Combined bisulfite restriction analysis
ஒருங்கிணைந்த பிசல்பைட் கட்டுப்பாடு பகுப்பாய்வு (அல்லது கோப்ரா) என்பது ஒரு மூலக்கூறு உயிரியல் நுட்பமாகும், இது மரபணு டிஎன்ஏவின் ஒரு சிறிய மாதிரியில் டிஎன்ஏ வரிசையில் ஒரு குறிப்பிட்ட மரபணு இருப்பிடத்தில் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் நிலைகளின் உணர்திறன் அளவை அனுமதிக்கிறது. இந்த நுட்பம் பைசல்பைட் வரிசைமுறையின் மாறுபாடு ஆகும், மேலும் பைசல்பைட் மாற்றத்தை அடிப்படையாகக் கொண்ட பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினையை கட்டுப்பாடு செரிமானத்துடன் ஒருங்கிணைக்கிறது. மைக்ரோடைசெக்டட் பாராஃபின்-உட்பொதிக்கப்பட்ட திசு மாதிரிகளிலிருந்து சிறிய அளவிலான மரபணு டி. என். ஏவை நம்பகத்தன்மையுடன் கையாள முதலில் உருவாக்கப்பட்டது, இந்த நுட்பம் பின்னர் புற்றுநோய் ஆராய்ச்சி மற்றும் எபிஜெனெடிக்ஸ் ஆய்வுகளில் பரவலாக பயன்படுத்தப்படுகிறது. செயல்முறை பைசல்பைட் சிகிச்சை ஆர்வமுள்ள மரபணு டிஎன்ஏ சோடியம் பைசல்பைட் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்படுகிறது, இது மெத்திலேஷன்-சார்ந்த வரிசை வேறுபாடுகளை அறிமுகப்படுத்துகிறது. சோடியம் பைசல்பைட் சிகிச்சையின் போது, மெத்திலேற்றப்படாத சைட்டோசின் எச்சங்கள் யூராசிலாக மாற்றப்படுகின்றன, அதே நேரத்தில் மெத்திலேட்டட் சைட்டோசின் எச்சங்கள் பாதிக்கப்படுவதில்லை. பிசிஆர் பெருக்கம் பிசல்பைட் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ பின்னர் பிசிஆர் பெருக்கப்படுகிறது, இதன் விளைவாக சைட்டோசின் எச்சங்கள் முதலில் மெத்திலேட்டட் நிலைகளிலும், தைமின் எச்சங்கள் முதலில் மெத்திலேட்டட் இல்லாத நிலையிலும் (அவை யூராசிலாக மாற்றப்பட்டன) உருவாகின்றன. இந்த கட்டத்தில் பயன்படுத்தப்படும் ப்ரைமர்களில் சிபிஜி தளங்கள் இல்லை (சைட்டோசின் மெத்திலேஷனின் பொதுவான இலக்கு), எனவே பெருக்க செயல்முறை மெத்திலேஷன் நிலையின் அடிப்படையில் வார்ப்புருக்களுக்கு இடையில் பாகுபாடு காட்டாது. அடுத்த கட்டத்தில் முழுமையான செரிமானத்தை உறுதிப்படுத்த பி. சி. ஆர் தயாரிப்புகள் சுத்திகரிக்கப்படுகின்றன. கட்டுப்பாடு செரிமானம் மேற்கண்ட படிகள் முறையே சைட்டோசின் எச்சம் முதலில் மெத்திலேட்டட் செய்யப்பட்டதா இல்லையா என்பதைப் பொறுத்து, டாக்ஐ (டிசிஜிஏ) மற்றும் பிஎஸ்டியுஐ (சிஜிசிஜி) போன்ற சிபிஜி கொண்ட கட்டுப்பாடு நொதி தளங்களின் மெத்திலேஷன் சார்ந்த தக்கவைப்பு அல்லது இழப்புக்கு வழிவகுக்கிறது. மேற்கண்ட கட்டத்தில் மெத்திலேஷன்-சுயாதீன பெருக்கம் காரணமாக, இதன் விளைவாக பி. சி. ஆர் தயாரிப்புகள் சிபிஜி கொண்ட கட்டுப்பாட்டு நொதி தளங்களை இழந்த அல்லது தக்கவைத்த துண்டுகளின் கலப்பு எண்ணிக்கையாக இருக்கும், அவற்றின் அந்தந்த சதவீதங்கள் மாதிரி டிஎன்ஏவில் உள்ள டிஎன்ஏ மெத்திலேஷனின் அசல் மட்டத்துடன் நேரடியாக தொடர்புபடுத்தப்படும். பி. சி. ஆர் தயாரிப்புகள் பின்னர் ஒரு கட்டுப்பாடு நொதியுடன் சிகிச்சையளிக்கப்படுகின்றன (எ. கா. BstUI), இது முதலில் மெத்திலேட்டட் செய்யப்பட்ட (CGCG) தளங்களை மட்டுமே