ChIP-exo
சிஐபி-எக்ஸோ என்பது குரோமாட்டின் நோயெதிர்ப்பு ஊடுருவல் அடிப்படையிலான முறையாகும், இது ஆர்வமுள்ள ஒரு புரதம் (டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி) மரபணுவுடன் பிணைக்கும் இடங்களை வரைபடமாக்குகிறது. இது சிஐபி-செக் நெறிமுறையின் மாற்றமாகும், இது பிணைப்பு தளங்களின் தீர்மானத்தை நூற்றுக்கணக்கான அடிப்படை ஜோடிகளிலிருந்து கிட்டத்தட்ட ஒரு அடிப்படை ஜோடியாக மேம்படுத்துகிறது. இது 5 '-3' திசையில் புரதத்தால் பிணைக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவின் இழைகளை புரத பிணைப்பு தளத்தின் சிறிய எண்ணிக்கையிலான நியூக்ளியோடைடுகளுக்குள் சிதைக்க எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ்களைப் பயன்படுத்துகிறது. எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட முனைகளின் நியூக்ளியோடைடுகள் டிஎன்ஏ வரிசைமுறை, மைக்ரோஅரேக்கள் மற்றும் பிசிஆர் ஆகியவற்றின் சில கலவையைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்படுகின்றன. இந்த வரிசைகள் பின்னர் புரதம் பிணைக்கும் மரபணுவில் உள்ள இடங்களை அடையாளம் காண மரபணுவுடன் வரைபடமாக்கப்படுகின்றன. புரத-டிஎன்ஏ தொடர்புகளைக் கண்டறிய குரோமாட்டின் நோயெதிர்ப்பு ஊடுருவல் (சிஐபி) நுட்பங்கள் 1984 முதல் பயன்பாட்டில் உள்ளன. முடிவுகளின் தரத்தை மேம்படுத்த சிஐபியில் பல மாறுபாடுகள் உள்ளன. அத்தகைய ஒரு முன்னேற்றம், சிஐபி-ஆன்-சிப் (சிஐபி-சிப்), சிஐபி-ஐ மைக்ரோ அரே தொழில்நுட்பத்துடன் ஒருங்கிணைக்கிறது. இந்த நுட்பம் மட்டுப்படுத்தப்பட்ட உணர்திறன் மற்றும் குறிப்பிட்ட தன்மையைக் கொண்டுள்ளது, குறிப்பாக விவோவில் அணு பெட்டியில் உள்ள ஆயிரக்கணக்கான புரதங்களால் மைக்ரோஅரேக்கள் கட்டுப்படுத்தப்படுகின்றன, இதன் விளைவாக தவறான நேர்மறைகளின் அதிக விகிதம் ஏற்படுகிறது. அடுத்து சிஐபி-சீக்வென்சிங் (சிஐபி-செக்) வந்தது, இது சிஐபியை உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறையுடன் ஒருங்கிணைக்கிறது. இருப்பினும், வெட்டு டிஎன்ஏ துண்டுகளின் பன்முகத் தன்மை பிணைப்பு தளங்களை ±300 அடிப்படை ஜோடிகளுக்குள் வரைபடமாக்குகிறது, இது குறிப்பிட்ட தன்மையை கட்டுப்படுத்துகிறது. இரண்டாவதாக, மாசுபடுத்தும் டிஎன்ஏ ஒரு கடுமையான சிக்கலை முன்வைக்கிறது, ஏனெனில் சில மரபணு இருப்பிடங்கள் ஆர்வமுள்ள புரதத்துடன் குறுக்கு இணைக்கப்பட்டுள்ளன, இதனால் எந்தவொரு குறிப்பிட்ட மரபணு டிஎன்ஏவும் பின்னணி சத்தத்தின் குறிப்பிடத்தக்க