Nuclear magnetic resonance spectroscopy of nucleic acids
நியூக்ளிக் அமிலம் என். எம். ஆர் என்பது டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏ போன்ற நியூக்ளிக் அமில மூலக்கூறுகளின் கட்டமைப்பு மற்றும் இயக்கவியல் பற்றிய தகவல்களைப் பெற நியூக்ளிக் காந்த அதிர்வு ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபியைப் பயன்படுத்துவதாகும். 100 நியூக்ளியோடைடுகள் வரையிலான மூலக்கூறுகளுக்கு இது பயனுள்ளதாக இருக்கும், மேலும் 2003 ஆம் ஆண்டு நிலவரப்படி, அறியப்பட்ட அனைத்து ஆர்என்ஏ கட்டமைப்புகளிலும் கிட்டத்தட்ட பாதி என்எம்ஆர் ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது. என்எம்ஆர் எக்ஸ்-ரே படிகவியலை விட நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது, இது உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட நியூக்ளிக் அமில கட்டமைப்பை தீர்மானிப்பதற்கான மற்றொரு முறையாகும், இதில் மூலக்கூறுகள் மூலக்கூறின் கட்டமைப்பு பண்புகளை பாதிக்கக்கூடிய ஒரு படிக ஜாலகத்தை விட அவற்றின் இயற்கையான கரைசல் நிலையில் காணப்படுகின்றன. என். எம். ஆர் உடன் இயக்கவியலை ஆராய்வதும் சாத்தியமாகும். இது படிகவியல் விட சற்றே குறைவான துல்லியமான மற்றும் விரிவான கட்டமைப்புகளின் செலவில் வருகிறது. நியூக்ளிக் அமிலம் என். எம். ஆர் புரத என். எம். ஆர் போன்ற நுட்பங்களைப் பயன்படுத்துகிறது, ஆனால் பல வேறுபாடுகளைக் கொண்டுள்ளது. நியூக்ளிக் அமிலங்கள் ஹைட்ரஜன் அணுக்களில் ஒரு சிறிய சதவீதத்தைக் கொண்டுள்ளன, அவை பொதுவாக என். எம். ஆரில் காணப்படும் அணுக்கள், மேலும் நியூக்ளிக் அமில இரட்டை ஹெலிக்ஸ்கள் கடினமானவை மற்றும் தோராயமாக நேரியல் என்பதால், அவை "நீண்ட தூர" தொடர்புகளைக் கொடுக்க தங்களைத் தாங்களே மடிக்காது. நியூக்ளிக் அமிலங்கள் புரதங்களை விட சிறிய வரம்பில் அதிர்வுகளைக் கொண்டுள்ளன, இதனால் நிறமாலை மிகவும் நெரிசலானது மற்றும் விளக்குவது கடினம். சோதனை முறைகள் இரு பரிமாண என். எம். ஆர் முறைகள் பெரும்பாலும் நியூக்ளிக் அமிலங்களுடன் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பிணைப்பு மூலம் அணுக்கரு இணைப்புகளைக் கண்டறிவதற்கான தொடர்பு ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (COSY) மற்றும் மொத்த ஒத்திசைவு பரிமாற்ற ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (TOCSY) மற்றும் விண்வெளியில் ஒருவருக்கொருவர் நெருக்கமாக இருக்கும் கருக்களுக்கு இடையிலான இணைப்புகளைக் கண்டறிய அணு ஓவர்ஹவுசர் விளைவு ஸ்பெக்ட்ரோஸ்கோபி (NOESY) ஆகியவை