Electrophoretic mobility shift assay
எலக்ட்ரோபோரேடிக் மொபிலிட்டி ஷிப்ட் அஸ்ஸாய் (இஎம்எஸ்ஏ) அல்லது மொபிலிட்டி ஷிப்ட் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ், ஜெல் ஷிப்ட் அஸ்ஸாய், ஜெல் மொபிலிட்டி ஷிப்ட் அஸ்ஸாய், பேண்ட் ஷிப்ட் அஸ்ஸாய் அல்லது ஜெல் ரிடார்டேஷன் அஸ்ஸாய் என்றும் குறிப்பிடப்படுகிறது, இது புரதம்-டிஎன்ஏ அல்லது புரதம்-ஆர்என்ஏ தொடர்புகளைப் படிக்கப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு பொதுவான இணைப்பு எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் நுட்பமாகும். ஒரு புரதம் அல்லது புரதங்களின் கலவை கொடுக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏ வரிசையுடன் பிணைக்கும் திறன் கொண்டதா என்பதை இந்த செயல்முறை தீர்மானிக்க முடியும், மேலும் சில நேரங்களில் ஒன்றுக்கு மேற்பட்ட புரத மூலக்கூறுகள் பிணைப்பு வளாகத்தில் ஈடுபட்டுள்ளதா என்பதைக் குறிக்கலாம். ஜெல் ஷிப்ட் மதிப்பீடுகள் பெரும்பாலும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் துவக்கம், டிஎன்ஏ கேங் ரெப்ளிகேஷன், டிஎன்ஏ பழுது அல்லது ஆர்என்ஏ செயலாக்கம் மற்றும் முதிர்ச்சி, அதே போல் முன்-எம்ஆர்என்ஏ ஸ்ப்ளைசிங் ஆகியவற்றைப் படிக்கும்போது டிஎன்ஏஸ் ஃபுட்பிரிண்டிங், ப்ரைமர் எக்ஸ்டென்ஷன் மற்றும் விளம்பரதாரர்-ஆய்வு சோதனைகளுடன் ஒரே நேரத்தில் விட்ரோவில் செய்யப்படுகின்றன. முன்னோடிகள் முந்தைய இலக்கியங்களில் காணப்பட்டாலும், பெரும்பாலான தற்போதைய மதிப்பீடுகள் கார்னர் மற்றும் ரெவ்ஸின் மற்றும் ஃப்ரைட் மற்றும் கிரோதர்ஸ் ஆகியோரால் விவரிக்கப்பட்ட முறைகளை அடிப்படையாகக் கொண்டவை. தத்துவம் ஒரு இயக்கம் மாற்ற மதிப்பீடு என்பது ஒரு புரோட்டீன்-டிஎன்ஏ அல்லது புரோட்டீன்-ஆர்என்ஏ கலவையை ஒரு பாலியாக்ரிலாமைடு அல்லது அகரோஸ் ஜெல்லில் ஒரு குறுகிய காலத்திற்கு (15 முதல் 20 சென்டிமீட்டர் ஜெல்லுக்கு சுமார் 1.5-2 எச்ஆர்) மின்காந்தமாக பிரிப்பதாகும். வெவ்வேறு மூலக்கூறுகள் (மற்றும் அவற்றின் சேர்க்கைகள்) ஜெல் வழியாக நகரும் வேகம் அவற்றின் அளவு மற்றும் சார்ஜ் மற்றும் ஒரு சிறிய அளவிற்கு, அவற்றின் வடிவத்தால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது (ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸைப் பார்க்கவும்). கட்டுப்பாட்டு பாதை (புரதம் இல்லாத டிஎன்ஏ ஆய்வு) வரம்பற்ற டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏ துண்டுடன் தொடர்புடைய ஒற்றை பட்டையைக் கொண்டிருக்கும். இருப்பினும், புரதம் துண்டு துண்டுடன் பிணைக்கும் திறன் கொண்டது என்று கருதினால், ஒரு புரதத்துடன் பிணைக்கும் பாதையில் மற்றொரு பட்டை இருக்கும், இது புரதத்துடன் பிணைக்கப்பட்ட நியூக்ளிக் அமில ஆய்வின் பெரிய, குறைந்த நடமாடும் வளாகத்தைக் குறிக்கும், இது