Tandem affinity purification
டான்டெம் அஃபினிட்டி பியூரிஃபிகேஷன் (டிஏபி) என்பது புரத-புரத தொடர்புகளைப் படிப்பதற்கான நோயெதிர்ப்பு குறைபாட்டு அடிப்படையிலான பியூரிஃபிகேஷன் நுட்பமாகும். குறிக்கோள் என்னவென்றால், ஒரு உயிரணுவிலிருந்து ஆர்வமுள்ள புரதத்தை மட்டுமே பிரித்தெடுப்பது, அது தொடர்பு கொள்ளும் வேறு எந்த புரதங்களுடனும் சிக்கலானது. டிஏபி இரண்டு வகையான அகரோஸ் மணிகளைப் பயன்படுத்துகிறது, அவை ஆர்வமுள்ள புரதத்துடன் பிணைக்கப்படுகின்றன, மேலும் அவை செல் லைசேட்டிலிருந்து மையவிலக்கு மூலம் பிரிக்கப்படலாம், சம்பந்தப்பட்ட வளாகங்களைத் தொந்தரவு செய்யாமல், சிதைக்காமல் அல்லது மாசுபடுத்தாமல். ஆர்வமுள்ள புரதத்தை மணிகளுடன் பிணைக்க, அது வடிவமைக்கப்பட்ட துண்டு, டிஏபி குறிச்சொல்லுடன் குறிக்கப்படுகிறது. அசல் டிஏபி முறை ஆய்வின் கீழ் உள்ள புரதத்தின் சி-முனையத்துடன் டிஏபி குறிச்சொல்லை இணைப்பதை உள்ளடக்கியது. டிஏபி குறிச்சொல் மூன்று கூறுகளைக் கொண்டுள்ளதுஃ ஒரு கால்மோடுலின் பிணைப்பு பெப்டைட் (சிபிபி), டிஇவி புரோட்டீஸ் பிளவு தளம் மற்றும் இரண்டு புரோட்டீன் ஏ களங்கள், அவை ஐஜிஜியுடன் இறுக்கமாக பிணைக்கப்படுகின்றன (ஒரு டிஏபி குறிச்சொல்லை ஒரு வகை எபிடோப் குறிச்சொல்லாக ஆக்குகிறது). டிஏபி கொள்கை முதன்முதலில் வெளியிடப்பட்டதிலிருந்து பல குறிச்சொல்/மணிகள்/இலுவென்ட் சேர்க்கைகள் முன்மொழியப்பட்டுள்ளன. மாறுபடும் குறிச்சொற்கள் இந்த குறிச்சொல் சி-முனைய டிஏபி குறிச்சொல் என்றும் அழைக்கப்படுகிறது, ஏனெனில் ஒரு என்-முனைய பதிப்பும் கிடைக்கிறது. இருப்பினும், விவரிக்கப்பட வேண்டிய முறை ஒரு சி-டெர்மினல் குறிச்சொல்லின் பயன்பாட்டைக் கருதுகிறது, இருப்பினும் முறையின் பின்னணியில் உள்ள கொள்கை இன்னும் அப்படியே உள்ளது. 1990 களின் பிற்பகுதியில் ஐரோப்பிய மூலக்கூறு உயிரியல் ஆய்வகத்தில் பணிபுரியும் ஒரு ஆராய்ச்சிக் குழுவால் வரலாறு டிஏபி குறிச்சொல் கண்டுபிடிக்கப்பட்டது (ரிகாட் மற்றும் பலர், 1999, புயிக் மற்றும் பலர், 2001) மற்றும் புரோட்டியோம் ஆய்வுக்கான ஒரு புதிய கருவியாக முன்மொழியப்பட்டது. இது பல புரதச் சேர்மங்களை வகைப்படுத்த குழுவால் பயன்படுத்தப்பட்டது (ரிகாட் மற்றும் பலர், 1999, காஸ்பரி மற்றும் பலர். 