Q-FISH
کوانٹیٹیو فلوروسینٹ ان سیٹو ہائبرڈائزیشن (کیو-فش) روایتی فش طریقہ کار پر مبنی ایک سائٹوجینیٹک تکنیک ہے۔ کیو-فش میں، یہ تکنیک فلوروسینٹ مائکروسکوپی اور تجزیہ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کروموسومل ڈی این اے میں ہدف کے سلسلے کی مقدار طے کرنے کے لیے لیبلڈ (سائ 3 یا ایف آئی ٹی سی) مصنوعی ڈی این اے نقالی کا استعمال کرتی ہے جسے پیپٹائڈ نیوکلک ایسڈ (پی این اے) اولیگونیوکلیوٹائڈز کہا جاتا ہے۔ کیو-فش عام طور پر ٹیلومیر کی لمبائی کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے، جو ریٹیبریٹس میں کروموسوم کے دور سرے پر واقع تکراری ہیکسامیرک ترتیب (ٹی ٹی اے جی جی جی) ہوتے ہیں۔ ڈی این اے کے نقصان کے ردعمل کے ساتھ ساتھ جینوم کے عدم استحکام کو روکنے کے لیے کروموسوم کے سروں پر ٹیلومیرز ضروری ہیں۔ آج تک ٹیلومیر تحقیق کے میدان میں کیو-فش طریقہ کار کا استعمال جاری ہے۔ پی این اے اور مچھلی اس حقیقت کی وجہ سے کہ پی این اے بیک بونز میں کوئی چارجڈ فاسفیٹ گروپ نہیں ہوتے ہیں، پی این اے اور ڈی این اے کے درمیان بائنڈنگ ڈی این اے/ڈی این اے یا ڈی این اے/آر این اے ڈوپلیکس سے زیادہ مضبوط ہوتی ہے۔ کیو-فش پی این اے کی اس منفرد خصوصیت کو استعمال کرتا ہے جہاں کم آئنک طاقتوں پر، پی این اے تکمیلی سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کی ترتیب کو ختم کر سکتے ہیں جبکہ سنگل اسٹرینڈڈ ڈی این اے نہیں کر سکتا۔ ایسے حالات کا استعمال کرتے ہوئے جو صرف لیبل شدہ (سی سی سی ٹی اے اے) 3 پی این اے کو (ٹی ٹی اے جی جی) این ٹارگٹ سیکوینس میں ہائبرڈائز کرنے کی اجازت دیتے ہیں، کیو-فش پی این اے کی ہائبرڈائزیشن کو ٹیلومیرک سیکوینس میں مقدار دینے کے قابل ہے۔ کلچرڈ خلیوں کے لیے عمومی طریقہ/پروٹوکول میٹا فیز-گرفتار خلیات تیار کریں کلچرڈ خلیوں کی کٹائی سے کئی گھنٹے پہلے، کولسیمیڈ کو کلچر میڈیم میں شامل کیا جاتا ہے۔ کولسیمیڈ مائٹوٹک خلیوں میں مائکرو ٹیوبلز میں خلل ڈال کر میٹا فیز حالت میں خلیوں کو گرفتار کرنے کا کام کرتا ہے۔ اس کے بعد خلیوں کو ٹرپسینائز کیا جاتا ہے اور ہائپوٹونک بفر میں دوبارہ معطل کیا جاتا ہے۔ اس سے جمع شدہ خلیات پھول جائیں گے اور کروموسوم پھیل جائیں گے۔ خلیوں کو ٹھیک کریں ہائپوٹونک محلول کو پھر سینٹری فیوگیشن کے ذریعے ہٹا دیا جاتا ہے اور میتھانول/گلیشیئل ایسیٹک ایسڈ فکسٹو میں دوبارہ معطل کر دیا جاتا ہے۔ سلائیڈ تیار کریں سیل معطلی کے چند قطرے خوردبین سلائیڈ پر رکھیں اور رات بھر ہوا کو خشک رہنے دیں۔ اگلے دن، سلائیڈ کو فاسفیٹ بفرڈ سیلائن (پی بی ایس) میں کئی منٹ کے لیے ڈبو دیں۔ سلائیڈوں کو فارملڈیہائیڈ میں ٹھیک کریں سلائیڈوں کو 4 فیصد فارملڈیہائیڈ کے محلول میں منتقل کریں اور کئی منٹ تک ٹھیک کریں۔ پی بی ایس سے سلائیڈز کو کئی بار دھوئیں۔ ٹریٹ سلائیڈز کو پیپسن سلائیڈز کے ساتھ پیپسن کے محلول میں منتقل کیا جاتا ہے۔ پیپسن ایک پروٹیز ہے اور پروٹین کو پیپٹائڈز میں ہضم کرنے کا کام کرتا ہے۔ ہائبرڈائز پی این اے پروب (سائ 3 یا ایف آئی ٹی سی لیبلڈ پی این اے) ہائبرڈائزیشن مرکب کی ایک چھوٹی مقدار کو کور سلپ پر رکھا جاتا ہے اور پھر آہستہ سے خوردبین سلائیڈ پر رکھا جاتا ہے جس میں فکسڈ سیل ہوتے ہیں۔ ہیٹ ڈینیچر ڈی این اے اس کے بعد سلائیڈ کو پہلے سے گرم تندور میں رکھا جاتا ہے جہاں خلیے میں کروموسومل ڈی این اے کو کئی منٹ تک 80 ڈگری سیلسیس پر ڈینیچر کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد سلائیڈ کو کمرے کے درجہ حرارت پر کئی گھنٹوں کے لیے چھوڑ دیا جاتا ہے تاکہ پی این اے کو تکمیلی ڈی این اے میں ہائبرڈائز کیا جا سکے۔ غیر باؤنڈ پی این اے کو ہٹانے کے لیے واش سلائیڈز اور کاؤنٹر اسٹین ڈی این اے (ڈی اے پی آئی یا پی آئی) سلائیڈز کو پھر غیر باؤنڈ پی این اے کو ہٹانے کے لیے مختلف واش سلوشنز میں احتیاط سے دھویا جاتا ہے۔ مائکروسکوپ ماؤنٹنگ میڈیم کو پھر خلیوں پر رکھا جاتا ہے۔ اس میڈیم میں عام طور پر ڈی اے پی آئی (ایک ڈی این اے کاؤنٹر اسٹین) اور پی این اے فلوروسینس کو محفوظ رکھنے اور فوٹو بلیچنگ کو کم کرنے کے لیے ایک اینٹی فائیڈ حل ہوتا ہے۔ تجرباتی نمونوں کی تصویر لینے سے پہلے، کیمرے اور فلوروسینٹ خوردبین کے مناسب سیٹ اپ کو یقینی بنانے کے لیے فلوروسینٹ حوالہ موتیوں کی تصویر لی جاتی ہے۔ اس کے علاوہ، ان حوالہ موتیوں کی تصویر ہر حصول کے سیشن سے پہلے لی جائے گی۔ یہ اس بات کو یقینی بنائے گا کہ نمونوں کے درمیان فرق لیمپ یا کیمرے میں غلطیوں کی وجہ سے نہیں ہے۔ اس کے بعد ایک میٹا فیز سیل کو دستی طور پر منتخب کیا جاتا ہے اور کیمرے کے لیے مرکوز کیا جاتا ہے۔ دو قسم کی تصاویر لی جاتی ہیں: داغدار کروموسوم کی ان کی میٹا فیز حالت میں تصاویر اور ٹیلومیرز کی فلوروسینٹ تصاویر۔ اس کے بعد دونوں تصاویر کو ایک مشترکہ تصویر بنانے کے لیے سپر امپوز کیا جا سکتا ہے۔ اس تصویر کو پھر کیریو ٹائپ یا نامزد کیا جا سکتا ہے۔ مزید برآں، پی-آرمز بمقابلہ کیو-آرمز میں ٹیلومیر کی لمبائی کی انٹرا کروموسومل تقسیم کی پیمائش کی جا سکتی ہے۔ مختلف تجربات کے اعداد و شمار کو فلوروسینس کی شدت کو معمول پر لانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جبکہ ٹیلومیرک ریپیٹس کی معروف تعداد والے پلازمیڈز کو ٹیلومیر فلوروسینس اور ٹیلومیر کی لمبائی سے متعلق مدد کے لیے معیار کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ فلوروسینٹ حوالہ موتیوں کے علاوہ، بہن کرومیٹائڈز سے سگنل کی طاقت برابر ہونی چاہیے اور اس لیے ڈیٹا کی درستگی کا اندازہ لگانے کے لیے ایک اور کنٹرول کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ آخر میں، یہ ضروری ہے کہ تصاویر سنترپت نہ ہوں۔ اگر فلوروسینس کی شدت سیچوریشن تک پہنچ جاتی ہے تو ٹیلومیر کی لمبائی کو کم سمجھا جاتا ہے۔ کیو-فش امیج اینالیسس سافٹ ویئر فلنٹ باکس نیٹ ورک سے مفت دستیاب ہے۔ ٹیلومیر کی لمبائی کی تقسیم اور اسے مختلف بیماریوں سے منسلک کرنے سے متعلق معلومات کی مقدار کے لیے ایپلی کیشنز اور اہمیت کیو-فش کا بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔ اس تناظر میں، کیو-فش خاص طور پر متعلقہ ہے کیونکہ یہ تنقیدی طور پر مختصر ٹیلومیرز کا پتہ لگانے اور ان کی مقدار طے کرنے کے قابل ہے۔ یہ دکھایا گیا ہے کہ یہ اوسط ٹیلومیر لمبائی کے بجائے ان تنقیدی طور پر مختصر ٹیلومیرز کی تعدد ہے، جو ٹیلومیر کی خرابی میں اہم ہے۔ اگرچہ کیو-فش ٹیلومیر کی لمبائی کے بارے میں درست معلومات فراہم کرتا ہے، لیکن اس کی مطابقت کو کیو-فش کو دیگر مچھلی سے متعلق تکنیکوں، جیسے فلو-فش کے ساتھ ملا کر بڑھایا جا سکتا ہے۔ فلو-فش میں، فلو سائٹومیٹری کا استعمال کیو-فش میں صرف مٹھی بھر خلیوں کے بجائے خلیوں کی ایک بڑی آبادی میں فلوروسینس کی شدت (اور اس طرح ٹیلومیر کی لمبائی) کی پیمائش کے لیے کیا جاتا ہے۔ اس کے برعکس، کیو-فش کے برعکس، فلو-فش انفرادی خلیے کے اندر کسی خاص کروموسوم میں ٹیلومیر کی لمبائی کا تعین کرنے سے قاصر ہے۔ تاہم، اگرچہ کیو-فش کو عام طور پر کم تھرو پٹ سمجھا جاتا ہے اور آبادی کے مطالعے کے لیے موزوں نہیں ہے، لیکن گروپوں نے ہائی تھرو پٹ (ایچ ٹی) کیو-فش پروٹوکول تیار کیے ہیں جو 96 ویل پلیٹوں میں انٹرفیس نیوکلئی پر کیو-فش انجام دینے کے لیے خودکار مشینری کا استعمال کرتے ہیں۔ اسی طرح، ملٹی پلیکس-فش اور سین ایم-فش جیسے دیگر طریقے تیار کیے گئے ہیں جنہیں کیو-فش کے ساتھ مل کر بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ملٹی پلیکس-فش مختلف رنگوں میں 24 کروموسوم کو دیکھنے اور انٹرا یا انٹر کروموسومل ریارنگمنٹ کی شناخت کرنے کے لیے مختلف قسم کی تحقیقات کا استعمال کرتا ہے۔ سینٹرومیر مخصوص کثیر رنگ کی مچھلی (سی این ایم-فش) ملٹی پلیکس-فش سے کثیر رنگ کی تحقیقات کے ساتھ ساتھ سینٹرومیر مخصوص لیبل شدہ تحقیقات کا استعمال سینٹرومیر علاقوں کی شناخت اور فرق کرنے کے لیے کرتی ہے۔ سینٹرومیر اسامانیتاوں یا کروموسومل دوبارہ ترتیب اور ٹیلومیر کی لمبائی کے درمیان تعلق کا زیادہ طبی اثر پڑ سکتا ہے، کیونکہ یہ سب قبل از پیدائش یا بعد از پیدائش تشخیص اور ٹیومر کی نشوونما میں اہم نظر آتے ہیں۔ یہ تجربات ٹیلومیرز کے کردار اور ٹیلومیر کی لمبائی کی اہمیت کے بارے میں مزید روشن خیالی فراہم کر سکتے ہیں۔ کیو-فش کا ایک اور استعمال ٹیلومیرک فیوژن کا پتہ لگانا ہے، جہاں کروموسوم کے سروں کو ٹیلومیر پر ایک ساتھ جوڑ دیا گیا ہے، جسے بعض اوقات انٹرسٹیشیل (کروموسوم کے اندر) ٹیلومیرک سیکوینس (آئی ٹی ایس) کہا جاتا ہے۔ ٹیلومیرک فیوژن کا مطالعہ بعض اوقات ارتقاء کے راستے کو ظاہر کر سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، ایک انسانی کروموسوم میں ایک آئی ٹی ایس ہوتا ہے جس کے بارے میں قیاس کیا جاتا ہے کہ یہ چمپینزی میں دو کروموسوم کے مساوی ہے جو ایک دوسرے کے ساتھ جڑے ہوئے ہیں۔ مختلف انواع میں ٹیلومیر کی لمبائی کے ضابطے کا مشاہدہ کرنے سے کیریوٹائپ ارتقاء اور انسانی بیماریوں سے مطابقت کے بارے میں اہم معلومات بھی سامنے آتی ہیں۔ ایک اور مثال میں، نان ہومولوگس اینڈ جوائننگ (این ایچ ای جے) پروٹین ڈبل اسٹرینڈڈ ڈی این اے کے ٹوٹنے کی مرمت کرتا ہے اور کام کرنے کے لیے کے یو 70/کے یو 80 ہیٹروڈائمر پر انحصار کرتا ہے۔ ان پروٹینوں میں خلل ڈالنے سے ٹیلومیرک شارٹننگ کا سبب بنتا ہے، جس کا مشاہدہ مچھلی کے ساتھ ٹیلومیر کی لمبائی کی پیمائش کرکے کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، کیو 80 جین کی کمی والے چوہوں میں، ٹیلومیر کی لمبائی کو کیوفش کے ذریعے ماپا جاتا ہے اور اسے نمایاں طور پر چھوٹا دیکھا جاتا ہے۔ ق-فش عام طور پر کینسر کی تحقیق میں کینسر اور غیر کینسر کے خلیوں کے درمیان ٹیلومیر کی لمبائی میں فرق کی پیمائش کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ ٹیلومیر کا چھوٹا ہونا جینومک عدم استحکام کا سبب بنتا ہے اور قدرتی طور پر بڑھاپے کے ساتھ ہوتا ہے، دونوں عوامل جو کینسر کی ممکنہ وجوہات سے متعلق ہیں۔ کیو-فش کے فوائد دیگر ماہی گیری کی تکنیکوں کے مقابلے میں کیو-فش کا سب سے بڑا فائدہ اس تکنیک کی مقداری صلاحیت ہے۔ روایتی مچھلی کے مقابلے میں جو ڈی این اے تحقیقات کا استعمال کرتی ہے، مقداری معلومات حاصل کرنا مشکل ہے کیونکہ ہائبرڈائزیشن تحقیقات تکمیلی جینومک ڈی این اے اسٹرینڈز کی تجدید کے ساتھ مقابلہ کرتی ہیں۔ لہذا، پی این اے کا استعمال کرکے اور بہت سخت حالات میں ان کو ہائبرڈائز کرکے، یہ کسی کو اس مسئلے پر قابو پانے کی اجازت دیتا ہے۔ اسی طرح، کیونکہ کوئی پی این اے تحقیقات کی موجودگی میں کروموسومل ڈی این اے کو خراب کرنے کے قابل ہوتا ہے، اس سے مچھلی کے طریقہ کار کو آسان بنایا جاتا ہے۔ اس کے علاوہ، یہ طریقہ زیادہ ریزولوشن فراہم کرتا ہے، جس سے صارف کو کسی خاص خلیے میں ہر انفرادی کروموسوم (پی یا کیو بازو) کی ٹیلومیر لمبائی کا جائزہ لینے کی اجازت ملتی ہے۔ نیز، سدرن بلاٹس کے برعکس جن کو بلاٹ کے لیے 105 سے زیادہ خلیوں کی ضرورت ہوتی ہے، کیو-فش میں 30 سے کم خلیوں کی ضرورت ہوتی ہے۔ کیو-فش کی خرابیاں اس کے فوائد کے باوجود، کیو-فش کافی محنت طلب ہے اور عام طور پر اعلی تھرو پٹ تجزیہ کے لیے موزوں نہیں ہے۔ یہ تکنیک اچھی طرح سے تیار شدہ میٹا فیز خلیوں پر منحصر ہے اور یہ ضروری ہے کہ آلات اور نمونوں کو درست طریقے سے ایڈجسٹ/نارمل کیا جائے تاکہ مقدار درست ہو۔ نیز، جب کہ خلیوں کی صرف تھوڑی مقدار کی ضرورت ہوتی ہے، ایک ہی وقت میں میٹا فیز میں کافی تعداد حاصل کرنا مشکل ہے۔ اس کے علاوہ، ناقص کروموسوم مورفولوجی تیاری کے دوران زیادہ درجہ حرارت سے زیادہ نمائش کا نتیجہ ہو سکتی ہے۔ اسی طرح، اگر کوئی مختلف خلیوں کی اقسام استعمال کر رہا ہے، تو کیو-فش کے بہت سے مراحل (جیسے کہ کولسیمیڈ علاج کی لمبائی) کو بہتر بنانے کی ضرورت ہوگی۔ فلوروسینس مائکروسکوپی میں ایک عام مسئلہ فوٹو بلیچنگ ہے، جہاں فلوروفور روشنی کی نمائش کے نتیجے میں اپنی سرگرمی کھو دیتا ہے۔ یہ فلوروسینس کی شدت کی غلط پیمائش کا باعث بن سکتا ہے۔ فوٹو بلیچنگ، لائٹ سورس اسٹیبلٹی، اور سسٹم کی تغیر پذیری غلطی کے تمام ذرائع ہیں لیکن اگر صارف نمونوں کے درمیان حصول کے وقت کو کم کرنے اور مناسب کنٹرول شامل کرنے کے قابل ہو تو اسے کم سے کم کیا جا سکتا ہے۔ کلاسیکی تکنیک کیو-فش اور پی این اے کی ترقی سے پہلے، ٹیلومیر کی لمبائی کی پیمائش کے لیے کلاسیکی تکنیک سدرن بلاٹس کا استعمال تھا۔ اس طریقہ کار میں، جینومک ڈی این اے کو پابندی والے انزائموں کا استعمال کرتے ہوئے ہضم کیا جاتا ہے اور جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے الگ کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد ڈی این اے کو ایک جھلی میں منتقل کیا جاتا ہے اور تابکار یا فلوروسینٹ ٹیلومیرک ڈی این اے تحقیقات کا استعمال کرتے ہوئے ہائبرڈائز کیا جاتا ہے۔ تاہم، یہ طریقہ صرف خلیوں کی آبادی میں اوسط ٹیلومیر کی لمبائی کا اندازہ کرنے کے قابل ہے اور جینوم میں انٹرسٹیشیل ٹیلومیرک ترتیبات کی موجودگی غلط پیمائش حاصل کر سکتی ہے۔ کیو-فش فلو-فش کی تغیرات کیو-فش کی طرح، فلو-فش کیو-فش کی موافقت ہے جو پی این اے کے استعمال کو فلو سائٹومیٹری کے ساتھ جوڑتی ہے۔ اس طریقہ کار میں، فلو-فش میٹا فیز کروموسوم کے بجائے انٹرفیز خلیوں کا استعمال کرتا ہے اور معطلی میں پی این اے تحقیقات کو ہائبرڈائز کرتا ہے۔ ہائبرڈائزیشن کے بعد، نسبتا کم وقت میں فلو سائٹومیٹر پر ہزاروں خلیوں کا تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، فلو-فش صرف ہر خلیے کے لیے اوسط ٹیلومیرک لمبائی فراہم کرتا ہے جبکہ کیو-فش انفرادی کروموسوم کی ٹیلومیر لمبائی کا تجزیہ کرنے کے قابل ہے۔ پی این اے-فش اگرچہ کیو-فش کی مقداری صلاحیت عام طور پر ٹیلومیر ریسرچ میں استعمال ہوتی ہے، لیکن دوسرے شعبوں جن میں صرف کوالٹی ڈیٹا کی ضرورت ہوتی ہے، نے تحقیق اور تشخیصی دونوں مقاصد کے لیے فش کے ساتھ پی این اے کے استعمال کو اپنایا ہے۔ کلینک کے اندر تیزی سے متعدی بیماریوں کی شناخت اور تشخیص کے لیے پی این اے-فش اسیس تیار کیے گئے ہیں۔ مثبت خون کے کلچر کے روایتی گرام سٹیننگ کے ساتھ مل کر، پی این اے کا استعمال بیکٹیریا یا خمیر کے مختلف تناؤ کی شناخت کے لیے انواع سے متعلق مخصوص آر آر این اے (رائبوسومل آر این اے) کو نشانہ بنانے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ چونکہ ٹیسٹ نسبتا تیزی سے کیا جا سکتا ہے، اس لیے اس ٹیسٹ کو ان ہسپتالوں میں استعمال کرنے پر غور کیا جا رہا ہے جہاں ہسپتال سے حاصل شدہ انفیکشن ہو سکتے ہیں۔ کو-فش (کروموسوم واقفیت-فش) ایک اور موافقت جو پی این اے اور فش کا استعمال کرتی ہے اسے کو-فش (کروموسوم واقفیت-فش) کے نام سے جانا جاتا ہے جو ایک مخصوص انداز میں پی این اے کے ساتھ کروموسوم کی لیبلنگ کی اجازت دیتا ہے۔ اس طریقہ کار میں ڈی این اے کے نئے نقل شدہ تاروں کو منتخب طور پر ہٹانا شامل ہے (بی آر ڈی یو انضمام کے استعمال کے ذریعے)، جس کے نتیجے میں صرف ایک ہی پھنسے ہوئے ہدف ڈی این اے ہوتا ہے۔ مختلف رنگین یک طرفہ پی این اے تحقیقات کا استعمال کرتے ہوئے، بہن کرومیٹائڈز کو منفرد طور پر لیبل کرنا ممکن ہو جاتا ہے۔ حوالہ جات سائٹوجینیٹکس