ஜெல்லில் 'மாற்றப்படுகிறது' (ஏனெனில் அது மிகவும் மெதுவாக நகர்ந்துள்ளது). சரியான சோதனை நிலைமைகளின் கீழ், டிஎன்ஏ (அல்லது ஆர்என்ஏ) மற்றும் புரதத்திற்கு இடையிலான தொடர்பு உறுதிப்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் ஜெல்லில் பிணைக்கப்படாத நியூக்ளிக் அமிலத்துடன் பிணைக்கப்பட்டுள்ள விகிதம் பிணைப்பு எதிர்வினை ஜெல்லுக்குள் நுழையும் போது இலவச மற்றும் பிணைக்கப்பட்ட ஆய்வு மூலக்கூறுகளின் பகுதியை பிரதிபலிக்கிறது. இந்த நிலைத்தன்மை ஒரு "கேஜிங் விளைவு" காரணமாகும், அதில் ஜெல் மேட்ரிக்ஸால் சூழப்பட்ட புரதம், அவை மீண்டும் இணைவதற்கு முன்பு ஆய்விலிருந்து விலகி பரவ முடியாது. புரதம் மற்றும் ஆய்வின் தொடக்க செறிவுகள் தெரிந்தால், மற்றும் வளாகத்தின் ஸ்டோச்சியோமெட்ரி தெரிந்தால், நியூக்ளிக் அமில வரிசைக்கான புரதத்தின் வெளிப்படையான தொடர்பு தீர்மானிக்கப்படலாம். ஜெல் நிலைமைகளின் கீழ் சிக்கலானது மிக நீண்ட காலம் வாழவில்லை என்றால், அல்லது எலக்ட்ரோபோரேசிஸின் போது விலகல் கணக்கில் எடுத்துக் கொள்ளப்படாவிட்டால், பெறப்பட்ட எண் ஒரு வெளிப்படையான Kd ஆகும். புரதத்தின் செறிவு அறியப்படாவிட்டாலும், சிக்கலான ஸ்டோச்சியோமெட்ரி என்றால், டிஎன்ஏ ஆய்வின் செறிவை அதிகரிப்பதன் மூலம் புரதத்தின் செறிவை தீர்மானிக்க முடியும், மேலும் அதிகரிப்புகள் புரதத்தின் பின்னத்தை அதிகரிக்காது. அதே ஜெல்லில் இயங்கும் ஃப்ரீ ப்ரோப்பின் நிலையான நீர்த்தல்களின் தொகுப்புடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம், புரதத்தின் மோல்களின் எண்ணிக்கையை கணக்கிட முடியும். மாறுபாடுகள் மற்றும் சேர்த்தல்கள் புரதத்தை அங்கீகரிக்கும் ஒரு ஆன்டிபாடி இந்த கலவையில் சேர்க்கப்படலாம், இது அதிக மாற்றத்துடன் இன்னும் பெரிய வளாகத்தை உருவாக்குகிறது. இந்த முறை ஒரு சூப்பர் ஷிப்ட் மதிப்பீடு என்று குறிப்பிடப்படுகிறது, மேலும் புரதத்தில் உள்ள ஒரு புரதத்தை சந்தேகத்திற்கு இடமின்றி அடையாளம் காண பயன்படுத்தப்படுகிறது-நியூக்ளிக் அமில வளாகம். பெரும்பாலும், பிணைப்பு புரதத்திற்கான மிகவும் சாதகமான பிணைப்பு வரிசையை தீர்மானிக்க ஒரு போட்டியாளரான ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுடன் ஒரு கூடுதல் பாதை இயக்கப்படுகிறது. வரையறுக்கப்பட்ட வரிசையின் வெவ்வேறு ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகளின் பயன்பாடு போட்டியின் மூலம் துல்லியமான பிணைப்பு தளத்தை அடையாளம் காண அனுமதிக்கிறது (வரைபடத்தில் காட்டப்படவில்லை). போட்டி மதிப்பீட்டின் மாறுபாடுகள் பிணைப்பின் தனித்துவத்தை அளவிடுவதற்கும், இணைப்பு மற்றும் விலகல் இயக்கவியலை அளவிடுவதற்கும் பயனுள்ளதாக இருக்கும். எனவே, கொடுக்கப்பட்ட புரதத்தை உண்மையில் பிணைக்கும் ஒலிகோ நியூக்ளியோடைட்களைத் தேர்ந்தெடுக்க ஒரு செலெக்ஸ் பரிசோதனையின் ஒரு