1999, பவுரெட் மற்றும் பலர், 2000, புயிக் மற்றும் பலர், 2001). இந்த நுட்பத்தின் முதல் பெரிய அளவிலான பயன்பாடு 2002 ஆம் ஆண்டில் இருந்தது, இதில் ஆராய்ச்சிக் குழு புரோட்டியோமிக்ஸ் நிறுவனமான செல்ஸோமின் விஞ்ஞானிகளுடன் இணைந்து ஒரு ஈஸ்ட் செல்லில் 230 க்கும் மேற்பட்ட பல புரத வளாகங்களின் தொடர்புகளின் காட்சி வரைபடத்தை உருவாக்கி ஒவ்வொரு புரதத்திற்கும் டிஏபி குறிச்சொல்லை முறையாகக் குறிப்பிட்டு உருவாக்கியது. தாவரங்களில் டிஏபி குறிச்சொல் தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்துவது பற்றிய முதல் வெற்றிகரமான அறிக்கை 2004 இல் வந்தது (ரோஹில்லா மற்றும் பலர், 2004,) செயல்முறை புரவலன் உயிரணுக்களில் இணைவு புரதத்தை அறிமுகப்படுத்தக்கூடிய சில முறைகள் உள்ளன. புரவலன் ஈஸ்ட் என்றால், முறைகளில் ஒன்று பிளாஸ்மிட்களைப் பயன்படுத்துவதாக இருக்கலாம், இது இறுதியில் புரவலனுக்குள் இணைவு புரதத்தை மொழிபெயர்க்கிறது. எந்த முறை பயன்படுத்தப்பட்டாலும், இணைவு புரதத்தின் வெளிப்பாட்டை அதன் இயற்கையான நிலைக்கு முடிந்தவரை நெருக்கமாக பராமரிப்பது சிறந்தது. இணைவு புரதம் புரவலனுக்குள் மொழிபெயர்க்கப்பட்டவுடன், அது மற்ற புரதங்களுடன் தொடர்பு கொள்ளும், இது டிஏபி குறிச்சொல்லால் பாதிக்கப்படாத வகையில் இருக்கும். அதைத் தொடர்ந்து, குறிக்கப்பட்ட புரதம் (அதன் பிணைப்பு கூட்டாளர்களுடன்) ஒரு இணைப்பு தேர்வு செயல்முறையைப் பயன்படுத்தி மீட்டெடுக்கப்படுகிறது. சேர்க்கப்பட்ட முதல் வகை மணிகள் இம்யூனோகுளோபூலின் ஜி உடன் பூசப்பட்டுள்ளன, இது டிஏபி குறிச்சொல்லின் வெளிப்புற முனையுடன் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது. மணிகள், ஆர்வமுள்ள புரதங்களுடன், மையவிலக்கு மூலம் லைசேட்டிலிருந்து பிரிக்கப்படுகின்றன. புரதங்கள் பின்னர் மணிகளிலிருந்து ஒரு நொதி (டி. இ. வி புரோட்டீஸ்) மூலம் வெளியிடப்படுகின்றன, இது நடுவில் உள்ள டி. இ. வி பிளவு தளத்தில் குறிச்சொல்லை உடைக்கிறது. இந்த முதல் சுத்திகரிப்பு நடவடிக்கைக்குப் பிறகு, வெளியிடப்பட்ட புரதங்களில் இரண்டாவது வகை மணிகள் (கால்மோடுலின் பூசப்பட்டவை) சேர்க்கப்படுகின்றன, இது புரதங்களில் உள்ள டிஏபி குறிச்சொல்லின் மீதமுள்ள துண்டுடன் தலைகீழாக பிணைக்கப்படுகிறது. மணிகள் மீண்டும் மையவிலக்கு மூலம் பிரிக்கப்படுகின்றன, மேலும் அசுத்தங்கள் மற்றும் டி. இ. வி புரோட்டீஸை அகற்றுகின்றன. இறுதியாக, மணிகள் ஈ. ஜி. டி. ஏ ஆல் வெளியிடப்படுகின்றன, ஆர்வமுள்ள புரதம், அதன் பிணைக்கப்பட்ட புரத