இதில் அடங்கும். பொதுவாக நியூக்ளிக் அமிலங்களுடன் செய்யப்படும் என்எம்ஆர் வகைகள் 1எச் என்எம்ஆர், 13சி என்எம்ஆர், 15என் என்எம்ஆர் மற்றும் 31பி என்எம்ஆர் ஆகும். இயற்கையான நியூக்ளிக் அமிலங்களில் எந்த ஃவுளூரின் அணுக்களும் இல்லாததால், 2 '-ஃப்ளூரோ-2'-டியோக்சியடெனோசின் போன்ற இயற்கைக்கு மாறான நியூக்ளியோடைடுகள் நியூக்ளிக் அமில இழையில் இணைக்கப்பட்டால் 19 எஃப் என். எம். ஆர் பயனுள்ளதாக இருக்கும். 1H மற்றும் 31P கிட்டத்தட்ட 100% இயற்கை மிகுதியைக் கொண்டுள்ளன, அதே நேரத்தில் 13C மற்றும் 15N குறைந்த இயற்கை மிகுதிகளைக் கொண்டுள்ளன. இந்த பிந்தைய இரண்டு கருக்களுக்கு, மூலக்கூறுகளுக்குள் விரும்பிய அணுக்களை ஐசோடோபிக் ரீதியாக வளப்படுத்தும் திறன் உள்ளது, ஒரே மாதிரியாகவோ அல்லது ஒரு தள-குறிப்பிட்ட முறையிலோ. ஐசோடோபிக் செறிவூட்டப்பட்ட சூழலில் வளர்க்கப்படும் பாக்டீரியாவிலிருந்து பெறப்பட்ட டிஎன்டிபிகள் அல்லது என்டிபிகளைப் பயன்படுத்தி பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை செய்வதன் மூலம், 13சி மற்றும்/அல்லது 15என் ஆகியவற்றில் ஒரே மாதிரியாக செறிவூட்டப்பட்ட நியூக்ளியோடைடுகளை உயிர்வேதியியல் முறைகள் மூலம் பெறலாம். பெயரிடப்பட்ட நியூக்ளியோசைடு பாஸ்போரமைடைட் மோனோமர் மற்றும் முழு இழையின் வேதியியல் தொகுப்பு மூலம் தள-குறிப்பிட்ட ஐசோடோப்பு செறிவூட்டல் செய்யப்பட வேண்டும்; இருப்பினும் இவை ஒருங்கிணைக்க கடினமாக மற்றும் விலை உயர்ந்தவை. நியூக்ளிக் அமிலங்கள் ஒப்பீட்டளவில் அதிக எண்ணிக்கையிலான புரோட்டான்களைக் கொண்டிருப்பதால், அவை கரைப்பான்-பரிமாற்றக்கூடியவை, நியூக்ளிக் அமிலம் என். எம். ஆர் பொதுவாக டி 2 ஓ கரைப்பானில் செய்யப்படவில்லை, இது மற்ற வகை என். எம். ஆரில் பொதுவானது. ஏனென்றால், கரைப்பானில் உள்ள டியூடேரியம் பரிமாற்றக்கூடிய புரோட்டான்களை மாற்றி அவற்றின் சமிக்ஞையை அணைக்கும். H2O ஒரு கரைப்பானாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் வலுவான கரைப்பான் சமிக்ஞையை அகற்ற பிற முறைகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, அதாவது சாதாரண துடிப்பு வரிசைக்கு முன் கரைப்பான் சமிக்ஞையை நிறைவு செய்தல் ("முன்னமைவு"), இது நியூக்ளிக் அமில புரோட்டான்களுடன் நிறைவுற்ற கரைப்பான் புரோட்டான்களின் பரிமாற்றத்தைத் தடுக்க குறைந்த வெப்பநிலையில் சிறப்பாக செயல்படுகிறது; அல்லது ஆர்வத்தின் அதிர்வுகளை மட்டுமே உற்சாகப்படுத்துகிறது ("தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட கிளர்ச்சி"), இது உச்ச வீச்சுகளை சிதைக்கும் கூடுதல், விரும்பத்தகாத