو تبدیل کرتا ہے۔ لو-سی کا استعمال ایک پھیلے ہوئے بڑے B-سیل لیمفوما مریض کے پرائمری B خلیوں کے کرومیٹن ڈھانچے کا نقشہ بنانے کے لیے کیا گیا ہے اور اسے مریض اور صحت مند B-خلیوں کے درمیان اعلی کروموسوم ساختی تغیر کو تلاش کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ مجموعی طور پر، کینسر کی تحقیق میں ہائی-سی اور اس کے متغیرات کا اطلاق سیل اسامانیتا کے محرک عوامل کی سالماتی بنیاد کے بارے میں منفرد بصیرت فراہم کرتا ہے۔ یہ حیاتیاتی مظاہر (ٹی-اے ایل ایل میں اعلی ایم وائی سی اظہار) کی وضاحت کرنے میں مدد کر سکتا ہے اور کینسر کے خلیوں کے لیے منفرد میکانزم کو نشانہ بنانے کے لیے منشیات کی ترقی میں مدد کر سکتا ہے۔ حوالہ جات جینومکس تکنیک