GAL4/UAS system
GAL4-UAS அமைப்பு என்பது பழ ஈ போன்ற உயிரினங்களில் மரபணு வெளிப்பாடு மற்றும் செயல்பாட்டைப் படிக்கப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு உயிர்வேதியியல் முறையாகும். 1988 ஆம் ஆண்டில் ஹிட்டோஷி காகிதானி மற்றும் மார்க் ப்தாஷ்னே மற்றும் நிக்கோலஸ் வெப்ஸ்டர் மற்றும் பியர் சாம்பன் ஆகியோரின் கண்டுபிடிப்பின் அடிப்படையில், யுஏஎஸ் வரிசைகளுடன் கால் 4 பிணைப்பு மரபணு வெளிப்பாட்டை செயல்படுத்துகிறது. இந்த முறை 1993 ஆம் ஆண்டில் ஆண்ட்ரியா பிராண்ட் மற்றும் நோர்பர்ட் பெர்ரிமோன் ஆகியோரால் ஈக்களில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டது, மேலும் இது மரபணுக்களின் வெளிப்பாட்டைப் படிப்பதற்கான ஒரு சக்திவாய்ந்த நுட்பமாகக் கருதப்படுகிறது. இந்த அமைப்பு இரண்டு பகுதிகளைக் கொண்டுள்ளதுஃ ஈஸ்ட் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஆக்டிவேட்டர் புரதமான கால் 4 ஐ குறியாக்கம் செய்யும் கால் 4 மரபணு, மற்றும் யுஎஎஸ் (அப்ஸ்ட்ரீம் ஆக்டிவேஷன் சீக்வென்ஸ்), இது மரபணு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை செயல்படுத்த GAL 4 குறிப்பாக பிணைக்கிறது. கண்ணோட்டம் கால் 4 அமைப்பு எந்த உயிரணுக்கள் ஒரு மரபணு அல்லது புரதத்தை வெளிப்படுத்துகின்றன என்பதையும், இந்த அறிவை பரிசோதகர் என்ன செய்ய விரும்புகிறார் என்பதையும் வரையறுக்கும் சிக்கல்களைப் பிரிக்க அனுமதிக்கிறது. மரபியல் வல்லுநர்கள் மாதிரி உயிரினங்களின் (பொதுவாக பழ ஈக்கள்) மரபணு மாறுபாடுகளை உருவாக்கியுள்ளனர், அவை GAL4 கோடுகள் என்று அழைக்கப்படுகின்றன, அவை ஒவ்வொன்றும் விலங்குகளின் திசுக்களின் சில துணைக்குழுக்களில் GAL4 ஐ வெளிப்படுத்துகின்றன. எடுத்துக்காட்டாக, சில கோடுகள் தசை உயிரணுக்களில் மட்டுமே GAL4 ஐ வெளிப்படுத்தலாம், அல்லது நரம்புகளில் மட்டுமே, அல்லது ஆண்டெனாவில் மட்டுமே, மற்றும் பல. குறிப்பாக பழ ஈக்களுக்கு, பல்லாயிரக்கணக்கான இத்தகைய கோடுகள் உள்ளன, விலங்குகளின் ஒரு குறிப்பிட்ட துணைக்குழுவில் மட்டுமே GAL4 ஐ வெளிப்படுத்துவது மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கும்-ஒருவேளை, எடுத்துக்காட்டாக, ஈயின் மூளையின் இரண்டு குறிப்பிட்ட பெட்டிகளை இணைக்கும் நியூரான்கள் மட்டுமே. இந்த உயிரணுக்களில் GAL4 இருப்பது சிறிய அல்லது எந்த விளைவையும் ஏற்படுத்தாது, ஏனெனில் GAL4 இன் முக்கிய விளைவு ஒரு UAS பிராந்தியத்துடன் பிணைப்பதாகும், மேலும் பெரும்பாலான உயிரணுக்களுக்கு (அல்லது தீங்கற்ற) UAS பகுதிகள் இல்லை. கால் 4 தானாகத் தெரியவில்லை என்பதால், செல்களில் சிறிய விளைவைக் கொண்டிருப்பதால், இந்த அமைப்பின் மற்ற தேவையான பகுதி "நிருபர் கோடுகள்" ஆகும். இவை விரும்பிய மரபணுவுக்கு அடுத்துள்ள சிறப்பு யுஏஎஸ் பகுதியுடன் ஈக்களின் விகாரங்கள். இந்த மரபணு அறிவுறுத்தல்கள் விலங்குகளின் ஒவ்வொரு உயிரணுவிலும் நிகழ்கின்றன, ஆனால் பெரும்பாலான