பிளவுபடுத்தும், அதே நேரத்தில் முதலில் மெத்திலேட்டட் செய்யப்படாத (TGTG) தளங்களை விட்டுச்செல்லும். அனைத்து சி. பி. ஜி தளங்களும் முதலில் மெத்திலேற்றப்பட்டிருப்பதால் தக்கவைக்கப்படுவதை உறுதி செய்வதற்காக, முழுமையற்ற பைசல்பைட் மாற்றத்தின் எச்சம் அல்ல, எச். எஸ். பி 92 II போன்ற நொதிகளுடன் ஒரு கட்டுப்பாட்டு செரிமானம் செய்யப்படுகிறது, இது சி. ஏ. டி. ஜி வரிசையை அங்கீகரிக்கிறது, அவற்றில் எதுவும் பைசல்பைட் மாற்றத்திற்குப் பிறகு இருக்கக்கூடாது (சி. பி. ஜி அல்லாத மெத்திலேசனின் அரிய விதிவிலக்குடன்) எனவே பைசல்பைட் மாற்றம் முடிந்தால் பிளவு ஏற்படாது. அளவீடு செரிக்கப்பட்ட துண்டுகள் பின்னர் பாலிஅக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் பிரிக்கப்படுகின்றன, அவை ஒரு பெரிய செரிக்கப்படாத துண்டுடன் தொடர்புடைய பட்டைகள் மற்றும் செரிக்கப்பட்ட துண்டுகளுடன் தொடர்புடைய பல சிறிய பட்டைகள் எதிர்பார்க்கப்படுகின்றன. இந்த பட்டைகளில் உள்ள டிஎன்ஏவின் அளவை ஒரு பாஸ்போ இமேஜர் போன்ற சாதனம் மூலம் தீர்மானிக்க முடியும், அதன் பிறகு அசல் மாதிரியின் மெத்திலேஷன் சதவீதத்தை பின்வருமாறு கணக்கிட முடியும்ஃ பயன்பாடு மற்றும் பயன்பாடுகள் புற்றுநோய் ஆய்வுகளில் மரபணு ஊக்குவிப்பாளர்களில் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் மாற்றங்களுக்கான திரையிடல், அச்சிடப்பட்ட மரபணுக்களில் மாற்றப்பட்ட மெத்திலேஷன் வடிவங்களைக் கண்டறிதல் மற்றும் பாலூட்டிகளில் வளர்ச்சியின் போது மரபணுவில் மெத்திலேஷன் வடிவங்களை வகைப்படுத்துதல் போன்ற பல ஆராய்ச்சி அடிப்படையிலான பயன்பாடுகளில் கோப்ரா விரிவாகப் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது. மருத்துவத்தில், மாறுபட்ட டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் சம்பந்தப்பட்ட மனித நோயைக் கண்டறிய உதவும் ஒரு கருவியாக கோப்ரா பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஆராய்ச்சியாளர்கள் கோப்ராவை மரபணு முத்திரை கோளாறு ரஸ்ஸல்-சில்வர் நோய்க்குறியைக் கண்டறிவதில் உயர் செயல்திறன் கொண்ட திரவ குரோமடோகிராஃபியுடன் இணைந்து பயன்படுத்தினர், அங்கு அச்சிடப்பட்ட மரபணு எச் 19 இன் ஹைபோமெத்திலேஷன் 50 சதவீதம் வரை நோயாளிகளில் கோளாறுக்கு காரணமாகும். பலம் எளிய, வேகமான மற்றும் மலிவானதுஃ கோப்ராவில், பைசல்பைட் வரிசைமுறையைப் போலவே, கடினமான துணை குளோனிங் மற்றும் வரிசைமுறை தேவையில்லாமல் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் அளவுகள் எளிதாகவும் விரைவாகவும் அளவிடப்படுகின்றன. மதிப்பீடு நேரடியானது மற்றும் நிலையான மலிவான மூலக்கூறு உயிரியல் உலைகளுடன் செய்யப்படலாம். உயர் பொருந்தக்கூடிய தன்மைஃ பி. சி. ஆர் மற்றும் சுத்திகரிப்பு படிகள் காரணமாக, இந்த முறை மிகக் குறைந்த அளவு மரபணு டிஎன்ஏவுடன் மட்டுமல்லாமல், பாராஃபின் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரிகளுடனும் செயல்படுகிறது, இவை இரண்டும் பிற டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் அளவீட்டு நெறிமுறைகளில் சிக்கல்களாக