விளைவைக் கொண்டுள்ளது. கட்டமைப்பு நிர்ணயம் பரிமாற்றக்கூடிய மற்றும் மாற்ற முடியாத புரோட்டான்கள் பொதுவாக அவற்றின் குறிப்பிட்ட சிகரங்களுக்கு இரண்டு சுயாதீன குழுக்களாக ஒதுக்கப்படுகின்றன. பரிமாற்றக்கூடிய புரோட்டான்களுக்கு, அவை பெரும்பாலும் அடிப்படை இணைப்பில் ஈடுபடும் புரோட்டான்களாகும், அருகிலுள்ள தளங்களுக்கு இடையிலான விண்வெளி தொடர்புகளைக் கண்டறிய NOESY ஐப் பயன்படுத்தலாம், இது ஒரு முழு இரட்டை மூலக்கூறையும் தொடர்ச்சியான நடைபயிற்சி மூலம் ஒதுக்க அனுமதிக்கிறது. மாற்ற முடியாத புரோட்டான்களுக்கு, அவற்றில் பல நியூக்ளிக் அமிலத்தின் சர்க்கரை பகுதியில் உள்ளன, COSY மற்றும் TOCSY ஆகியவை இணைக்கப்பட்ட கருக்களின் அமைப்புகளை அடையாளம் காண பயன்படுத்தப்படுகின்றன, அதே நேரத்தில் NOESY மீண்டும் சர்க்கரையை அடிப்பகுதியுடனும் ஒவ்வொரு அடிப்பகுதியையும் அதன் அண்டை அடிப்பகுதியுடனும் தொடர்புபடுத்த பயன்படுத்தப்படுகிறது. இரட்டை டிஎன்ஏ மாற்ற முடியாத புரோட்டான்களுக்கு, அடிப்பகுதியில் உள்ள H6/H8 புரோட்டான்கள் அண்டை தளங்களில் உள்ள அவற்றின் சகாக்களுடனும், சர்க்கரையில் உள்ள H1 'புரோட்டானுடனும் தொடர்புபடுத்தப்படுகின்றன, இது தொடர்ச்சியான நடைப்பயணத்தை செய்ய அனுமதிக்கிறது. ஆர்என்ஏவைப் பொறுத்தவரை, வேதியியல் அமைப்பு மற்றும் ஹெலிக்ஸ் வடிவவியலில் உள்ள வேறுபாடுகள் இந்த பணியை தொழில்நுட்ப ரீதியாக மிகவும் கடினமாக்குகின்றன, ஆனால் இன்னும் சாத்தியமாக்குகின்றன. தொடர்ச்சியான நடைபயிற்சி முறை இரட்டை அல்லாத ஹேலிகல் நியூக்ளிக் அமில கட்டமைப்புகளுக்கோ அல்லது Z-DNA வடிவத்திற்கோ சாத்தியமில்லை, இதனால் அதிர்வுகளை ஒதுக்குவது மிகவும் கடினம். கிளைகோசிடிக் பிணைப்பு கோணங்கள், டைஹெட்ரல் கோணங்கள் (கார்ப்லஸ் சமன்பாட்டைப் பயன்படுத்தி) மற்றும் சர்க்கரை பக்கர் இணக்கங்கள் போன்ற உள்ளூர் கட்டமைப்பு அம்சங்களைத் தீர்மானிக்க ஸ்பெக்ட்ரம், முக்கியமாக நொய்சி குறுக்கு-சிகரங்கள் மற்றும் இணைப்பு மாறிலிகள் ஆகியவற்றிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட அளவுருக்கள் பயன்படுத்தப்படலாம். அமினோ புரோட்டான் அதிர்வுகள் இருப்பது அல்லது இல்லாதது, அல்லது ஹைட்ரஜன் பிணைப்பின் குறுக்கே 15N அணுக்களுக்கு இடையில் இணைப்பது, அடிப்படை இணைப்பின் இருப்பு அல்லது இல்லாததைக் குறிக்கிறது. பெரிய அளவிலான கட்டமைப்பைப் பொறுத்தவரை, இந்த உள்ளூர் அளவுருக்கள் மற்ற கட்டமைப்பு அனுமானங்கள் அல்லது மாதிரிகளுடன் கூடுதலாக இருக்க வேண்டும், ஏனெனில் இரட்டை ஹெலிக்ஸ் கடந்து செல்லும்போது