உயிரணுக்களில் அந்த உயிரணு GAL4 ஐ உற்பத்தி செய்யாததால் எதுவும் நடக்காது. இருப்பினும், GAL4 ஐ உற்பத்தி செய்யும் உயிரணுக்களில், யுஏஎஸ் செயல்படுத்தப்படுகிறது, அதற்கு அடுத்துள்ள மரபணு இயக்கப்படுகிறது, மேலும் அது அதன் விளைவாக புரதத்தை உற்பத்தி செய்யத் தொடங்குகிறது. இது எந்த செல்கள் GAL4 ஐ வெளிப்படுத்துகின்றன என்பதை புலனாய்வாளருக்கு தெரிவிக்கலாம், எனவே "ரிப்போர்ட்டர் லைன்" என்ற சொல், ஆனால் செல் நடத்தையை கையாள விரும்பும் மரபணுக்களும் பெரும்பாலும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. வழக்கமான நிருபர் மரபணுக்களில் பின்வருவன அடங்கும்ஃ பச்சை (ஜி. எஃப். பி) அல்லது சிவப்பு ஃப்ளோரசன்ட் புரதங்கள் (ஆர். எஃப். பி) போன்ற ஃப்ளோரசன்ட் புரதங்கள், எந்த உயிரணுக்கள் கால் 4 சேனல்ரோடோப்ஸினை வெளிப்படுத்துகின்றன என்பதை விஞ்ஞானிகள் பார்க்க அனுமதிக்கின்றன, இது நரம்பு உயிரணுக்களின் ஒளி-உணர்திறன் தூண்டுதலை அனுமதிக்கிறது, இது நியூரான்களை மூடும் ஷிபைர் நியூரான்களின் துப்பாக்கிச் சூட்டை அடக்க ஒளியை அனுமதிக்கிறது, ஆனால் அதிக வெப்பநிலையில் (30 டிகிரி செல்சியஸ் மற்றும் அதற்கு மேல்) மட்டுமே. இந்த மரபணு கொண்ட ஈக்கள் அவற்றின் நியூரான்கள் இயல்பாக செயல்படும் குறைந்த வெப்பநிலையில் எழுப்பப்பட்டு சோதிக்கப்படலாம். பின்னர் ஈக்களின் உடல் வெப்பநிலையை உயர்த்தலாம் (அவை குளிர்ந்த இரத்தம் கொண்டவை என்பதால்), மேலும் இந்த நியூரான்கள் அணைக்கப்படுகின்றன. ஈயின் நடத்தை மாறினால், அந்த நியூரான்கள் என்ன செய்கின்றன என்பதற்கான வலுவான துப்பு இது தருகிறது. GECI (மரபணு குறியீட்டு கால்சியம் இண்டிகேட்டர்), பெரும்பாலும் புரதங்களின் GCaMP குடும்பத்தின் உறுப்பினர். இந்த புரதங்கள் கால்சியத்திற்கு வெளிப்படும்போது ஒளிரும், இது பெரும்பாலான உயிரணுக்களில், நரம்பணு தீப்பிடிக்கும் போது நிகழ்கிறது. இது நரம்பு மண்டலத்தின் செயல்பாட்டைக் காட்டும் படங்களை அல்லது திரைப்படங்களை எடுக்க விஞ்ஞானிகளை அனுமதிக்கிறது. எடுத்துக்காட்டாக, விரும்பிய நியூரான்களின் தொகுப்பில் GAL4 ஐ வெளிப்படுத்தும் ஒரு GAL4 வரியிலிருந்து ஒரு ஈயைத் தேர்ந்தெடுப்பதன் மூலமும், GFP ஐ வெளிப்படுத்தும் ஒரு நிருபர் வரியுடன் அதைக் கடப்பதன் மூலமும் விஞ்ஞானிகள் முதலில் ஒரு வகை நியூரான்களைக் காட்சிப்படுத்தலாம். சந்ததியில், உயிரணுக்களின் விரும்பிய துணைக்குழு GAL4 ஐ உருவாக்கும், மேலும் இந்த உயிரணுக்களில் GAL4 யுஏஎஸ் உடன் பிணைக்கப்பட்டு, GFP உற்பத்தியை செயல்படுத்தும். எனவே உயிரணுக்களின் விரும்பிய துணைக்குழு இப்போது ஒளிரும் பச்சை நிறத்தில் இருக்கும், மேலும் ஒரு ஒளிரும் நுண்ணோக்கி மூலம் பின்பற்றப்படலாம். அடுத்து, இந்த செல்கள் என்ன செய்யக்கூடும் என்பதைக் கண்டுபிடிக்க, சோதனையாளர் இந்த செல்கள் ஒவ்வொன்றிலும் சேனலோடோப்ஸினை வெளிப்படுத்தலாம், அதே GAL4 கோட்டை ஒரு