இருக்கலாம். அளவுஃ இது மெத்திலேஷன்-குறிப்பிட்ட பி. சி. ஆருக்கு மாறாக உள்ளது, இது தரமானது. கோப்ரா மூலம், டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் நிலைகளை ஒரு குறிப்பிட்ட இடத்தில் நேரடியாக அளவிட முடியும், இது ஒரு மதிப்பீட்டிற்கு அதிக தகவல்களை வழங்குகிறது. உயர்-செயல்திறன் மாதிரி செயலாக்கத்திற்கான அளவிடுதல்ஃ கோப்ராவுடன், ஆர்வமுள்ள பல பகுதிகளை ஒரே கட்டுப்பாட்டு நொதியுடன் செரிக்கப்பட்ட தனித்தனி மாதிரிகளில் இணையாக செயலாக்கலாம். இது பைசல்பைட் வரிசைமுறை பகுப்பாய்விற்கு மாறாக உள்ளது, அங்கு ஒவ்வொரு பகுதியும் ஒரு இடத்துக்கு பல குளோன்களை வரிசைப்படுத்துவதன் மூலம் கடுமையாக ஆராயப்பட வேண்டும், அதிக நேரம் செலவாகும். ஒரு மதிப்பீட்டிற்கு பல கேள்விகள்ஃ ஒற்றை செரிமான மதிப்பீட்டில் பல சிபிஜி கொண்ட கட்டுப்பாட்டு தளங்களில் மெத்திலேஷன் நிலையை விசாரிக்க முடியும். பலவீனங்கள் மதிப்பீடு என்பது ஆர்வமுள்ள பகுதியில் தற்போதுள்ள கட்டுப்பாட்டு தளங்களைப் பயன்படுத்துவதற்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, மேலும் ஒரு குறிப்பிட்ட கட்டுப்பாட்டு தளத்தின் சூழலில் நிகழாத மெத்திலேஷன் மதிப்பீடு செய்யப்படாது. பி. சி. ஆருக்குப் பிறகு கட்டுப்பாடு நொதிகளால் முழுமையற்ற செரிமானம் பகுப்பாய்வை குழப்பலாம்ஃ முழுமையற்ற செரிமானம் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் இல்லாததைக் குறிக்கும் (எச். பி. ஏ. ஐ. ஐ போன்ற மெத்திலேஷன்-உணர்திறன் நொதியுடன் வெட்டப்பட்டால்). BstUI மாற்றப்படாத தளங்களில் வெட்ட முடியும் என்றும் அறியப்படுகிறது, இது மெத்திலேஷன் நிலைகளை மிகைப்படுத்துவதற்கு வழிவகுக்கிறது, எனவே HPAII இன் பயன்பாடு பெரும்பாலும் தேவைப்படுகிறது. சிக்கலான மாதிரிகளில், டிஎன்ஏ வரிசைப்படுத்தப்படாததால் செல்-வகை பன்முகத்தன்மை பகுப்பாய்வை குழப்பலாம், மாதிரியில் உள்ள வெவ்வேறு உயிரணுக்களின் வரிசைகளில் பன்முகத்தன்மை (அதாவது. சிஜி டைனியூக்ளியோடைடை சிஏ அல்லது சி. டி. க்கு மாற்றுவது போன்ற விசாரணை செய்யப்பட்ட பகுதியில் பிறழ்வுகளைப் பெற்ற ஒரு கட்டிக்குள் உள்ள வெவ்வேறு உயிரணு மக்கள் தொகை), செரிமானம் இல்லாததால் வெளிப்படையாக மெத்திலேட்டட் செய்யப்பட்ட பகுதிக்கு வழிவகுக்கும் கட்டுப்பாட்டு தளத்தை இழக்கும். இது கொடுக்கப்பட்ட மாதிரியில் டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் நிலைகளின் அளவீட்டை வளைக்கும். மாற்றீடுகள் பொதுவாக, கோப்ரா பெரும்பாலும் பிற டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வுகளுடன் இணைக்கப்படுகிறது, மேலும் இது ஆர்வமுள்ள ஒரு இடத்தின் ஆரம்ப திரையிடலில் அடிக்கடி பயன்படுத்தப்படுகிறது. மாற்றப்பட்ட மெத்திலேஷன் முறைகளை கோப்ரா பரிந்துரைத்தால், பைசல்பைட் வரிசைமுறை அல்லது எம். இ. டி. ஐ. பி போன்ற மிகவும் கடுமையான, உழைப்பு-தீவிர நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தலாம். டிஎன்ஏ மெத்திலேசனைக் கண்டறிய பாக்பியோ வரிசைமுறையையும் பயன்படுத்தலாம். குறிப்புகள் மூலக்கூறு உயிரியல் நுட்பங்கள்