Paired-end tag
پیئرڈ اینڈ ٹیگز (پی ای ٹی) (بعض اوقات "پیئرڈ اینڈ ڈی ٹیگز"، یا صرف "ڈی ٹیگز") ڈی این اے کے ٹکڑے کے 5 'اور 3' سروں پر مختصر ترتیب ہوتے ہیں جو اتنے منفرد ہوتے ہیں کہ وہ (نظریاتی طور پر) جینوم میں صرف ایک بار ایک ساتھ موجود ہوتے ہیں، اس لیے ان کے درمیان ڈی این اے کی ترتیب کو تلاش پر دستیاب کرتے ہیں (اگر مکمل جینوم ترتیب کا ڈیٹا دستیاب ہے) یا مزید ترتیب پر (چونکہ ٹیگ سائٹیں پرائمر اینیلنگ سائٹس کے طور پر کام کرنے کے لیے کافی منفرد ہیں)۔ پی ای ٹی لائبریریوں میں پیئرڈ اینڈ ٹیگز (پی ای ٹی) موجود ہیں جن میں درمیانی ڈی این اے موجود نہیں ہے، یعنی پی ای ٹی جینومک یا سی ڈی این اے کے ایک بڑے ٹکڑے کی نمائندگی کرتا ہے جس میں ایک مختصر 5 'لنکر سیکوینس، ایک مختصر 5' سیکوینس ٹیگ، ایک مختصر 3 'سیکوینس ٹیگ، اور ایک مختصر 3' لنکر سیکوینس شامل ہوتا ہے۔ یہ تصوراتی طور پر دکھایا گیا تھا کہ 13 بیس جوڑے ٹیگز کو منفرد طور پر نقشہ بنانے کے لیے کافی ہیں۔ تاہم، منفرد طور پر پڑھنے والی نقشہ سازی کے لیے لمبے سلسلے زیادہ عملی ہوتے ہیں۔ پی ای ٹی تیار کرنے کے لیے استعمال ہونے والے اینڈو نیوکلیز (ذیل میں زیر بحث) لمبے ٹیگ (18/20 بیس جوڑے اور 25/27 بیس جوڑے) دیتے ہیں لیکن 50-100 بیس جوڑوں کی ترتیب نقشہ سازی اور لاگت کی کارکردگی دونوں کے لیے بہترین ہوگی۔ بہت سے ڈی این اے کے ٹکڑوں سے پی ای ٹی نکالنے کے بعد، انہیں موثر ترتیب کے لیے ایک ساتھ جوڑا جاتا ہے۔ اوسطا، 20-30 ٹیگز کو سینگر طریقہ کے ساتھ ترتیب دیا جا سکتا ہے، جس کی پڑھنے کی لمبائی زیادہ ہوتی ہے۔ چونکہ ٹیگ کے سلسلے مختصر ہوتے ہیں، انفرادی پی ای ٹی اگلی نسل کی ترتیب کے لیے اچھی طرح سے موزوں ہوتے ہیں جن میں مختصر پڑھنے کی لمبائی اور زیادہ تھرو پٹ ہوتا ہے۔ پی ای ٹی سیکوینسنگ کے اہم فوائد یہ ہیں کہ صرف مختصر ٹکڑوں کو ترتیب دے کر اس کی کم لاگت، جینوم میں ساختی متغیرات کا پتہ لگانا، اور سنگل ٹیگز کے مقابلے میں جینوم میں واپس صف بندی کرتے وقت مخصوصیت میں اضافہ، جس میں ڈی این اے ٹکڑے کا صرف ایک سرے پر مشتمل ہوتا ہے۔ پی ای ٹی لائبریریوں کی تعمیر عام طور پر دو عام طریقوں سے تیار کی جاتی ہے: کلوننگ پر مبنی اور کلوننگ سے پاک۔ کلوننگ پر مبنی فریگمنٹڈ جینومک ڈی این اے یا دلچسپی کے تکمیلی ڈی این اے (سی ڈی این اے) کو پلازمیڈ ویکٹرز میں کلون کیا جاتا ہے۔ کلوننگ سائٹس اڈاپٹر سیکوینس کے ساتھ پھیلی ہوئی ہیں جن میں اینڈو نیوکلیسیس کے لیے پابندی والے سائٹس ہوتے ہیں (ذیل میں بحث کی گئی ہے)۔ اندراجات کو پلازمیڈ ویکٹرز سے منسلک کیا جاتا ہے اور انفرادی ویکٹرز کو پھر ای کولی میں تبدیل کیا جاتا ہے جس سے پی ای ٹی لائبریری بنتی ہے۔ پی ای ٹی ترتیبات پلازمیڈ کو صاف کرنے اور مخصوص اینڈو نیوکلیز کے ساتھ ہضم کرنے سے حاصل کیے جاتے ہیں جو ویکٹر کے سروں پر دو مختصر ترتیبات چھوڑتے ہیں۔ انٹرا مالیکیولر (ڈائلیوٹ) حالات کے تحت، ویکٹرز کو دوبارہ سرکلرائز کیا جاتا ہے اور لیگٹ کیا جاتا ہے، جس سے ویکٹر میں صرف ڈیٹیگس رہ جاتے ہیں۔ کلون کے لیے منفرد ترتیبات کو اب ایک ساتھ جوڑا گیا ہے۔ اگلی نسل کی ترتیب کی تکنیک پر منحصر ہے، پی ای ٹی ترتیبات کو واحد، ڈائمرائزڈ، یا لمبی زنجیروں میں جوڑ دیا جا سکتا ہے۔ کلوننگ کے بجائے، اینڈو نیوکلیز ترتیب پر مشتمل اڈاپٹرز کو ٹکڑے ٹکڑے شدہ جینومک ڈی این اے یا سی ڈی این اے کے سروں سے منسلک کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد مالیکیولز کو سیلف سرکلرائز کیا جاتا ہے اور پی ای ٹی کو جاری کرتے ہوئے اینڈو نیوکلیز کے ساتھ ہضم کیا جاتا ہے۔ ترتیب سے پہلے، ان پی ای ٹیز کو اڈاپٹرز سے منسلک کیا جاتا ہے جس میں پی سی آر پرائمرز امپلیفیکیشن کے لیے متحرک ہوتے ہیں۔ لائبریری کی کلوننگ پر مبنی تعمیر کا فائدہ یہ ہے کہ یہ مستقبل کے استعمال کے لیے ٹکڑوں یا سی ڈی این اے کو برقرار رکھتی ہے۔ تاہم، تعمیراتی عمل کلوننگ سے پاک طریقہ سے کہیں زیادہ طویل ہے۔ لائبریری کی تعمیر پر تغیرات اگلی نسل کی ترتیب دینے والی کمپنیوں نے اپنی متعلقہ ٹیکنالوجی کے مطابق تیار کیے ہیں۔ اینڈو نیوکلیز دوسرے اینڈو نیوکلیز کے برعکس، ایم ایم ای آئی (ٹائپ آئی آئی ایس) اور ایکو پی 15 آئی (ٹائپ III) پابندی والے اینڈو نیوکلیز اپنے ٹارگٹ بائنڈنگ سائٹس کے نیچے کی طرف کاٹتے ہیں۔ ایم ایم ای آئی نیچے کی طرف 18/20 بیس جوڑوں کو کاٹتا ہے اور ایکو پی 15 آئی نیچے کی طرف 25/27 بیس جوڑوں کو کاٹتا ہے۔ جیسا کہ یہ پابندی والے انزائم اڈاپٹرز میں واقع اپنے ہدف کے سلسلے میں باندھتے ہیں، وہ ویکٹروں کو کاٹتے اور چھوڑتے ہیں جن میں ٹکڑے یا سی ڈی این اے کے مختصر سلسلے ہوتے ہیں جو ان سے منسلک ہوتے ہیں، پی ای ٹی تیار کرتے ہیں۔ پی ای ٹی ایپلی کیشنز ڈی این اے-پی ای ٹی: کیونکہ پی ای ٹی ٹیگز کے درمیان رابطے کی نمائندگی کرتا ہے، جینوم ری سیکوینسنگ میں پی ای ٹی کے استعمال میں سنگل ریڈز کے استعمال کے مقابلے میں فوائد ہیں۔ اس ایپلی کیشن کو جوڑی کے لحاظ سے اختتامی ترتیب کہا جاتا ہے، جسے بول چال میں ڈبل بیرل شاٹگن ترتیب کے نام سے جانا جاتا ہے۔ جوڑے کے ایک نصف حصے کو جینوم میں ایک ہی مقام پر منفرد طور پر لنگر انداز کرنے سے دوسرے نصف حصے کی نقشہ سازی کی اجازت ملتی ہے جو مبہم ہے۔ مبہم ریڈز وہ ہیں جو ایک سے زیادہ مقامات کا نقشہ بناتے ہیں۔ یہ بڑھتی ہوئی کارکردگی ترتیب کی لاگت کو کم کرتی ہے کیونکہ یہ مبہم ترتیبات، یا ریڈز، عام طور پر ضائع کردیئے جاتے ہیں۔ پی ای ٹی ترتیبات کا رابطہ ساختی تغیرات کا پتہ لگانے کی بھی اجازت دیتا ہے: اندراج، حذف، نقل، الٹا، ٹرانسلوکیشن۔ پی ای ٹی لائبریری کی تعمیر کے دوران، ٹکڑوں کو ایک مخصوص سائز کے ہونے کے لیے منتخب کیا جا سکتا ہے۔ نقشہ سازی کے بعد، پی ای ٹی ترتیبات سے توقع کی جاتی ہے کہ وہ ایک دوسرے سے مستقل طور پر ایک خاص فاصلے پر ہوں گے۔ اس فاصلے سے ایک تضاد پی ای ٹی ترتیبات کے درمیان ساختی تغیر کی نشاندہی کرتا ہے۔ مثال کے طور پر (دائیں طرف کی شکل): ترتیب شدہ جینوم میں حذف ہونے سے وہ نقشہ حوالہ جینوم میں توقع سے زیادہ دور پڑھ جائے گا کیونکہ حوالہ جینوم میں ڈی این اے کا ایک حصہ ہوگا جو ترتیب شدہ جینوم میں موجود نہیں ہے۔ چپ-پی ای ٹی: کرومیٹن امیونوپریسیپیٹیشن (چپ) اور پی ای ٹی کا مشترکہ استعمال دلچسپی کے پروٹین سے جڑے ڈی این اے کے علاقوں کا پتہ لگانے کے لیے کیا جاتا ہے۔ پیدا شدہ ریڈز کی ابہام کو کم کرکے چپ-پی ای ٹی کو سنگل ریڈ سیکوینسنگ پر فائدہ ہے۔ چپ ہائبرڈائزیشن (CHIP-Chip) پر فائدہ یہ ہے کہ ہائبرڈائزیشن ٹائلنگ صفوں میں شماریاتی حساسیت نہیں ہوتی ہے جو کہ ترتیب پڑھنے میں ہوتی ہے۔ تاہم، چپ-پی ای ٹی، چپ-سیک اور چپ-چپ سبھی انتہائی کامیاب رہے ہیں۔ چییا-پی ای ٹی: کرومیٹن تعامل تجزیہ پر پی ای ٹی ترتیب کا اطلاق۔ یہ پروٹین کے عوامل سے منسلک ڈی این اے عناصر کے درمیان نووو طویل فاصلے تک تعاملات کو تلاش کرنے کے لیے جینوم وسیع حکمت عملی ہے۔ پہلا چییا-پی ای ٹی فل ووڈ ایٹ ال۔ (2009) نے تیار کیا تھا تاکہ ایسٹروجن سے علاج شدہ انسانی چھاتی کے اڈینوکارسنوما خلیوں میں ایسٹروجن ریسیپٹر α (ER-α) سے منسلک کرومیٹن کے درمیان تعاملات کا نقشہ تیار کیا جا سکے۔ چییا-پی ای ٹی تعاملات اور اعلی درجے کے کرومیٹن ڈھانچوں کا تجزیہ کرنے کا ایک غیر جانبدار طریقہ ہے کیونکہ یہ نامعلوم ڈی این اے عناصر کے درمیان تعاملات کا پتہ لگا سکتا ہے۔ اس کے برعکس، جینوم میں ایک مخصوص ہدف والے علاقے سے متعلق تعاملات کا پتہ لگانے کے لیے 3C اور 4C طریقے استعمال کیے جاتے ہیں۔ چییا-پی ای ٹی آر این اے-پی ای ٹی کے ذریعے فیوژن جین تلاش کرنے سے ملتا جلتا ہے جس میں جوڑے والے ٹیگز جینوم کے مختلف علاقوں کا نقشہ بناتے ہیں۔ تاہم، چییا-پی ای ٹی میں آر این اے-پی ای ٹی کی طرح قدرتی طور پر دو جینومک علاقوں کے درمیان فیوژن ہونے کے بجائے مختلف جینومک علاقوں میں واقع مختلف ڈی این اے کے ٹکڑوں کے درمیان مصنوعی ربط شامل ہوتے ہیں۔ آر این اے-پی ای ٹی: یہ ایپلی کیشن ٹرانسکرپٹوم کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے: ٹرانسکرپٹ، جین ڈھانچے، اور جین کے تاثرات۔ پی ای ٹی لائبریری مکمل لمبائی کے سی ڈی این اے کا استعمال کرتے ہوئے تیار کی جاتی ہے، لہذا ڈیٹیگ انفرادی نقل کے 5 'کیپڈ اور 3' پولی اے دم کے دستخطوں کی نمائندگی کرتے ہیں۔ لہذا، آر این اے-پی ای ٹی ٹرانسکرپشن یونٹس کی حدود کی حد بندی کے لیے خاص طور پر مفید ہے۔ اس سے جینوں کے متبادل ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹس اور پولیڈینایلیشن سائٹس کی نشاندہی کرنے میں مدد ملے گی۔ آر این اے-پی ای ٹی کو فیوژن جینز اور ٹرانس اسپلیسنگ کا پتہ لگانے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے، لیکن ان کے درمیان فرق کرنے کے لیے مزید تجربے کی ضرورت ہے۔ نقل کی حدود کو تلاش کرنے کے دیگر طریقوں میں سنگل ٹیگ حکمت عملی سی اے جی ای، ایس اے جی ای، اور سب سے حالیہ سپر ایس اے جی ای شامل ہیں، جس میں سی اے جی ای اور 5 'ایس اے جی ای ٹرانسکرپشن اسٹارٹ سائٹس کی وضاحت کرتے ہیں اور 3' ایس اے جی ای پولیڈینایلیشن سائٹس کی وضاحت کرتے ہیں۔ ان طریقوں پر پی ای ٹی ترتیب کے فوائد یہ ہیں کہ پی ای ٹی نقل کے دونوں سروں کی شناخت کرتا ہے اور ساتھ ہی جینوم کی نقشہ سازی کرتے وقت مزید مخصوصیت فراہم کرتا ہے۔ سی ڈی این اے کی ترتیب نقل کے ڈھانچے کو بڑی تفصیلات میں ظاہر کر سکتی ہے، لیکن یہ نقطہ نظر آر این اے-پی ای ٹی ترتیب سے کہیں زیادہ مہنگا ہے، خاص طور پر پورے نقل کی خصوصیت کے لیے۔ آر این اے-پی ای ٹی کی بڑی حد نقل کے اندرونی ایکسون کی تنظیم کے بارے میں معلومات کی کمی ہے۔ لہذا، آر این اے-پی ای ٹی متبادل اسپلیسنگ کا پتہ لگانے کے لیے موزوں نہیں ہے۔ اس کے علاوہ، اگر کلوننگ کا طریقہ کار استعمال کیا جاتا ہے تو پی ای ٹی تیار کرنے سے پہلے سی ڈی این اے لائبریری کی تعمیر کریں، سی ڈی این اے جن کو کلون کرنا مشکل ہے (طویل نقل کے نتیجے میں) ان کی کوریج کم ہوگی۔ اسی طرح، کم اظہار کی سطح کے ساتھ نقل (یا نقل آئسوفارم) بھی ممکنہ طور پر کم نمائندگی کی جائے گی۔ مالیکیولر بائیولوجی لیبارٹری تکنیک مالیکیولر بائیولوجی تکنیک ڈی این اے ترتیب