பகுதியாக ஈ. எம். எஸ். ஏ பயன்படுத்தப்படலாம். டிஎன்ஏ-புரத பிணைப்பு இன் விட்ரோவில் தீர்மானிக்கப்பட்டவுடன், பல வழிமுறைகள் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணியை அடையாளம் காண்பதற்கான தேடலைக் குறைக்கலாம். ஆர்வமுள்ள டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிக்கான ஒருமித்த வரிசை ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகள் பிணைப்புக்கு போட்டியிட முடியும், மாற்றப்பட்ட பட்டையை நீக்குகிறது, மேலும் சூப்பர் ஷிப்ட் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட வேண்டும். கணிக்கப்பட்ட ஒருமித்த வரிசை பிணைப்புக்கு போட்டியிடத் தவறினால், டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணியை அடையாளம் காண்பது மல்டிபிளெக்ஸ் போட்டியாளர் ஈ. எம். எஸ். ஏ (எம். சி-ஈ. எம். எஸ். ஏ) மூலம் உதவப்படலாம், இதன் மூலம் ஒவ்வொரு எதிர்வினையிலும் பெரிய அளவிலான ஒருமித்த வரிசைமுறைகள் மல்டிபிளெக்ஸ் செய்யப்படுகின்றன, மேலும் ஒரு தொகுப்பு பிணைப்புக்கு போட்டியிடும் இடத்தில், இந்த தொகுப்பிலிருந்து தனிப்பட்ட ஒருமித்த வரிசைமுறைகள் மேலும் எதிர்வினையில் இயக்கப்படுகின்றன. காட்சிப்படுத்தல் நோக்கங்களுக்காக, நியூக்ளிக் அமில துண்டு பொதுவாக கதிரியக்க, ஒளிரும் அல்லது பயோட்டின் லேபிளுடன் பெயரிடப்படுகிறது. நிலையான எத்திடியம் புரோமைடு கறைகள் இந்த முறைகளை விட குறைவான உணர்திறன் கொண்டவை, மேலும் இந்த சோதனைகளில் சிறிய அளவிலான நியூக்ளிக் அமிலம் அல்லது ஒற்றை இழையுள்ள நியூக்ளிக் அமிலம் (கள்) பயன்படுத்தப்பட்டால் நியூக்ளிக் அமிலத்தைக் கண்டறியும் உணர்திறன் இருக்காது. பயோட்டின் லேபிளைப் பயன்படுத்தும் போது, டிஎன்ஏ துண்டைக் கண்டறிய ஹார்ஸ்ரடிஷ் பெராக்ஸிடேஸ் போன்ற நொதியுடன் இணைக்கப்பட்ட ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஐசோடோபிக் டிஎன்ஏ லேபிளிங் புரத பிணைப்பு உறவில் சிறிய அல்லது எந்த விளைவையும் ஏற்படுத்தாது என்றாலும், ஃப்ளுரோபோர்கள் அல்லது பயோட்டின் உள்ளிட்ட ஐசோடோபிக் அல்லாத லேபிள்களைப் பயன்படுத்துவது ஆர்வமுள்ள புரதத்தின் தொடர்புகளின் தொடர்பு மற்றும்/அல்லது ஸ்டோச்சியோமெட்ரியை மாற்றும். ஃப்ளோரோஃபோர்-அல்லது பயோட்டின்-லேபிள் செய்யப்பட்ட ஆய்வு மற்றும் அதே வரிசையின் பெயரிடப்படாத டிஎன்ஏ இடையேயான போட்டி, லேபிள் பிணைப்பு இணைப்பு அல்லது ஸ்டோச்சியோமெட்ரியை மாற்றுகிறதா என்பதை தீர்மானிக்க பயன்படுத்தப்படலாம். குறிப்புகள் வெளிப்புற இணைப்புகள் கெமிலுமினென்சென்ட் ஜெல் ஷிப்ட் நெறிமுறை மரபியல் நுட்பங்கள் மூலக்கூறு மரபியல் மூலக்கூறு உயிரியல் புரத முறைகள் புரோட்டியோமிக்ஸ் பகுப்பாய்வு வேதியியல் ஆய்வக நுட்பங்கள் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் உயிரியல் நுட்பங்கள் மற்றும் கருவிகள்