சேனலோடோப்ஸின் நிருபர் வரிசையுடன் கடக்க வேண்டும். சந்ததியினரில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட செல்கள், மற்றும் அந்த செல்கள் மட்டுமே, சேனல் ரோடோப்சின் கொண்டிருக்கும் மற்றும் ஒரு பிரகாசமான ஒளியால் தூண்டப்படலாம். இப்போது விஞ்ஞானி இந்த குறிப்பிட்ட செல்களை விருப்பப்படி தூண்டலாம், இதன் விளைவாக ஏற்படும் நடத்தையை ஆராய்ந்து இந்த செல்கள் என்ன செய்யக்கூடும் என்பதைப் பார்க்கலாம். ஆபரேஷன் கால் 4 என்பது டிஎன்ஏ-பிணைப்பு களம் மற்றும் செயல்படுத்தும் களம் ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு மட்டு புரதமாகும். GAL4 பிணைக்கும் UAS என்பது CGG-N11-CCG ஆகும், இதில் N எந்த அடித்தளமாகவும் இருக்கலாம். GAL4 என்பது பொதுவாக மற்ற உயிரினங்களில் இல்லாத ஒரு ஈஸ்ட் புரதமாக இருந்தாலும், இது ட்ரோசோபிலா மற்றும் மனித உயிரணுக்கள் போன்ற பல்வேறு உயிரினங்களில் ஒரு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் ஆக்டிவேட்டராக செயல்படுவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது, இது மரபணு வெளிப்பாட்டிற்கான அதே வழிமுறைகள் பரிணாம வளர்ச்சியின் போக்கில் பாதுகாக்கப்பட்டுள்ளன என்பதை எடுத்துக்காட்டுகிறது. ட்ரோசோபிலாவில் ஆய்வுக்காக, GAL4 மரபணு ஒரு பூர்வீக மரபணு ஊக்குவிப்பாளர் அல்லது இயக்கி மரபணுவின் கட்டுப்பாட்டின் கீழ் வைக்கப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் யுஏஎஸ் ஒரு இலக்கு மரபணுவின் வெளிப்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துகிறது. GAL4 பின்னர் இயக்கி மரபணு பொதுவாக செயலில் இருக்கும் உயிரணுக்களில் மட்டுமே வெளிப்படுத்தப்படுகிறது. இதையொட்டி, ஜிஎஎல்4 ஒரு யுஏஎஸ் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட இடத்தில் மட்டுமே மரபணு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை செயல்படுத்த வேண்டும். எடுத்துக்காட்டாக, ஜி. எஃப். பி (பச்சை ஃப்ளோரசன்ட் புரதம்) போன்ற புலப்படும் குறிப்பானை குறியாக்கம் செய்யும் ஒரு மரபணுவை இணைப்பதன் மூலம் இயக்கி மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு முறையை தீர்மானிக்க முடியும். GAL4 மற்றும் UAS ஆகியவை ட்ரோசோபிலாவில் உள்ள மரபணு வெளிப்பாட்டைப் படிக்க மிகவும் பயனுள்ளதாக இருக்கும், ஏனெனில் அவை பொதுவாக இல்லை மற்றும் அவற்றின் வெளிப்பாடு உயிரணுவில் உள்ள பிற செயல்முறைகளில் தலையிடாது. எடுத்துக்காட்டாக, நிறமி சிதறல் காரணி (பி. டி. எஃப்) எனப்படும் அறியப்பட்ட தாள சர்க்காடியன் வெளியீட்டில் அரித்மிக் நடத்தையை உருவாக்க குளியல் வெளிப்பாட்டை மாற்ற ட்ரோசோபிலாவில் உள்ள ஜி. ஏ. எல் 4/யு. ஏ. எஸ்-ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட டிரான்ஸ்ஜென்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. இருப்பினும், ட்ரோசோபிலாவில் GAL4 இன் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு பக்க விளைவுகளை ஏற்படுத்தக்கூடும் என்று சில ஆராய்ச்சிகள் சுட்டிக்காட்டியுள்ளன, இது அடிப்படையில் ஒரு அன்னிய புரதத்திற்கு நோயெதிர்ப்பு மற்றும் மன அழுத்த பதில்களுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம். ட்ரோசோபிலாவைத் தவிர ஆப்பிரிக்க நக தவளையான செனோப்பஸ் மற்றும் ஜீப்ராஃபிஷ் போன்ற உயிரினங்களில் மரபணு வெளிப்பாட்டைப் படிக்க GAL4-UAS அமைப்பு பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது. GAL4/UAS அமைப்பு இரண்டு ஹைப்ரிட் ஸ்கிரீனிங்கிலும் பயன்படுத்தப்படுகிறது, இது இரண்டு புரதங்கள் அல்லது டிஎன்ஏவுடன் ஒரு புரதத்திற்கு இடையிலான தொடர்புகளை அடையாளம் காணும் முறையாகும். விரிவாக்கங்கள் கால் 4 வெளிப்பாட்டை "குறுக்குவெட்டு உத்திகள்" மூலம் இன்னும் குறிப்பிட்டதாக மாற்றலாம். இவை இரண்டு வெவ்வேறு GAL4 கோடுகளை இணைக்கலாம்-சொல்லுங்கள், A மற்றும் B-GAL4 என்பது வரி A இல் இருக்கும் செல்களில் மட்டுமே வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, ஆனால் வரி B இல் இல்லை, அல்லது வரி A மற்றும் B இரண்டிலும் இல்லை. உள்ளார்ந்த அரிதான GAL4 கோடுகளுடன் இணைக்கும்போது, இது மிகவும் குறிப்பிட்ட தேர்வை வழங்குகிறது, இது பெரும்பாலும் ஒரு செல் வகைக்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்படுகிறது. குறைபாடு என்னவென்றால், குறைந்தது மூன்று சுயாதீன செருகும் தளங்கள் தேவைப்படுகின்றன, எனவே கோடுகள் வெவ்வேறு மற்றும் சுயாதீனமான செருகும் தளங்களைப் பயன்படுத்த வேண்டும், மேலும் விரும்பிய இறுதி உயிரினங்களை உருவாக்குவதற்கு ஒரு குறுக்கு தேவைப்படுகிறது. இது மிகவும் சுறுசுறுப்பான ஆராய்ச்சித் துறையாகும், மேலும் இதுபோன்ற பல குறுக்குவெட்டு உத்திகள் உள்ளன, அவற்றில் இரண்டு கீழே விவாதிக்கப்படுகின்றன. வரிசை A இல் இருக்கும் ஆனால் வரி B இல் இல்லாத உயிரணுக்களில் GAL4 வெளிப்பாட்டை உருவாக்க ஒரு வழி, GAL4 ஐ வெளிப்படுத்த வரி A ஐ உருவாக்க வேண்டும், மேலும் GAL4 தடுப்பான GAL80 ஐ வெளிப்படுத்த வரி B ஐ உருவாக்க வேண்டும். எனவே, A இல் இருக்கும் ஆனால் B இல் இல்லாத செல்கள் மட்டுமே செயலில் உள்ள GAL4 ஐக் கொண்டிருக்கும், இது பின்னர் நிருபர் மரபணுவை இயக்க முடியும். ஏ மற்றும் பி இரண்டிலும் உள்ள செல்களில் மட்டுமே GAL4 ஐ வெளிப்படுத்த, "ஸ்ப்லிட்-GAL4" என்ற நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தலாம். GAL4 புரதத்தின் பாதியை வெளிப்படுத்த வரி A செய்யப்படுகிறது, இது தானாகவே செயலற்றது. இதேபோல், GAL4 இன் மற்ற பாதியை வெளிப்படுத்த B கோடு உருவாக்கப்பட்டது, இது தானாகவே செயலற்றது. இரண்டு கோடுகளிலும் இருக்கும் செல்கள் மட்டுமே இரண்டு பகுதிகளையும் உருவாக்குகின்றன, அவை லியூசின் சிப்பர் மூலம் GAL4 இல் சுயமாக ஒன்றிணைந்து ரிப்போர்ட்டர் மரபணுவை செயல்படுத்துகின்றன. குறிப்புகள் மரபியல்