கூட்டாளர்கள் மற்றும் டி. ஏ. பி குறிச்சொல்லின் மீதமுள்ள சிபிபி துண்டு ஆகியவற்றை மட்டுமே கொண்ட பூர்வீக எலுவேட்டை விட்டுச் செல்கின்றன. புரதத்தின் பிணைப்பு கூட்டாளிகளை அடையாளம் காண ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி நேட்டிவ் எலுவேட் பகுப்பாய்வு செய்யப்படலாம். நன்மைகள் இந்த முறையின் ஒரு நன்மை என்னவென்றால், சிக்கலான கலவை பற்றிய முன் அறிவு இல்லாமல் விவோவில் புரத கூட்டாளர்களின் உண்மையான அளவு நிர்ணயம் இருக்க முடியும். இது செயல்படுத்த எளிதானது மற்றும் பெரும்பாலும் அதிக விளைச்சலை வழங்குகிறது. புரத புரத தொடர்புகளைப் படிப்பதில் உள்ள தடைகளில் ஒன்று இலக்கு புரதத்தின் மாசுபாடு ஆகும், குறிப்பாக அதைப் பற்றி நமக்கு முன் அறிவு இல்லாதபோது. டிஏபி இலக்கு புரதத்தை சுத்திகரிக்க ஒரு பயனுள்ள மற்றும் மிகவும் குறிப்பிட்ட வழிமுறைகளை வழங்குகிறது. 2 தொடர்ச்சியான இணைப்பு சுத்திகரிப்புகளுக்குப் பிறகு, எலிவேட்டில் அசுத்தங்கள் தக்கவைக்கப்படுவதற்கான வாய்ப்பு கணிசமாகக் குறைகிறது. இருப்பினும், ஒரு புரதத்தில் சேர்க்கப்பட்ட ஒரு குறிச்சொல் புதிய புரதத்தை அதன் தொடர்பு கூட்டாளர்களுடன் பிணைப்பதை மறைக்கும் வாய்ப்பும் உள்ளது. கூடுதலாக, குறிச்சொல் புரத வெளிப்பாட்டு அளவுகளையும் பாதிக்கலாம். மறுபுறம், குறிச்சொல் இணைப்பு மணிகளுக்கு போதுமான அளவு வெளிப்படுத்தப்படாமல் இருக்கலாம், எனவே முடிவுகளை வளைக்கிறது. டி. இ. வி புரோட்டீஸ் மூலம் புரதங்கள் பிளவுபடுவதற்கான வாய்ப்பும் இருக்கலாம், இருப்பினும் டி. இ. வி புரோட்டீஸின் உயர் குறிப்பிட்ட தன்மையைக் கருத்தில் கொண்டு இது அடிக்கடி ஏற்பட வாய்ப்பில்லை. இந்த முறை குறைந்தது 2 சுற்று கழுவுதலை உள்ளடக்கியது என்பதால், ஈஸ்ட் இரண்டு-கலப்பின முறை போலல்லாமல் அல்லது ஒளி-எதிர்வினை அமினோ அமில ஒப்புமைகளுடன் விவோ குறுக்கு இணைப்பைப் போலல்லாமல், நிலையற்ற புரத தொடர்புகளைத் திரையிட இது பொருத்தமானதாக இருக்காது. இருப்பினும், இது நிலையான புரத தொடர்புகளைச் சோதிப்பதற்கான ஒரு நல்ல முறையாகும், மேலும் புரதச் சேர்மம் எத்தனை முறை சுத்திகரிக்கப்படுகிறது என்பதைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம் பல்வேறு அளவிலான விசாரணைகளை அனுமதிக்கிறது. பயன்பாடுகள் 2002 ஆம் ஆண்டில், டிஏபி குறிச்சொல் முதன்முதலில் வெகுஜன நிறமாலையுடன் ஒரு பெரிய அளவிலான அணுகுமுறையில் பல புரத