பிழைகள் சேர்கின்றன, மேலும் புரதங்களைப் போலல்லாமல், இரட்டை ஹெலிக்ஸ் ஒரு சிறிய உட்புறத்தைக் கொண்டிருக்கவில்லை மற்றும் அதன் மீது மீண்டும் மடிக்காது. இருப்பினும், நியூக்ளிக் அமில மூலக்கூறுகளில் பலவீனமான சீரமைப்பை விதிக்கும் ஒரு ஊடகத்தில் எஞ்சிய இருமுனை இணைப்பு சோதனைகள் மூலம் நீண்ட தூர நோக்குநிலை தகவல்களைப் பெறலாம். சமீபத்தில், நியூக்ளிக் அமிலங்களின் கட்டமைப்பை தீர்மானிக்க திட-நிலை என். எம். ஆர் முறை அறிமுகப்படுத்தப்பட்டுள்ளது. நெறிமுறை இரண்டு அணுகுமுறைகளைக் குறிக்கிறதுஃ ஆர்என்ஏவின் நியூக்ளியோடைடு வகை தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட லேபிளிங் மற்றும் ஹெட்டோரோ நியூக்ளியர் தொடர்பு சோதனைகளின் பயன்பாடு. வளைந்த ஹெலிக்ஸ், வாட்சன்-கிரிக் அல்லாத அடித்தள இணைத்தல் மற்றும் கோஆக்சியல் ஸ்டேக்கிங் போன்ற தரமற்ற வடிவவியல்களை ஆராய்வதற்கும் என். எம். ஆர் பயனுள்ளதாக இருக்கும். இயற்கை ஆர்என்ஏ ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகளின் கட்டமைப்பை ஆராய்வதில் இது குறிப்பாக பயனுள்ளதாக உள்ளது, அவை ஸ்டெம்-லூப்கள் மற்றும் சூடோக்னாட்ஸ் போன்ற சிக்கலான இணக்கங்களை பின்பற்ற முனைகின்றன. ஆர்என்ஏ மற்றும் உலோக அயனிகளுக்கு இடையிலான தொடர்புகளை அயனி பிணைப்பின் மீது இரசாயன மாற்றங்களில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் கவனிப்பது, பாரா காந்த அயனி இனங்களுக்கான கோடு விரிவடைவதைக் கவனிப்பது மற்றும் உலோக அயனிகளின் கரிம உலோகப் பிரதிபலிப்புகளுக்கான மூலக்கூறுகளுக்கிடையேயான NOE தொடர்புகளைக் கவனிப்பது உள்ளிட்ட பல முறைகளால் ஆராய முடியும். புரதங்கள் அல்லது மருந்துகள் போன்ற பிற மூலக்கூறுகளுடன் நியூக்ளிக் அமில மூலக்கூறுகள் பிணைக்கப்படுவதை ஆராய்வதற்கும் என். எம். ஆர் பயனுள்ளதாக இருக்கும். வேதியியல்-ஷிப்ட் மேப்பிங் மூலம் இதைச் செய்யலாம், இது மற்ற மூலக்கூறுகளின் பிணைப்பின் மீது எந்த அதிர்வுகள் மாற்றப்படுகின்றன என்பதைப் பார்க்கிறது, அல்லது பிணைப்பு மூலக்கூறுகளில் ஒன்று தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட நிறைவுற்றதாக இருக்கும் குறுக்கு-செறிவு சோதனைகள் மூலம், பிணைக்கப்பட்டால், செறிவு மற்ற மூலக்கூறுக்கு மாற்றப்படுகிறது. டுப்லெக்ஸ்-சிங்கிள் ஸ்ட்ராண்ட் சமநிலை மற்றும் டுப்லெக்ஸ்களுடன் பிற மூலக்கூறுகளின் பிணைப்பு விகிதங்கள் போன்ற இயக்கவியல் பண்புகள் சுழல்-லட்டிஸ் தளர்வு நேரம் T1 இல் அதன் விளைவின் மூலம் தீர்மானிக்கப்படலாம், ஆனால் இந்த முறைகள் 104-108 s−1 இன் இடைநிலை விகிதங்களுக்கு உணர்திறன் இல்லாதவை, இது திட-நிலை