ஆதாரமாக அமைகிறது. இந்த சிக்கல்களைத் தீர்க்க, ரீ மற்றும் பக் சிஐபி-எக்ஸோவை உருவாக்க கிளாசிக் நியூக்ளீஸ் பாதுகாப்பு மதிப்பீட்டைத் திருத்தினர். இந்த புதிய சிஐபி நுட்பம் ஒரு லாம்ப்டா எக்ஸோ நியூக்ளியேஸை நம்பியுள்ளது, இது 5′-3′ திசையில் மட்டுமே சீரழிகிறது, மேலும் அனைத்து, வரம்பற்ற இரட்டை இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ. சுருக்கமாக, ஆர்வமுள்ள ஒரு புரதம் (ஒரு எபிடோப் குறிச்சொல்லுடன் பொறியியல் ஒன்று நோயெதிர்ப்பு குறைபாட்டிற்கு பயனுள்ளதாக இருக்கும்) ஃபார்மால்டிஹைடைப் பயன்படுத்தி ஒரு மரபணு முழுவதும் அதன் இயற்கையான பிணைப்பு இடங்களுடன் விவோவில் இணைக்கப்பட்டுள்ளது. செல்கள் பின்னர் சேகரிக்கப்பட்டு, உடைக்கப்பட்டு, குரோமாட்டின் வெட்டு மற்றும் சோனிகேஷன் மூலம் கரையச் செய்யப்படுகின்றன. குறுக்கு இணைக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவுடன் ஆர்வமுள்ள புரதத்தை நோய்த்தடுப்பு ஊக்குவிக்க ஒரு ஆன்டிபாடி பயன்படுத்தப்படுகிறது. டிஎன்ஏ பிசிஆர் அடாப்டர்கள் பின்னர் முனைகளில் இணைக்கப்படுகின்றன, இது எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ் செரிமானத்திற்குப் பிறகு இரண்டாவது ஸ்ட்ராண்ட் டிஎன்ஏ தொகுப்புக்கான முதன்மை புள்ளியாக செயல்படுகிறது. லாம்ப்டா எக்ஸோனியூக்லீஸ் பின்னர் 5 'முனையிலிருந்து இரட்டை டிஎன்ஏ இழைகளை செரிமானம் செய்கிறது, புரதம்-டிஎன்ஏ சகப்பிணைப்பு தொடர்புகளின் எல்லையில் செரிமானம் தடுக்கப்படும் வரை. பெரும்பாலான மாசுபடுத்தும் டிஎன்ஏ இரண்டாவது ஒற்றை-ஸ்ட்ராண்ட் குறிப்பிட்ட எக்ஸோனியூக்லீஸைச் சேர்ப்பதன் மூலம் சீரழிக்கப்படுகிறது. குறுக்கு இணைப்பு தலைகீழாக மாறிய பிறகு, பி. சி. ஆர் அடாப்டர்களுக்கான ப்ரைமர்கள் இரட்டை ஸ்ட்ராண்டட் டிஎன்ஏவை உருவாக்க நீட்டிக்கப்படுகின்றன, மேலும் இரண்டாவது அடாப்டர் 5 'முனைகளுக்கு இணைக்கப்பட்டு எக்ஸோ நியூக்ளீஸ் செரிமான நிறுத்தத்தின் துல்லியமான இருப்பிடத்தை வரையறுக்கிறது. நூலகம் பின்னர் பி. சி. ஆர் மூலம் பெருக்கப்படுகிறது, மேலும் தயாரிப்புகள் உயர் செயல்திறன் வரிசைமுறை மூலம் அடையாளம் காணப்படுகின்றன. இந்த முறை எந்தவொரு மரபணுவிலும் உள்ள எந்தவொரு புரத பிணைப்பு தளத்திற்கும் ஒற்றை அடிப்படை ஜோடி வரை தீர்மானிக்க அனுமதிக்கிறது, இது சிஐபி-சிப் அல்லது சிஐபி-செக்கை விட மிக அதிக தெளிவுத்திறன் கொண்டது. நன்மைகள் சிஐபி-எக்ஸோ புரத பிணைப்பு இடங்களை அடையாளம் காண்பதில் ஒற்றை