வளாகங்களை வகைப்படுத்துவதன் மூலம் ஈஸ்டின் புரோட்டியோமிக்ஸை முறையாக பகுப்பாய்வு செய்ய பயன்படுத்தப்பட்டது. இந்த ஆய்வில் 491 வளாகங்கள் கண்டுபிடிக்கப்பட்டன, அவற்றில் 257 முற்றிலும் புதியவை. மீதமுள்ளவர்கள் மற்ற ஆராய்ச்சிகளிலிருந்து நன்கு அறிந்திருந்தனர், ஆனால் இப்போது அவை அனைத்தும் புதிய கூறுகளைக் கொண்டிருப்பது கண்டறியப்பட்டது. ஒரு சிக்கலான வலையமைப்பில் செயல்பாட்டில் உள்ள அனைத்து புரத கூறுகளையும் தொடர்புபடுத்தும் வரைபடத்தை அவர்கள் வரைந்தனர். பல புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுகளும் டிஏபி குறிச்சொல்லின் பயன்பாட்டை உள்ளடக்கியது. ஈ. எம். பி. ஓ (டிசீம்போவ்ஸ்கி, 2004) நடத்திய ஒரு ஆராய்ச்சியில் அணு முன்-எம். ஆர். என். ஏ தக்கவைப்பு மற்றும் பிளவுபடுத்தலுக்குத் தேவையான ஒரு புதிய சிக்கலை அடையாளம் கண்டார். அவர்கள் மற்ற 3 துணை அலகுகள் (ஸ்னு17பி, பட்13பி மற்றும் பிஎம்எல்1பி) கொண்ட ஒரு புதிய ட்ரைமெரிக் வளாகத்தை சுத்தப்படுத்தியுள்ளனர், மேலும் இந்த துணை அலகுகள் நம்பகத்தன்மைக்கு அவசியமில்லை, ஆனால் முன்-எம்ஆர்என்ஏவின் திறமையான பிளவுபடுத்தலுக்கு (இன்ட்ரான்களை அகற்றுவதற்கு) தேவை என்பதைக் கண்டறிந்துள்ளனர். 2006 ஆம் ஆண்டில், ஃப்ளீஷர் மற்றும் பலர். யூகாரியோடிக் ரைபோசோமல் வளாகங்களுடன் தொடர்புடைய புரதங்களை முறையாக அடையாளம் காணப்பட்டது. ஈஸ்ட் ரைபோசோமல் காம்ப்ளக்ஸ்களை அடையாளம் காண அவர்கள் பன்முக மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி புரோட்டியோமிக் திரைகளைப் பயன்படுத்தினர், பின்னர் இந்த புரதங்கள் அனைத்தையும் செயல்பாட்டுடன் இணைக்க டிஏபி குறிச்சொல்லைப் பயன்படுத்தினர். பிற எபிடோப்-டேக் சேர்க்கைகள் மல்டிப்ரோடைன் வளாகங்களின் டாண்டம்-அஃபினிட்டி சுத்திகரிப்பு கொள்கை ரிகௌட் மற்றும் பலர் அசல் படைப்பில் பயன்படுத்திய சிபிபி மற்றும் புரோட்டீன் ஏ குறிச்சொற்களின் கலவையுடன் மட்டுப்படுத்தப்படவில்லை. (1999). எடுத்துக்காட்டாக, பாலூட்டி உயிரணுக்களில் இருந்து ஏராளமான புரதச் சேர்மங்களை சுத்திகரிக்க நகடானி குழுவால் 2000 ஆம் ஆண்டு முதல் எஃப். எல். ஏ. ஜி-மற்றும் எச். ஏ-குறிச்சொற்களின் கலவை பயன்படுத்தப்படுகிறது. டிஏபி கொள்கை வெளியிடப்பட்டதிலிருந்து பல குறிச்சொல் சேர்க்கைகள் முன்மொழியப்பட்டுள்ளன. உயிர்வேதியியல் பிரிப்பு செயல்முறைகள் புரத-புரத தொடர்பு மதிப்பீடுகள்