Deterministic Barcoding in Tissue for Spatial Omics Sequencing
مقامی اومیکس سیکوینسنگ (DBiT-SEQ) کے لیے ٹشو میں تعیناتی بارکوڈنگ 2020 میں ییل یونیورسٹی میں رونگ فین اور ان کے ساتھیوں نے ٹشو کے نمونے کے اندر مقامی جین کے اظہار ہیٹروجینیسیٹی کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک ملٹی اومیکس نقطہ نظر بنانے کے لیے تیار کی تھی۔ یہ طریقہ تازہ یا منجمد فارملڈیہائیڈ فکسڈ ٹشو کے نمونوں میں قریب سنگل سیل ریزولوشن پر ایم آر این اے اور پروٹین کی سطح کی مشترکہ نقشہ سازی کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ڈی بی آئی ٹی-سی کیو اگلی نسل کی ترتیب (این جی ایس) اور مائیکرو فلوئڈکس کا استعمال کرتا ہے۔ یہ طریقہ ٹشو کے نمونے کے بیک وقت مقامی ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک تجزیہ کی اجازت دیتا ہے۔ ڈی بی آئی ٹی-ایس ای کیو پچھلے مقامی ٹرانسکرپٹومیکس ایپلی کیشنز جیسے ہائی ڈیفینیشن اسپاٹیل ٹرانسکرپٹومیکس (ایچ ڈی ایس ٹی) اور سلائیڈ-ایس ای کیو میں فی پکسل پتہ لگانے کے قابل جینوں کی تعداد میں اضافہ، سیلولر ریزولوشن میں اضافہ، اور عمل درآمد میں آسانی سے بہتری لاتا ہے۔ ملٹی سیلولر نظاموں میں ایپلی کیشنز ہر انفرادی خلیے کا کام ان کے مقامی مقام اور آس پاس سے متاثر ہوتا ہے۔ اس طرح، مقامی سیاق و سباق میں ٹشو میں ایم آر این اے اور پروٹین دونوں کی سطحوں کو پروفائل کرنے کے لیے ڈی بی آئی ٹی-سی کیو کا نفاذ بہت سے حیاتیاتی عمل کی بہتر تفہیم کا باعث بن سکتا ہے۔ ڈی بی آئی ٹی-سی کیو کو بہت سے مختلف شعبوں جیسے اونکولوجی، ڈیولپمنٹل بائیولوجی، اور پیتھولوجی میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ترقیاتی حیاتیات میں استعمال اس بات کی بہتر تفہیم کا باعث بن سکتا ہے کہ آرگنجینیسیس کیسے ہوتا ہے، اور اونکولوجی میں یہ ٹیومرجینسیس اور ترقی میں ہیٹرجینیٹی کے کردار کے بارے میں مزید بصیرت فراہم کر سکتا ہے۔ طریقہ کار DBiT-SEQ عین مطابق کنٹرول شدہ پیٹرن میں اولیگونیوکلیوٹائڈ بارکوڈز فراہم کرنے کے لیے مائیکرو فلوڈکس سسٹم کا استعمال کرتا ہے۔ یہ نظام A1B1، A1B2 اور اسی طرح کے لیبل والے حصے میں منفرد بارکوڈز کا گرڈ تیار کرنے کے لیے اولیگونیوکلیوٹائڈ بارکوڈز (A1-A50 اور B1-B50) کے دو سیٹوں کو عمودی طور پر لاگو کرتا ہے۔ ڈیوائس کی تیاری DBiT-SEQ کے لیے بارکوڈز کی فراہمی کے لیے خصوصی طور پر تیار کردہ مائیکرو فلوڈکس ڈیوائس کی ضرورت ہوتی ہے۔ مائکرو فلوئڈکس مائکرون پیمانے پر سیالوں کی درست ہیرا پھیری کو قابل بناتا ہے۔ DBiTseq آلہ سلکان ویفر مولڈ میں پولی ڈائی میتھائل سائلوکسین (PDMS) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا جاتا ہے۔ یہ آلہ صارف کو بغیر کسی خاص سامان کے میکرو پیمانے پر مائع ریجینٹس کو مناسب چینلز میں جمع کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ اس کے بعد ان ریجینٹس کو ٹشو سیکشن کی سطح پر 10، 25، یا 50 مائیکرو میٹر چوڑے چینلز کے ذریعے خلا کے ذریعے کھینچا جاتا ہے۔ ڈی بی آئی ٹی-سی کیو ڈیوائس کے دیگر اجزاء دو پی ڈی ایم ایس ریزروائرز اور ٹشو پر ڈیوائس فلش کو روکنے کے لیے ایکریلک کلیمپ سسٹم ہیں۔ ٹشو کی تیاری اور اینٹی باڈی سٹیننگ ڈی بی آئی ٹی-سی کیو کا ایک فائدہ یہ ہے کہ اسے ٹشو فکسنگ کے نام سے جانے والے عمل میں فارملڈیہائیڈ کے ساتھ محفوظ ٹشو سلائیڈز پر استعمال کرنے کی صلاحیت ہے، جو دیگر مقامی اومیکس طریقوں سے مطابقت نہیں رکھتا ہے۔ ٹشوز کو منجمد کیا جاتا ہے، فکس کیا جاتا ہے اور بہت پتلی سلائسز میں تقسیم کیا جاتا ہے جو شیشے کی سلائیڈز پر نصب ہوتے ہیں۔ اگر نمونے میں پروٹین کے بارے میں معلومات مطلوب ہیں، تو ٹشو کو پہلے اینٹی باڈی سے ماخوذ ڈی این اے ٹیگز (اے ڈی ٹی) سے داغدار کیا جاتا ہے۔ اے ڈی ٹیز ایک اینٹی باڈی سے بنے ہوتے ہیں جو ایک اولیگونیوکلیوٹائڈ سے منسلک ہوتے ہیں جس میں ایک منفرد بارکوڈ ترتیب اور پولی-اے دم کی ترتیب ہوتی ہے۔ پولی-اے دم کو بار کوڈ اے پر پولی-ٹی ترتیب کے ذریعے پہچانا جائے گا، جس سے اسے مقامی مقام سے منسلک کیا جا سکے گا۔ بارکوڈنگ اینٹی باڈی سٹیننگ کے بعد (اگر چاہیں تو)، پہلے مائیکرو فلوئڈکس چپ کا استعمال کرتے ہوئے ٹشو کے نمونے پر 50 بارکوڈز کا پہلا سیٹ لگایا جاتا ہے۔ ہر 'اے' پرائمر میں ایک منفرد بارکوڈ سیکوینس، ایک لائیگیشن لنکر، اور ایک پولی ٹی سیکوینس ہوتا ہے۔ پولی-ٹی ترتیب ٹشو کے نمونے میں ایم آر این اے پر اور پہلے لگائے گئے اے ڈی ٹی پر پولی-اے دم سے جڑی ہوتی ہے۔ ریورس ٹرانسکرپشن پھر بارکوڈ اور ایم آر این اے یا اینٹی باڈی ٹیگ سیکوینس پر مشتمل پہلا سی ڈی این اے اسٹرینڈ تیار کرتا ہے۔ چپ بی کو پھر اسی ٹشو سلائیڈ پر لگایا جاتا ہے۔ چپ بی بارکوڈ کا دوسرا سیٹ پہلے سے عمودی طور پر فراہم کرے گا، جس سے گرڈ کا نمونہ تیار ہوگا۔ ہر 'بی' اولیگونیوکلیوٹائڈ میں ایک منفرد بارکوڈ ترتیب، ایک پی سی آر ہینڈل، ایک لائیگیشن لنکر، اور سی ڈی این اے صاف کرنے کے لیے بائیوٹن ہوتا ہے۔ لائیگیشن لنکر سیکوینسز کا استعمال بارکوڈز اے اور بی کو ایک ہی ڈی این اے اسٹرینڈ میں جوڑنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ آخر میں، ایک لائسیس مرحلہ ٹشو سے سی ڈی این اے کو ایک پولڈ نمونے میں نکالتا ہے جس میں تمام بارکوڈڈ اسٹرینڈز ہوتے ہیں۔ لائبریری کی تیاری اور ترتیب مرحلہ 3 میں پیدا ہونے والے سی ڈی این اے لائسیٹ کو سٹریپٹا ویڈن موتیوں کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا جاتا ہے جو بارکوڈ بی پر موجود بائیوٹن کو پہچانتے ہیں۔ اس کے بعد تکمیلی سی ڈی این اے اسٹرینڈ کو ریورس ٹرانسکرپشن کے ذریعے ترکیب کیا جاتا ہے، اس کے بعد پی سی آر امپلیفیکیشن اور لائبریری کی حتمی صفائی ہوتی ہے۔ اس کے بعد لائبریری کو اگلی نسل (الومینا) کی ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا جاتا ہے۔ ڈیٹا تجزیہ ٹشو سلائیڈ کی تصویر ہر بارکوڈنگ مرحلے سے پہلے، اس کے دوران اور اس کے بعد لی جاتی ہے تاکہ بارکوڈز سے حاصل کردہ مقامی معلومات کی عین مطابق ایسوسی ایشن کو قابل بنایا جا سکے۔ ہر ایم آر این اے ترتیب کے ساتھ بارکوڈ کو جوڑنا ٹشو کا ایک مقامی ٹرانسکرپٹومیکس نقشہ فراہم کرتا ہے۔ اگرچہ یہ ایک خلیے کا طریقہ کار نہیں ہے، لیکن 10 یو ایم چینل فی مربع صرف 1 سے 2 خلیوں پر قبضہ کرتے ہیں، جس سے قریب ایک خلیے کی ریزولوشن پیدا ہوتی ہے۔ اے ڈی ٹی کے سلسلے مقامی پروٹومک معلومات حاصل کرتے ہیں جن کا موازنہ ٹرانسکرپٹومک ڈیٹا سے کیا جا سکتا ہے۔ مخصوص خلیوں کی آبادی کی شناخت دو طریقوں سے کی جا سکتی ہے۔ سب سے پہلے، ہر خلیے کی قسم کے لیے ٹرانسکرپٹوم کو پچھلے سنگل سیل آر این اے-سی کیو (ایس سی آر این اے-سی کیو) پروفائلز سے ملا کر۔ دوسرا، اسپاٹیل ڈفریٚنشل ایکسپریشن (اسپاٹیل ڈی ای) کا استعمال کرتے ہوئے، ایک پیٹرن ریکگنیشن سافٹ ویئر جو ایس سی آر این اے-ایس ای کیو ڈیٹا کے بغیر ٹشو کی اقسام میں فرق کر سکتا ہے۔ فوائد اور حدود DBiT-SEQ mRNAs اور پروٹین کی مشترکہ نقشہ سازی کی اجازت دے کر دیگر مقامی اومیکس تکنیکوں پر ایک فائدہ فراہم کرتا ہے۔ یہ تجزیہ کے لیے ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک ڈیٹا دونوں فراہم کرتا ہے۔ اس تکنیک کو آسانی سے نافذ کیا جا سکتا ہے اور محقق کی ضروریات اور دلچسپی کے پروٹین کے مطابق ڈھالا جا سکتا ہے۔ یہ طریقہ ایچ اینڈ ای اور امیونوسٹینڈ ٹشو کے نمونوں کے ساتھ ساتھ فارملڈیہائیڈ فکسڈ ٹشو کے نمونوں کے ساتھ کامیابی سے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ بارکوڈنگ کے لیے استعمال ہونے والے چینلز کو 10 مائیکرو میٹر، 25 مائیکرو میٹر، اور 50 مائیکرو میٹر سے ریزولوشن کی ضروریات کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ حدود DBiT-SEQ کے ریزولوشن میں سنگل سیل ریزولوشن نہیں ہے، لیکن یہ سنگل سیل ریزولوشن کے قریب ہے۔ پکسل سائز کی نظریاتی حد ~ 5 مائیکرو میٹر ہے، جو کہ ایک خلیے کے مشاہدے کے واحد یا حصے کی اجازت دینے کے لیے کافی چھوٹی ہے لیکن اس پر عمل درآمد نہیں کیا گیا ہے۔ موجودہ چینل کی ترتیب کے ساتھ ٹشو پر نقشہ سازی کے علاقے کے لیے سائز کی حد ہوتی ہے، 10 مائیکرو میٹر چینلز کا استعمال کرتے ہوئے یہ ٹشو کے صرف 1 ملی میٹر × 1 ملی میٹر کے علاقے کی نقشہ سازی کی اجازت دیتا ہے۔ اس حد پر قابو پانے کے لیے احاطہ شدہ رقبے کو بڑھانے کے لیے اضافی بارکوڈنگ چینلز شامل کیے جا سکتے ہیں۔ خلاصہ بافت خلیوں کی متنوع آبادیوں سے بنے ہوتے ہیں۔ یہ سمجھنا کہ یہ خلیے ایک ساتھ کیسے کام کرتے ہیں اور ٹشو میں ہر خلیے کی قسم کا کردار کینسر کی تحقیق اور ترقیاتی حیاتیات جیسے شعبوں میں اہم ہے۔ اگرچہ سنگل سیل اومیکس ٹیکنالوجیز میں پیشرفت نے ان پیچیدہ ماحول کو سمجھنے کی ہماری کوشش کو بہتر بنایا ہے، لیکن مقامی معلومات کا نمایاں طور پر فقدان رہا ہے۔ مقامی اومیکس کی آمد سے اس میں بہتری آئی ہے۔ DBiT-SEQ فکسڈ یا تازہ ٹشو حصوں سے مقامی ٹرانسکرپٹومیک اور پروٹومک معلومات حاصل کرنے کے لیے ایک قابل رسائی طریقہ فراہم کرتا ہے۔ 10، 25 یا 50 مائیکرو میٹر ریزولوشن کے ساتھ، ڈی بی آئی ٹی-ایس ای کیو قریب واحد سیل ریزولوشن فراہم کرتا ہے اور انتہائی خصوصی امیجنگ آلات کی ضرورت کے بغیر مقامی اومیکس ڈیٹا فراہم کرتا ہے۔ حوالہ جات اومیکس ڈی این اے بارکوڈنگ