அடிப்படை ஜோடி தெளிவுத்திறனைக் கொடுப்பதாக காட்டப்பட்டுள்ளது. இது சிஐபி-செக்க்கு மாறாக உள்ளது, இது ஒரு புரதத்தின் பிணைப்பு தளத்தை ±300 அடிப்படை ஜோடிகளுடன் மட்டுமே கண்டுபிடிக்க முடியும். புரதம் அல்லாத டிஎன்ஏ துண்டுகளின் மாசுபாடு சிஐபி சோதனைகளில் தவறான நேர்மறைகள் மற்றும் எதிர்மறைகளின் அதிக விகிதத்தை விளைவிக்கும். செயல்முறையில் எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ்களைச் சேர்ப்பது பிணைப்பு-தள அழைப்பின் தீர்மானத்தை மேம்படுத்துவது மட்டுமல்லாமல், வரிசைப்படுத்துவதற்கு முன்பு கரைசலில் இருந்து மாசுபடுத்தும் டி. என். ஏவை நீக்குகிறது. ஒரு நியூக்ளியோடைடு துண்டுடன் திறமையற்ற முறையில் பிணைக்கப்பட்டுள்ள புரதங்கள் சிஐபி-எக்ஸோ மூலம் கண்டறியப்படுவதற்கான வாய்ப்புகள் அதிகம். உதாரணமாக, முன்பு கண்டுபிடிக்கப்பட்டதை விட அதிக சி. டி. சி. எஃப் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி பிணைப்பு தளங்களை அங்கீகரிக்க இது அனுமதித்துள்ளது. அதிக தெளிவுத்திறன் மற்றும் குறைந்த பின்னணி காரணமாக, சிஐபி-எக்ஸோவைப் பயன்படுத்தும் போது வரிசைமுறை பாதுகாப்பின் குறைந்த ஆழம் தேவைப்படுகிறது. ஒரு புரத-டி. என். ஏ வளாகம் ஒரே பிணைப்பு நிகழ்வுக்குள் குறுக்கு இணைப்பின் பல இடங்களைக் கொண்டிருந்தால், அது பல தனித்துவமான பிணைப்பு நிகழ்வுகள் இருப்பதைப் போல தோன்றலாம். இந்த புரதங்கள் அதே நிகழ்விற்குள் கிடைக்கக்கூடிய பிணைப்பு தளங்களில் ஒன்றில் இயல்பற்றதாகவும் குறுக்கு இணைப்பாகவும் இருப்பதால் இது ஏற்படலாம். புரதம் எந்த தளத்துடன் குறுக்கு இணைக்கப்பட்டுள்ளது என்பதைப் பொறுத்து, எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ் பின்னர் பிணைக்கப்பட்ட தளங்களில் ஒன்றில் நிறுத்தப்படும். எந்தவொரு சிஐபி அடிப்படையிலான முறையையும் போலவே, இந்த நுட்பத்தைப் பயன்படுத்துவதற்கு ஆர்வமுள்ள புரதத்திற்கு பொருத்தமான ஆன்டிபாடி கிடைக்க வேண்டும். ரீ மற்றும் பக் பயன்பாடுகள் சிஐபி-எக்ஸோவை ஒரு சிறிய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளின் தொகுப்பில் பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம் அறிமுகப்படுத்துகின்றனஃ ரீப் 1, கால் 4, பிஎச்டி 1, ஈஸ்டில் ராப் 1 மற்றும் மனிதனில் சி. டி. சி. எஃப். ரெப் 1 தளங்கள் பெரும்பாலும் கிளஸ்டர்களில் காணப்பட்டன, மேலும் இந்த கிளஸ்டர்கள் எதிர்பார்த்ததை விட ~ 10 மடங்கு அதிக