L-Photo-methionine
ایل-فوٹو-میتھیونائن ایل-میتھیونائن کا ایک فوٹو ری ایکٹیو امینو ایسڈ مشتق ہے جو 2005 میں مصنوعی طور پر تشکیل پایا تھا۔ پروٹین امینو ایسڈ کی لمبی پولیمر زنجیریں ہیں ؛ جو مختلف ڈھانچوں اور سائز میں مختلف ہو سکتی ہیں۔ پروٹین ایک دوسرے کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں (پروٹین-پروٹین تعاملات یا پی پی آئی) اور ان تعاملات کے ساتھ، سیلولر تعاملات اور راستوں کو متاثر کرتے ہیں۔ اس طرح کے تعاملات ؛ وائرل فیوژن اور گروتھ فیکٹر سگنلنگ میں اینٹی وائرل یا اینٹی کینسر دوائیوں کے لیے امید افزا نظر آتے ہیں، لہذا تعاملات کو سمجھنے کے لیے تحقیق کی جانی چاہیے۔ اس کے ساتھ، تحقیق نے یہ ثابت کرنا شروع کر دیا ہے کہ پروٹین الگ تھلگ اداروں کے مقابلے میں سپرمولیکولر کمپلیکس میں کام کرتے ہیں۔ لہذا، سائنس دانوں مونیکا سچانیک، انا ریڈزیکووسکی، اور کرسٹوف تھیلی نے تحقیق کی کہ قدرتی ماحول میں ان تعاملات کا بہتر مطالعہ کرنے کا براہ راست طریقہ فوٹو کراس سے منسلک پروٹین کا ایک نیا طریقہ بنانا تھا ؛ جس کی وجہ سے ایل-فوٹو-میتھیونائن کی ترکیب ہوئی اور اسی مطالعے میں، ایل-فوٹو-لیوسین۔ ترکیب ریسمک فوٹو میتھیونائن کو 4,4 '-ازی-پینٹینل سے اسٹریکر امینو ایسڈ کی ترکیب کے ذریعے ترکیب کیا جاتا ہے۔ ایل اینانٹیومر کو ایسیٹامائڈ کے انزیمیٹک ریزولوشن سے الگ کیا جاتا ہے۔ میتھیونائن کی فوٹو ایکٹیویشن جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا تھا، ایل-فوٹو-میتھیونائن کو ان کے آبائی ماحول میں پروٹین کے ساتھ پروٹین-پروٹین کے تعاملات کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ کیسے ممکن ہے کہ یو وی روشنی کے سامنے آنے پر امینو ایسڈ کس طرح برتاؤ کرتا ہے۔ یہ ثابت کرنے کے لیے کہ پہلے ترکیب کام کرتی ہے، ایک تابکار کاربن (14C) جیسا کہ اس کی اپنی ترکیب کے تحت مناسب سپیکٹروسکوپک طریقے انجام دینے کے لیے شامل کیا جاتا ہے۔ فوٹو میتھیونائن کی سرگرمی کیونکہ پچھلی ترکیب نے کام کیا تھا، فوٹو میتھیونائن ڈیازیرن رنگ کی وجہ سے فوٹو ری ایکٹیو ہے۔ ایک بار جب یہ رنگ یووی روشنی کے سامنے آ جاتا ہے، تو نائٹروجن نائٹروجن گیس (این 2) کے طور پر نکل جاتا ہے اور انتہائی رد عمل والے انٹرمیڈیٹ کاربینی کی تشکیل کرتا ہے۔ امینو ایسڈ کی فوٹو ایکٹیویشن پروٹین میں فوٹو کراس لنک کرنے کی صلاحیت فراہم کرتی ہے۔ اس قسم کے کراس لنکنگ کے تین بڑے فوائد ہیں۔ قلیل مدتی انٹرمیڈیٹس کی وجہ سے اس کراس لنکنگ کے لیے زیادہ خاصیت ہے اور یہ کہ یہ امینو ایسڈ فعال ہے، اور سب سے اہم بات زہریلا نہیں ہے (یعنی اس سے پروٹین کے کام یا ساخت میں ڈرامائی طور پر خلل نہیں پڑنا چاہیے)۔ تحقیق سے پتہ چلا کہ یہ ایکٹیویشن شرح کو محدود کرنے والا قدم ہے ؛ کراس لنکج نہیں۔ ایک نئی موثر ترکیب اور استعمال کے سائنس دان میکیل ولا-پیریلو، میتھیو آر پراٹ، فریج ٹولن، اور ٹام ڈبلیو مائر ایک موثر ترکیب بنانا چاہتے تھے کیونکہ اصل میں انزیمیٹک حل کی ضرورت تھی اور اس کی پیداوار کم تھی۔ لہذا، انہوں نے ایل-گلوٹامک ایسڈ کے ساتھ کاربوکسلک ایسڈ (ٹیرٹ-بیوٹیل)، اور امین پر بوک دونوں پر حفاظتی گروپوں کے ساتھ شروعات کی۔ یہ ترکیب کلاسیکی کے طور پر تفصیل سے نہیں گزرے گی، لیکن ذیل میں مکمل ترکیب ہے۔ اصل مراحل تلاش کرنے کے لیے حوالہ دیکھیں۔ لہذا، ایک بار جب انہوں نے ایل-فوٹو-میتھیونائن کی ترکیب کی، تو پیداوار 32 ٪ تھی، جو اصل ترکیب سے بہت زیادہ (چھ گنا) تھی۔ اس کے بعد اس کا استعمال کیا گیا (امائن پر ایک حفاظتی گروپ ایف ایم او سی کے ساتھ) جس کا مطالعہ کرنے کے لیے اس پروڈکٹ نے مزید مصنوعی اقدامات کیے کہ آیا ایک امینو ایسڈ کراس لنکر اور ایک پوسٹ ٹرانسلیشنل ترمیم (پی ٹی ایم) کو اسی پروٹین سائٹ پر متعارف کرایا جا سکتا ہے خاص طور پر پی ٹی ایم پر منحصر امینو ایسڈ کے کوولینٹ تعامل کو پکڑنے کے لیے۔ پی ٹی ایم پروٹین-پروٹین کے تعاملات کو منظم کرتا ہے جس میں ایسی خصوصیات ہوتی ہیں جو عارضی اور سبسوچیومیٹرک ہوتی ہیں ؛ جس سے معیاری طریقوں سے ان کا پتہ لگانا مشکل ہو جاتا ہے۔ لہذا، یہ دیکھنے کے لیے کہ آیا یہ کام کرے گا، سمیڈ 2 کا ایم ایچ 2 ڈومین استعمال کیا گیا کیونکہ یہ سگنلنگ پروٹین ریسیپٹر-فاسفوریلیٹڈ سیرائن کے باقیات کے ساتھ رابطے میں آنے کے بعد مستحکم ہومو-ٹرمر بنانے کے لیے جانا جاتا ہے۔ ایکسپریشن پروٹین لائیگیشن (جسے ای پی ایل کہا جاتا ہے) کو سمیڈ 2-ایم ایچ 2-سی ایس پی ایس ایم-فوٹو-میٹ (1) بنانے کے لیے ترکیب کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ پروڈکٹ کا مطالعہ کراس لنکر (فوٹو میٹ) کے ساتھ ایک کنٹرول پروٹین کے خلاف کیا گیا تھا: ایچ اے-ایم ایچ 2-سی ایس پی ایس ایم پی ایس (اس میں فوٹو میتھیونائن کا فقدان ہے، 2) ایس ڈی ایس-پیج کا استعمال کرتے ہوئے اور اینٹی ایچ اے اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے ویسٹرن بلاٹنگ۔ 1 نے کراس سے منسلک دو بڑی انواع پیدا کی تھیں جن کا سالماتی وزن سمیڈ 2-ایس ایچ 2 کے ڈائمر اور ٹرائمر کے مطابق ہے۔ اس کراس لنکر کے بغیر، غیر تابکاری 1 میں ڈائمر اور ٹرائمر کا بمشکل پتہ چلا، اور 2 میں یووی تابکاری سے پہلے اور بعد میں۔ یہ ثابت کرنا کہ ایل-فوٹو-میتھیونائن کو ای پی ایل کے ساتھ استعمال کیا جا سکتا ہے اور اسے ایک عارضی ایم ایچ 2-ایم ایچ 2 تعامل کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جو پی ٹی ایم پر منحصر تھا۔ کولیسٹرول ہومیوسٹاسس میں فوٹو میتھیونائن پروٹین انٹرایکشن کمپلیکس اور میمبرین پروٹین کے فنکشن کا استعمال جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے، سائنس دان مونیکا سچانیک، انا ریڈزیکووسکی، اور کرسٹوف تھیلی اپنے قدرتی ماحول میں پروٹین پروٹین کے تعامل کا مطالعہ کرنا چاہتے تھے۔ خاص طور پر، جھلی پروٹین (ایک کمپلیکس میں اور ایس سی اے پی، انسیگ-1، اور ایس آر ای بی پی ہیں) جو کولیسٹرول ہومیوسٹاسس کو منظم کرتے ہیں لہذا وہ جاننا چاہتے تھے کہ ان کا کام کیا تھا اور پیچیدہ ساخت کیا تھی۔ انہوں نے جو پایا وہ یہ تھا کہ اس فوٹو ری ایکٹیو امینو ایسڈ کا استعمال ممالیہ خلیوں کے ذریعہ پروٹین میں مؤثر طریقے سے شامل کیا گیا تھا، لیکن اسے ترمیم شدہ ٹی آر این اے (ٹرانسفر آر این اے) یا اے اے آر ایس (امینو ایسیل ٹی آر این اے سنتھسیس) استعمال کرنے کی ضرورت نہیں تھی جس کی وجہ سے مخصوص کراس لنکنگ کی ضرورت تھی۔ اس کراس لنکنگ کا تعین ویسٹرن بلاٹنگ سے کیا جا سکتا ہے اور انہوں نے انسیگ-1 اور پی جی آر ایم سی 1 (ایک پروجسٹرون بائنڈنگ جھلی پروٹین) کے درمیان براہ راست تعامل دریافت کیا تھا۔ جھلی کے چاروں پروٹین اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں پائے جاتے ہیں اور کمپلیکس کم کولیسٹرول کی سطح کا جواب دیتا ہے۔ خلیات (سی او ایس 7) جن میں ایچ اے (ہیماگگلوٹینن ٹیگڈ پی جی آر ایم سی 1) اور مائیک ٹیگڈ انسیگ-1 تھے، فوٹو میٹ کے ساتھ اور اس کے بغیر اگائے گئے تھے۔ فوٹو میٹ کی موجودگی میں، انسیگ-1 اور ایس سی اے پی نے پی جی آر ایم سی 1 کے ساتھ کراس لنک کیا تھا ؛ خاص طور پر، انسیگ-1 کراس لنکڈ کا ایک مضبوط بینڈ تھا۔ کراس لنکنگ کا پتہ ایچ اے کے لیے اینٹی باڈی کے ساتھ امیونو پریسیپیٹیٹنگ ڈٹرجنٹ-ایکسٹریکٹس کے ذریعے لگایا گیا، پھر مائک کے لیے اینٹی باڈی کے ساتھ ویسٹرن بلاٹنگ کا استعمال کرتے ہوئے انسیگ-1 کے لیے پریسیپیٹنٹ کا تجربہ کیا گیا۔ ایک جیسی بینڈ کا پتہ لگانے کا الٹا حکم کرتے ہوئے پایا گیا ؛ جس کا مطلب ہے کہ مائیک اینٹی باڈی کو امیونوپریسیپیٹیٹ کیا گیا تھا اور اس کے بعد ایچ اے اینٹی باڈی سے دھبہ لگایا گیا تھا۔ لہذا، یہ طریقہ کار کام کرنے کے لیے ثابت ہوا تھا کہ فوٹو میٹ پروٹین کو کراس لنک کر سکتا ہے، لیکن اس کراس لنکنگ کے جسمانی مضمرات کا تعین ابھی باقی ہے۔ ماس سپیکٹرومیٹری پروٹین کے ساتھ پروٹین-پروٹین تعاملات کا مطالعہ کرنے کے لیے پروٹین نینوپروبز کے استعمال کا مطالعہ ایک پروٹین نینوپروب (جو کراس لنکنگ کو قابل بناتا ہے) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جس نے پروٹین کے اندر فوٹو میتھیونائن کو متعارف کرایا (ریکومبیننٹ اظہار کے دوران) جس کی وجہ سے پروٹین اپنی مخصوص ساخت کو برقرار رکھتا ہے جبکہ اس کے تعاملات کے لیے نقشہ بنانے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ ماڈل کو رابطے کی سطح کے ایک خطے کے طور پر استعمال کیا گیا تھا جو 14-3-3 ζ پروٹین کے دو مالیکیولز کے درمیان معروف تعامل (ہوموڈیمرائزیشن) میں شامل ہے۔ ایک بار جب فوٹو میتھیونائن متعارف کرایا جاتا ہے اور یو وی لائٹ کا استعمال کرتے ہوئے چالو ہو جاتا ہے، تو یہ بغیر کسی مخصوصیت کے کراس لنک کر سکتا ہے (یعنی کوئی گروپ نہیں) اور لنکس کی لمبائی صفر ہوتی ہے۔ ہائی ریزولوشن ماس سپیکٹرومیٹری یا ایم ایس (یہاں تک کہ ایم ایس/ایم ایس) کا استعمال کراس لنکڈ باقیات اور رد عمل کے رداس کا تعین کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے ؛ جس سے محققین کو پروٹین کی ہوموڈائمرائزیشن کی خصوصیت اور تحقیق کرنے کا موقع ملتا ہے۔ فوٹو میتھیونائن کے ساتھ ہائی ریزولوشن ایم ایس کے استعمال کے اپنے فوائد ہیں کیونکہ یہ پروٹین کو دوبارہ اپنی آبائی حالت میں رہنے دیتا ہے، پروٹین کی چھوٹی مقدار کا استعمال کرتے ہوئے معقول وقت کے پیمانے ہوتے ہیں۔ کیمیائی کراس لنکنگ کے مقابلے میں فوٹو ایکٹیو کراس لنکر (فوٹو میتھیونائن) کا استعمال کرتے ہوئے رد عمل کی خاصیت اور پابندیوں پر بھی کم حدود ہیں۔ ایم ایس کے ساتھ مل کر پروٹین نینوپروب سے مشترکہ فوٹو شروع کر کے کراس لنک کرنے کا یہ طریقہ نہ صرف ہوموڈیمر کی تشکیل بلکہ اولیگومرز اور نظریہ میں ہیٹرومرز (جیسے پروٹین-پروٹین مرکب کی ساخت اور اس کی فعالیت) کی خصوصیت کے لیے مفید ثابت ہو سکتا ہے۔ فوٹو-سائٹوکروم بی 5 کا استعمال کرتے ہوئے سائٹوکروم پی 450 الیکٹران-ٹرانسپورٹ چین کا مطالعہ کرنے کی صلاحیت سائٹوکروم بی 5 کو پروٹین-پروٹین کے تعاملات کا نقشہ بنانے کے لیے فوٹو-میتھیونائن کے ساتھ ترکیب کیا گیا تھا جبکہ ممالیہ مخلوط فنکشن آکسیڈیز سسٹم (جسے ایم ایف او بھی کہا جاتا ہے) کا مطالعہ کرنے کے لیے اس کی ساخت کی شناخت بھی کی گئی تھی۔ یہ نظام اینڈوپلاسمک ریٹیکولم کی جھلی میں واقع ہے اور یہ سائٹوکروم پی 450، این اے ڈی پی ایچ: سائٹوکروم پی 450 ریڈکٹیس، اور سائٹوکروم بی 5 کے ساتھ ساتھ این اے ڈی ایچ: سائٹوکروم بی 5 ریڈکٹیس پر مشتمل ہے۔ ایک بار جب سائٹوکروم بی 5 کمپلیکس میں فوٹو میتھیونائن شامل ہو گیا (جس کا مطلب ہے کہ میتھیونائن کی جگہ فوٹو میٹ کو تبدیل کیا گیا تھا اور اب فوٹو سائٹ بی 5)، فوٹو سائٹ بی 5 اور سائٹو کروم پی 450 کو یو وی لائٹ میں ڈال دیا گیا اور مصنوعات کا مطالعہ ایس ڈی ایس پیج کا استعمال کرتے ہوئے کیا جا سکا۔ اس طریقہ کار میں تین کراس لنکس دکھائے گئے تھے۔ فوٹو میتھیونائن فوٹو سائٹ بی 5 کی نقشہ سازی میں کامیاب ثابت ہوا تھا کیونکہ ایم اے ایل ڈی آئی-ٹی او ایف طریقہ کار میں تین اولیگومرز (کیموٹریپٹک پیپٹائڈز سے) دکھائے گئے تھے جو 1:1، 1:2، اور 2:1 کے سالماتی وزن کے تناسب میں فوٹو سائٹ بی 5 اور سائٹوکروم پی 450 پر مشتمل تھے۔ جو چیز یہاں فوٹو میتھیونائن کو سائٹوکروم پی 450 اور سائٹوکروم بی 5 کا مطالعہ کرنے میں اتنا مفید بناتی ہے وہ یہ ہے کہ یہ طریقہ نہ صرف پروٹین-پروٹین انٹرفیس کی نقشہ سازی کرتا ہے نہ صرف سالوینٹ کے سامنے آنے والے علاقوں میں، بلکہ مقامی ماحول میں بھی ؛ جھلی۔ ایک عام کراس لنکنگ کا طریقہ صرف سالوینٹ کے بے نقاب علاقوں میں کام کر سکتا ہے، جس سے ایک بار پھر یہ ثابت ہوتا ہے کہ فوٹو میتھیونائن پروٹین کے ساتھ ان پروٹین-پروٹین کے تعاملات کو ان کے آبائی ماحول میں نقش کرنے کے لیے مفید ہے۔ لیمینن γ1 کے ساتھ تعامل کرنے والے نیڈوجن-1 کے پروٹین کی ساخت کا تجزیہ لیمینن غیر کولیجینس پروٹین ہیں جو تہہ خانے کی جھلیوں میں پائے جاتے ہیں اور غیر ہم آہنگ خود تعاملات کے ذریعے نیٹ ورک بناتے ہیں۔ نیڈوجینز (جنہیں اینٹیکٹنس بھی کہا جاتا ہے) سلفیٹڈ مونومیرک گلائکوپروٹینز ہیں جو اعلی حیاتیات کے تہہ خانے کی جھلیوں میں ہر جگہ موجود ہوتے ہیں۔ نیڈوجنز تہہ خانے کی تشکیل میں مدد کرتے ہیں۔ لامینن اور نیڈوجن دونوں موجود ہونے کے ساتھ، دونوں ایک دوسرے کے ساتھ تعامل کرتے ہیں تاکہ ایک کمپلیکس میں 1:1 کا اسٹوچیومیٹری تعلق ہو۔ لامینن γ1 کے چھوٹے بازو کا مطالعہ کرنے کے لیے، فوٹو میتھیونین نے نیڈوجن-1، لامینن γ1 LEb2-4، اور لامینن γ1 چھوٹے بازو دونوں کو متعارف کرایا تاکہ یہ دیکھا جا سکے کہ آیا یہ فوٹو کراس لنک کرنے کا طریقہ ساخت کا نقشہ بنا سکتا ہے۔ ایم ایس/ایم ایس تجزیہ کراس لنکنگ سے پہلے کیا گیا تھا تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ صرف 13-25% میتھیونائن کو شامل کیا گیا تھا، لیکن ایک بار جب یو وی-اے-انڈیوسڈ یا دوسرا کراس لنکر، بی ایس 2 جی-میڈیٹڈ کراس لنکڈ (ایک ہوموبی فنکشنل کراس لنکر)، فوٹو میتھیونائن کا فیصد بڑھ کر 35 فیصد ہو گیا تھا۔ دونوں کراس لنکرز نے افعال کو سمجھنے میں مدد کے لیے کمپیوٹیشنل اور تجرباتی دونوں طرح سے اضافی ساختی بصیرت دکھائی تھی۔ ڈائمرک اسٹرکچر اور اولیگومیرک اسٹرکچر سائکلو آکسیجنیز-2 (سی او ایکس-2) اور مائکروسومل پروسٹاگلینڈن ای 2 سنتھس-1 (ایم پی جی ای ایس-1) ڈھانچوں کا انکشاف فوٹو میتھیونائن (فوٹو ایکٹیویٹ ایبل) اور بائی فنکشنل کراس لنکرز دونوں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ COX-2 میں استعمال ہونے والی فوٹو میتھیونائن نے بائی فنکشنل کراس لنکر کے طور پر دکھایا تھا کہ ایک ڈائمرک ڈھانچہ تھا جو انزائم کے کرسٹل ڈھانچے کے مطابق تھا۔ ایم پی جی ای ایس-1 میں، انسانی خلیوں (اے 549) کو ڈائسوکینیمیڈائل سوبریٹ (کیمیائی کراس لنکر) کے ساتھ علاج کیا گیا تھا جس سے 33 کے ڈی اے کا ڈائمر اور 45 کے ڈی اے کا ٹرائمر حاصل ہوا تھا جبکہ اسے فوٹو میتھیونائن کے ساتھ علاج کیا گیا تھا جس سے ایک ہی سالماتی وزن (33 کے ڈی اے) کا ڈائمر اور دو پوٹیٹو ٹرائمر (50 کے ڈی اے اور 55 کے ڈی اے) حاصل ہوئے تھے۔ ایک بار ایم پی جی ای ایس-1 انفیکٹر (ایم ایف 63) متعارف کرایا گیا ؛ اس نے 50 کے ڈی اے اور 55 کے ڈی اے کمپلیکس کی تشکیل کو روک دیا تھا۔ کیمیائی کراس لنکر سے حاصل ہونے والا ڈائمر اور ٹرائمر انفیکٹر سے متاثر نہیں ہوا تھا۔ پھر بھی، فوٹو میتھیونائن اور نہ ہی ڈائسوکینیمیڈائل سوبریٹ نے سی او ایکس-2 اور ایم پی جی ای ایس-1 کے درمیان پروٹین-پروٹین کا کوئی تعامل نہیں دکھایا تھا اور یہ مختلف وجوہات کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ فوٹو میتھیونائن کے لیے ؛ اس وقت کم انضمام کی وجہ سے ہو سکتا ہے کیونکہ یہ 0.7 ٪ تھا۔ تو، ایم پی جی ای ایس-1 کے لیے ؛ اس میں 152 امینو ایسڈ ہوتے ہیں لہذا فی مونومر صرف ایک فوٹو میتھیونائن شامل کیا جائے گا۔ اس کا مطلب یہ بھی ہے کہ ایک مخصوص میتھیونائن کو تبدیل نہیں کیا جائے گا تاکہ ایم پی جی ای ایس-1 کی متنوع آبادی کے نتیجے میں مختلف کراس لنکنگ ہو۔ اگرچہ اس میں پروٹین-پروٹین کا کوئی تعامل نہیں دکھایا گیا تھا، لیکن اس کا استعمال اولیگومیرک ڈھانچے کا تعین کرنے کے اوپر سیل جھلی میں انفیکٹر سے متاثر پروٹین کی تشکیل میں ہونے والی تبدیلیوں کا پتہ لگانے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ ایسچریچیا کولی خلیات فوٹو میتھیونائن کو ایسچریچیا کولی خلیات میں ریکومبیننٹ پروٹین کو لیبل کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے ؛ حالانکہ عام طور پر میتھیونائن ایک نایاب امینو ایسڈ ہے لہذا اس کا مطلب ہے کہ یہ صرف محدود ساختی ڈیٹا دے سکتا ہے۔ بہر حال، فوٹو میتھیونائن کو Ca2 + ریگولیٹنگ پروٹین کیلمڈوولین (CaM جو کہ 17-kDa تھا) میں شامل کیا گیا تھا جس میں نو میتھیونائن ہوتے ہیں اور ماس سپیکٹرومیٹری (MS) کے ذریعے اس کا مطالعہ کیا جاتا ہے۔ جو چیز اس طریقہ کار کو مختلف بناتی ہے وہ یہ ہے کہ خلیوں میں شامل کرنے کے لیے ڈی ایم ای ایم (ڈولبیکو کا ماڈیفائیڈ ایگلز لمیٹنگ میڈیم) یا ڈائلائزڈ جنین کے مویشیوں کے سیرم کے بجائے معدنی نمک میڈیم کا استعمال کیا جاتا ہے۔ معدنی نمک میڈیم کے استعمال سے خلیوں کو شروع سے ہی اگانے کی اجازت ملی تاکہ دوسرے پروٹوکول کے ساتھ پیچیدہ مراحل کو ختم کیا جا سکے (خلیوں کو ایل بی میڈیم میں انکیوبیٹ کرنا، اس کے بعد دھونا، اور مزید ختم شدہ میڈیم میں انکیوبیٹ کرنا)، جس کا مطلب ہے کہ فوٹو میتھیونائن کو خلیوں کی نشوونما کے بالکل آغاز میں شامل کیا جا سکتا ہے جس کی پیداوار 30 فیصد سے زیادہ تھی۔ سیل کی نشوونما کے عمل کے دوران فوٹو میتھیونائن نے کوئی نقصان نہیں دکھایا تھا اور ایک بار یو وی-اے لائٹ کے ذریعے فوٹو ایکٹیویٹ ہونے کے بعد، ایم ایس کے اس بات کا تعین کرنے کے بعد کہ فوٹو میتھیونائن کی چوٹیوں پر سی اے ایم لیبل لگا ہوا تھا، سی اے ایم کے نو الگ الگ کراس لنک سائٹس تھے۔ فوٹو میتھیونائن کو نہ صرف تھری ڈی پروٹین کی ساخت کی نقشہ سازی، پروٹین پروٹین کے تعاملات کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، بلکہ اب پروٹین میں ہائیڈروفوبک علاقوں کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ حوالہ جات بائیو کیمسٹری کا پتہ لگانے کے طریقے فوٹو کیمسٹری الفا امینو ایسڈ امینو ایسڈ مشتق ڈیازیرائنز