ScGET-seq
سنگل سیل جینوم اور ایپیجینوم بائی ٹرانسپوسیس سیکوینسنگ (ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو) کھلے اور بند کرومیٹن کی پروفائلنگ کے لیے ڈی این اے سیکوینسنگ کا ایک طریقہ ہے۔ سیکوینسنگ (ایس سی اے ٹی اے سی-ایس ای کیو) کے ساتھ ٹرانسپوز-قابل رسائی کرومیٹن کے لیے سنگل سیل جانچ کے برعکس، جو صرف فعال یوکرومیٹن کو نشانہ بناتا ہے۔ ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو غیر فعال ہیٹروکرومیٹن کی تحقیقات کرنے کی بھی صلاحیت رکھتا ہے۔ یہ ٹی این ایچ کے استعمال کے ذریعے حاصل کیا جاتا ہے، جو ہیٹروکرومیٹن پروٹین-1-الفا (ایچ پی-1) کے کروموڈومین (سی ڈی) کو ٹی این 5 ٹرانسپوسز سے جوڑ کر بنایا جاتا ہے۔ اس کے بعد ٹی این ایچ ہسٹون 3 لائسین 9 ٹرائمیتھیلیشن (ایچ 3 کے 9 می 3) کو نشانہ بنانے کے قابل ہوتا ہے، جو ہیٹروکرومیٹن کے لیے ایک مارکر ہے۔ آکن سے آر این اے کی رفتار، جو سیلولر نشوونما کے دوران جین کے اظہار میں ہونے والی تبدیلیوں کی حرکیات کا اندازہ لگانے کے لیے اسپلیسڈ سے غیر اسپلیسڈ آر این اے کے تناسب کا استعمال کرتی ہے، ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو سے حاصل ہونے والے ٹی این ایچ سے ٹی این 5 سگنلز کا تناسب کرومیٹن کی رفتار کا حساب لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جو سیلولر ترقیاتی راستوں کے دوران کرومیٹن تک رسائی کی حرکیات کی پیمائش کرتا ہے۔ ٹرانسکرپشنل ریگولیشن کرومیٹن ریاستوں سے مضبوطی سے جڑا ہوا ہے۔ کرومیٹن جو کھلا ہے، یا نقل کے لیے قابل اجازت ہے، جینوم کا صرف 2-3% بناتا ہے، لیکن نقل کے عنصر کے بائنڈنگ سائٹس کا 94.4% احاطہ کرتا ہے۔ اس کے برعکس، زیادہ مضبوطی سے پیک شدہ ڈی این اے، یا ہیٹروکرومیٹن، جینوم کی تنظیم اور استحکام کے لیے ذمہ دار ہے۔ کرومیٹن کی کثافت سیلولر تفریق کے عمل کے دوران بھی تبدیل ہوتی ہے، لیکن ہیٹروکرومیٹن کی براہ راست جانچ کے لیے ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے طریقوں کی کمی ہے۔ جینومک سے متعلق بہت سی بیماریاں جیسے کینسر ان کے ایپیجینوم میں ہونے والی تبدیلیوں سے بہت زیادہ جڑے ہوئے ہیں۔ کینسر خاص طور پر سنگل سیل ہیٹروجینیٹی کی خصوصیت رکھتے ہیں، جو میٹاسٹاسس اور علاج کی مزاحمت کو چلا سکتے ہیں۔ ان عملوں کی بنیاد رکھنے والے میکانزم اب بھی بڑی حد تک نامعلوم ہیں، حالانکہ سنگل سیل ٹیکنالوجیز کی آمد، بشمول سنگل سیل ایپیجینومکس، نے ان کی وضاحت میں بہت اہم کردار ادا کیا ہے۔ 2015 میں، اے ٹی اے سی-سی کیو، جو ٹی این 5 ٹرانسپوسیس کو ٹکڑے ٹکڑے کرنے اور قابل رسائی کرومیٹن، یا یوکرومیٹن کو ٹیگ کرنے کے لیے استعمال کرتا ہے، ترتیب کے لیے، سنگل سیل ریزولوشن پر ممکن ہو گیا۔ ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو ہر خلیے کے اندر کرومیٹن کی ساخت اور حرکیات پر زیادہ جامع نظر فراہم کرتے ہوئے ہیٹروکرومیٹن کے بارے میں معلومات فراہم کرکے اس ٹیکنالوجی کو تیار کرتا ہے۔ طریقہ نمونے کی تیاری ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو کے لیے نمونے کی تیاری ابتدائی مواد کے لیے موزوں طریقہ استعمال کرتے ہوئے خلیوں سے نیوکلئی کی معطلی حاصل کرنے سے شروع ہوتی ہے۔ اگلا مرحلہ ٹی این ایچ ٹرانسپوز تیار کرنا ہے۔ ٹی این 5 ایک ٹرانسپوزیس ہے جو نیوکلیوسومز (اوپن کرومیٹن) سے غیر پابند جینومک علاقوں میں اڈاپٹرز کو کاٹتا اور جوڑتا ہے۔ HP-1a HP1 خاندان کا ایک رکن ہے اور H3K9me3 کو پہچاننے اور خاص طور پر پابند کرنے کے قابل ہے۔ اس کا کروموڈومین اس کرومیٹن ترمیم کو پہچاننے کے لیے ایک انڈیوسڈ فٹ میکانزم کا استعمال کرتا ہے۔ تین پولی-ٹائروسین-گلائسین-سیرین (ٹی جی ایس) لنکر کا استعمال کرتے ہوئے کروموڈومین پر مشتمل ایچ پی-1 اے کے پہلے 112 امینو ایسڈ کو ٹی این 5 سے جوڑنا ٹی این ایچ ٹرانسپوسز کی تخلیق کا باعث بنتا ہے، جو ایچ 3 کے 9 می 3 کے ذریعے نشان زد ہیٹروکرومیٹن کو نشانہ بنانے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ لائبریری کی تیاری سنگل سیل اے ٹی اے سی-سی کیو کے لیے ایک ترمیم شدہ پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے کی جاتی ہے، جہاں نیوکلئی معطلی کو پہلے ٹی این 5 ٹرانسپوز اور پھر ٹی این ایچ کے ساتھ ترتیب سے انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ اعداد و شمار کا تجزیہ اعداد و شمار کے تجزیے کے اہداف یہ ہیں: کلسٹرنگ کا استعمال کرتے ہوئے الگ الگ خلیوں کی آبادیوں کی شناخت اور خصوصیت کرنا پورے جینوم میں کرومیٹن کی رسائی کو پروفائل کرنے کے لیے کاپی نمبر کی مختلف حالتوں اور سنگل نیوکلیوٹائڈ کی مختلف حالتوں کی پیش گوئی کرنے کے لیے پری پروسیسنگ پوسٹ سیکوینسنگ، ریڈز کو ڈی ملٹی پلیکس کرنے اور مناسب حوالہ جینوم میں نقشہ سازی کرنے کی ضرورت ہے۔ ڈپلیکیٹڈ ریڈز کی شناخت کی جاتی ہے اور انہیں ہٹا دیا جاتا ہے۔ "چوٹیاں"، یا ڈی این اے میں نقشہ شدہ ریڈز کی تعداد سے مالا مال علاقوں کی نشاندہی کی جاتی ہے۔ کوالٹی کنٹرول انجام دیا جاتا ہے، اور کم تعداد میں ریڈز یا کم دریافت شدہ خصوصیات والے خلیوں کو فلٹر کیا جاتا ہے۔ چار گنتی میٹرکس (میٹرکس جہاں ہر کالم ایک سیل ہے اور ہر صف ایک خصوصیت ہے) تیار کیے جاتے ہیں: Tn5-dhs، Tn5-تکمیل، TnH-dhs اور TnH-تکمیل، جو قابل رسائی اور کمپیکٹ کرومیٹن سے سگنل کی نمائندگی کرتے ہیں۔ تجزیہ طول و عرض میں کمی، تصور اور کلسٹرنگ ہر میٹرکس کو مشترکہ علاقوں سے فلٹر کیا جاتا ہے اور پھر معمول بنایا جاتا ہے اور لاگ 2 کو تبدیل کیا جاتا ہے۔ لکیری طول و عرض میں کمی پرنسپل جزو تجزیہ (پی سی اے) کا استعمال کرتے ہوئے کی جاتی ہے۔ خلیوں کے گروپوں کی شناخت کے-این این الگورتھم اور لیڈن الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے کی جاتی ہے۔ آخر میں، چار میٹرکس کو میٹرکس فیکٹرائزیشن اور یو ایم اے پی کمی کا استعمال کرتے ہوئے ملایا جاتا ہے۔ سیل شناخت اینوٹیشن سیل شناخت اینوٹیشن کے دو طریقے ہیں: اے ٹی اے سی چوٹیوں کی خصوصیت اینوٹیشن پر مبنی اینوٹیشن، اور حوالہ ایس سی آر این اے-ایس ای کیو ڈیٹا کے ساتھ انضمام پر مبنی اینوٹیشن۔ Tn5 سے TnH سگنلز کے تناسب کا استعمال کرتے ہوئے، یہ بیان کرنے والی مقداری اقدار کا حساب لگایا جا سکتا ہے کہ کرومیٹن کی دوبارہ تشکیل کتنی تیزی سے اور کس سمت میں ہو رہی ہے (کرومیٹن کی رفتار)۔ ان علاقوں کو الگ کر کے جو سب سے زیادہ متحرک ہیں اور یہ شناخت کر کے کہ وہاں کون سے نقل کے عوامل جڑے ہوئے ہیں، کرومیٹن کی رفتار کو کسی دیئے گئے خلیے کے اندر ہونے والے متحرک ایپیجینیٹک عمل اور ان عمل میں نقل کے مختلف عوامل کی شراکت کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مستقبل کی کرومیٹن ری ماڈلنگ جین کے اظہار میں تبدیلیوں سے پہلے ہوتی ہے اور سیلولر تبدیلیوں کے راستوں اور طریقہ کار کی سمجھ کو بڑھاتا ہے۔ اس طرح، ملٹی موڈل ڈیٹا کے انضمام کے لیے پلیٹ فارم اور ٹولز فعال تحقیق کے شعبے ہیں۔ آر این اے کی رفتار کے ساتھ کرومیٹن کی رفتار کے انضمام کے ذریعے عارضی اور سمت کے عناصر کو شامل کرنے کی تجویز پیش کی گئی ہے تاکہ تفریق کے راستوں کے بارے میں مزید معلومات ظاہر کی جا سکیں۔ حدود ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو میں کچھ وہی حدود ہیں جو ایس سی اے ٹی اے سی-ایس ای کیو میں ہیں۔ دونوں عمل کے لیے قابل عمل خلیوں سے نیوکلئی نمونوں اور اعلی سیلولر عملداری کی ضرورت ہوتی ہے۔ کم سیلولر عملداری اعلی پس منظر ڈی این اے آلودگی کا باعث بنتی ہے جو مستند حیاتیاتی اشاروں کی درست نمائندگی نہیں کرتی ہے۔ مزید برآں، ایس سی اے ٹی اے سی-ایس ای کیو اور ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو ڈیٹا کی تیز رفتار اور شور کی نوعیت تجزیہ کو مشکل بناتی ہے، اور اس ڈیٹا کو بہترین طریقے سے سنبھالنے کے بارے میں ابھی تک کوئی اتفاق رائے نہیں ہے۔ ایک اور حد یہ ہے کہ ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو کو اب بھی بلک جینوم سیکوینسنگ کے ذریعے ایس این وی کے نتائج کی توثیق کی ضرورت ہے۔ اگرچہ بلک ایکسوم سیکوینسنگ اور ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو کے نتائج کے درمیان تغیرات کا ایک اعلی ارتباط ہے، لیکن ایس سی جی ای ٹی-ایس ای کیو تمام ایکسوم ایس این وی کو پکڑنے میں ناکام رہتا ہے۔ حوالہ جات سالماتی حیاتیات کی تکنیکیں