NMR போன்ற பிற முறைகளுடன் ஆராயப்பட வேண்டும். வளைத்தல் மற்றும் முறுக்குதல் போன்ற நியூக்ளிக் அமில இரட்டை ஹெலிக்ஸின் இயந்திர பண்புகளின் இயக்கவியலையும் என். எம். ஆர் பயன்படுத்தி ஆய்வு செய்யலாம். துடிப்பு புல சாய்வு என். எம். ஆர் சோதனைகள் பரவல் மாறிலிகளை அளவிட பயன்படுத்தப்படலாம். நியூக்ளிக் அமிலம் என். எம். ஆர் ஆய்வுகள் 1971 ஆம் ஆண்டின் முற்பகுதியில் நடத்தப்பட்டன, மேலும் அடிப்படை இணைத்தல் தொடர்புகளை ஆராய குறைந்த புலம் இமினோ புரோட்டான் அதிர்வுகளைப் பயன்படுத்துவதில் கவனம் செலுத்தியது. இந்த ஆரம்பகால ஆய்வுகள் டி. ஆர். என். ஏ மீது கவனம் செலுத்தியது, ஏனெனில் இந்த நியூக்ளிக் அமிலங்கள் மட்டுமே அந்த நேரத்தில் குறைந்த மூலக்கூறு எடையுடன் கிடைத்த மாதிரிகள், அவை என். எம். ஆர் நிறமாலை கோடு-அகலங்கள் நடைமுறையில் இருந்தன. அந்த நேரத்தில் கிடைத்த சிறந்த ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர்களைப் பயன்படுத்தி நீரிய கரைசலில் நம்பகத்தன்மையுடன் கவனிக்கக்கூடிய ஒரே புரோட்டான்கள் என்பதால் குறைந்த புல புரோட்டான்களில் ஆய்வு கவனம் செலுத்தியது. குறைந்த புலம் கொண்ட அமினோ புரோட்டான்களின் நிறமாலைகள் கரைசலில் உள்ள டிஆர்என்ஏவின் மூன்றாம் நிலை கட்டமைப்பிற்கான தடயங்களை வழங்குகின்றன என்பது விரைவாக உணரப்பட்டது. இரட்டை-ஹீலிக் டிஎன்ஏவின் முதல் என்எம்ஆர் ஸ்பெக்ட்ரம் 1977 ஆம் ஆண்டில் செயற்கை, 30-பேஸ்-ஜோடி இரட்டை ஹெலிக்ஸ் பயன்படுத்தி வெளியிடப்பட்டது. பூர்வீக டிஎன்ஏவில் கடுமையான கோடு-விரிவாக்கத்தை சமாளிக்க, இரட்டை-ஹீலிக் டிஎன்ஏவின் நிலைத்தன்மை நீளத்தைப் பற்றி அறிய சுத்தமாக சிதைந்த இயற்கை டிஎன்ஏ தயாரிக்கப்பட்டு ஆய்வு செய்யப்பட்டது. அதே நேரத்தில், இரட்டை ஹெலிக்ஸின் நெகிழ்வுத்தன்மை பற்றிய கூடுதல் நுண்ணறிவைப் பெற நியூக்ளியோசோம் கோர் துகள்கள் ஆய்வு செய்யப்பட்டன. கட்டுப்பாட்டு என்சைம்களால் செய்யப்பட்ட சீரான குறைந்த மூலக்கூறு எடை கொண்ட பூர்வீக-வரிசை டி. என். ஏ. வுக்கு முதல் என். எம். ஆர் ஸ்பெக்ட்ரம் 1981 இல் பதிவாகியது. இந்த வேலை உயர் புலத்தில் பெறப்பட்ட நியூக்ளிக் அமிலம் என். எம். ஆர் ஸ்பெக்ட்ராவின் முதல் அறிக்கையாகும். இரு பரிமாண என். எம். ஆர் ஆய்வுகள் 1982 ஆம் ஆண்டில் பதிவாகத் தொடங்கின, பின்னர், ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடு தொகுப்பு மற்றும் அதிநவீன கருவிகளின் வருகையுடன், பல விரிவான கட்டமைப்பு ஆய்வுகள் 1983 இல் தொடங்கி பதிவாகியுள்ளன. குறிப்புகள் அணுக்கரு காந்த அதிர்வு நிறமாலை அணுக்கரு அமிலங்கள் உயிர் இயற்பியல்