ஆக்கிரமிப்பைக் கொண்டிருந்தன. கிளஸ்டர்களில் இரண்டாம் நிலை தளங்கள் ஒரு முதன்மை பிணைப்பு தளத்திலிருந்து ~ 40 பிபி கண்டுபிடிக்கப்பட்டன. கால் 4 இன் பிணைப்பு மையக்கருத்துக்கள் நான்கு நியூக்ளியோடைடுகளில் மூன்றுக்கு வலுவான விருப்பத்தைக் காட்டின, இது கால் 4 க்கும் விலக்கப்பட்ட நியூக்ளியோடைடுக்கும் இடையிலான எதிர்மறையான தொடர்புகளைக் குறிக்கிறது. Phd1 மூன்று வெவ்வேறு கருத்தாக்கங்களை அங்கீகரிக்கிறது, இது Phd1 இன் பிணைப்பு கருத்தாக்கத்தின் தெளிவின்மை பற்றிய முந்தைய அறிக்கைகளை விளக்குகிறது. ராப் 1 நான்கு கருத்தாக்கங்களை அங்கீகரிப்பது கண்டறியப்பட்டது. இந்த புரதத்தால் பிணைக்கப்பட்ட ரைபோசோமல் புரத மரபணுக்கள் ஒரு வலுவான ஒருமித்த வரிசையுடன் ஒரு குறிப்பிட்ட மையக்கருத்தைப் பயன்படுத்தும் போக்கைக் கொண்டிருந்தன. பிற மரபணுக்கள் பெரும்பாலும் பலவீனமான ஒருமித்த கருத்தாக்கங்களின் கொத்துக்களைப் பயன்படுத்தின, ஒருவேளை இதேபோன்ற ஆக்கிரமிப்பை அடைய. சி. டி. சி. எஃப் இன் பிணைப்பு மையக்கருத்துக்கள் நான்கு "தொகுதிகளை" பயன்படுத்தின. பிணைக்கப்பட்ட சி. டி. சி. எஃப் தளங்களில் பாதி தொகுதிகள் 1 மற்றும் 2 ஐப் பயன்படுத்தின, மீதமுள்ளவை நான்கின் கலவையைப் பயன்படுத்தின. இந்த தொகுதிகளின் வெவ்வேறு சேர்க்கைகளை அடையாளம் காண சி. டி. சி. எஃப் அதன் துத்தநாக விரல்களைப் பயன்படுத்துகிறது என்று நம்பப்படுகிறது. ரீ மற்றும் பக் ஆகியோர் சாகரோமைசஸ் மரபணுக்களில் முன்-துவக்க சிக்கலான (பிஐசி) அமைப்பு மற்றும் அமைப்பை பகுப்பாய்வு செய்தனர். சிஐபி-எக்ஸோவைப் பயன்படுத்தி, பிற கண்டுபிடிப்புகளுடன், டாடா-குறைவானதாக அறிவிக்கப்பட்ட விளம்பரதாரர்களில் டாடா போன்ற அம்சங்களை துல்லியமாக அடையாளம் காண முடிந்தது. குரோமாட்டின் நோயெதிர்ப்பு உறிஞ்சுதல் சிப்-சீக்வென்சிங் சிஐபி-ஆன்-சிப் புரதம்-டிஎன்ஏ தொடர்பு குறிப்புகள் வெளிப்புற இணைப்புகள் உயர் வரையறையில் டிஎன்ஏ-புரத தொடர்புகள் உயர் தெளிவுத்திறன் குரோமாட்டின் நோயெதிர்ப்பு உறிஞ்சுதலை பிணைக்கும் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணியைத் தீர்ப்பது முக்கியமான மரபணு-ஒழுங்குமுறை புரதங்கள் புதிய முறையால் அடையாளம் காணப்படுகின்றன செக்ஸோஆர்ஃ சிஐபி-எக்ஸோவில் உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட புரதம்-டிஎன்ஏ தொடர்புகளைக் கண்டறிய ஒரு ஆர்/பயோ கண்டக்டர் தொகுப்பு மூலக்கூறு உயிரியல் மூலக்கூறு உயிரியல் நுட்பங்கள் மரபணு டிஎன்ஏ வரிசைமுறை உயிர் தகவலியல்