Bisulfite sequencing
பைசல்பைட் வரிசைமுறை (பைசல்பைட் வரிசைமுறை என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) என்பது வழக்கமான வரிசைமுறைக்கு முன் டிஎன்ஏவின் பைசல்பைட் சிகிச்சையைப் பயன்படுத்தி மெத்திலேசனின் வடிவத்தைத் தீர்மானிப்பதாகும். டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் என்பது முதன்முதலில் கண்டுபிடிக்கப்பட்ட எபிஜெனெடிக் அடையாளமாகும், மேலும் இது மிகவும் ஆய்வு செய்யப்பட்ட ஒன்றாக உள்ளது. விலங்குகளில் இது முக்கியமாக டைனியூக்ளியோடைடு சி. பி. ஜி இன் சைட்டோசின் எச்சங்களின் கார்பன்-5 நிலைக்கு ஒரு மெத்தில் குழுவைச் சேர்ப்பதை உள்ளடக்கியது, மேலும் இது டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் செயல்பாட்டின் அடக்குமுறையில் சிக்கியுள்ளது. பைசல்பைட்டுடன் டிஎன்ஏ சிகிச்சையளிப்பது சைட்டோசின் எச்சங்களை யூராசிலாக மாற்றுகிறது, ஆனால் 5-மெத்தில்ஸைட்டோசின் எச்சங்களை பாதிக்காமல் விடுகிறது. எனவே, பைசல்பைட் மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ மெத்திலேட்டட் சைட்டோசின்களை மட்டுமே தக்க வைத்துக் கொள்கிறது. இவ்வாறு, பைசல்பைட் சிகிச்சை டிஎன்ஏ வரிசையில் குறிப்பிட்ட மாற்றங்களை அறிமுகப்படுத்துகிறது, இது தனிப்பட்ட சைட்டோசின் எச்சங்களின் மெத்திலேஷன் நிலையைப் பொறுத்தது, இது டிஎன்ஏவின் ஒரு பிரிவின் மெத்திலேஷன் நிலை குறித்த ஒற்றை-நியூக்ளியோடைட் தெளிவுத்திறன் தகவல்களை வழங்குகிறது. இந்தத் தகவலை மீட்டெடுக்க மாற்றப்பட்ட வரிசையில் பல்வேறு பகுப்பாய்வுகள் செய்யப்படலாம். எனவே இந்த பகுப்பாய்வின் நோக்கம் பைசல்பைட் மாற்றத்தின் விளைவாக ஏற்படும் ஒற்றை நியூக்ளியோடைடு பாலிமார்பிசம்களுக்கு (சைட்டோசின்கள் மற்றும் தைமிடின்) இடையிலான வேறுபாட்டிற்கு குறைக்கப்படுகிறது (படம் 1). முறைகள் பைசல்பைட் வரிசைமுறை சிபிஜி டைனியூக்ளியோடைடுகளில் மெத்திலேஷன் நிலையை தீர்மானிக்க பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மரபணு டிஎன்ஏ மீது வழக்கமான வரிசைமுறை முறைகளைப் பயன்படுத்துகிறது. குறிப்பிட்ட இடத்தில் அல்லது மரபணு அளவிலான மட்டத்தில் மெத்திலேஷனை விசாரிக்க பிற வரிசைப்படுத்தப்படாத உத்திகளும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. அனைத்து உத்திகளும் பைசல்பைட் தூண்டப்பட்ட மெத்திலேற்றப்படாத சைட்டோசின்களை யூராசிலாக மாற்றுவது முழுமையானது என்று கருதுகின்றன, மேலும் இது அடுத்தடுத்த அனைத்து நுட்பங்களுக்கும் அடிப்படையாக செயல்படுகிறது. வெறுமனே, பயன்படுத்தப்படும் முறை ஒவ்வொரு அல்லீலுக்கும் தனித்தனியாக மெத்திலேஷன் நிலையை தீர்மானிக்கும். பைசல்பைட் வரிசைமுறைக்கான மாற்று முறைகளில் ஒருங்கிணைந்த பிஸல்பைட் கட்டுப்பாடு பகுப்பாய்வு மற்றும் மெத்திலேட்டட் டிஎன்ஏ நோயெதிர்ப்பு ஊடுருவல் (எம்இடிஐபி) ஆகியவை அடங்கும். பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவை பகுப்பாய்வு செய்வதற்கான முறைகள் தொடர்ந்து உருவாக்கப்பட்டு வருகின்றன. வேகமாக வளர்ந்து வரும் இந்த முறைகளை சுருக்கமாகக் கூற, ஏராளமான மதிப்பாய்வு கட்டுரைகள் எழுதப்பட்டுள்ளன. முறைகளை பொதுவாக மெத்திலேஷன்-குறிப்பிட்ட பி. சி. ஆர் (எம். எஸ். பி) (படம் 4) அடிப்படையிலான உத்திகளாகவும், மெத்திலேஷன் அல்லாத-குறிப்பிட்ட நிலைமைகளின் கீழ் நிகழ்த்தப்படும் பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினையைப் (பி. சி. ஆர்) பயன்படுத்தும் உத்திகளாகவும் பிரிக்கலாம் (படம் 3). மைக்ரோஅரே அடிப்படையிலான முறைகள் மெத்திலேஷன் அல்லாத குறிப்பிட்ட நிலைமைகளின் அடிப்படையில் பி. சி. ஆரைப் பயன்படுத்துகின்றன. மெத்திலேஷன் அல்லாத குறிப்பிட்ட பி. சி. ஆர் அடிப்படையிலான முறைகள் நேரடி வரிசைமுறை பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தி மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வின் முதல் அறிக்கையிடப்பட்ட முறை பிசிஆர் மற்றும் நிலையான டையாக்சினியூக்ளியோடைட் டிஎன்ஏ வரிசைமுறையைப் பயன்படுத்தி பைசல்பைட் மாற்றத்தை எதிர்க்கும் நியூக்ளியோடைடுகளை நேரடியாக தீர்மானிக்கிறது. ப்ரைமர்கள் ஸ்ட்ராண்ட்-ஸ்பெசிபிக் மற்றும் பைசல்பைட்-ஸ்பெசிபிக் (அதாவது, சிபிஜி அல்லாத சைட்டோசின்களைக் கொண்ட ப்ரைமர்கள் அவை பைசல்பைட் அல்லாத சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவுக்கு நிரப்பு அல்ல), ஆர்வமுள்ள மெத்திலேஷன் தளத்தை பக்கவாட்டில் (ஆனால் ஈடுபடுத்தவில்லை) வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன. எனவே, இது மெத்திலேஷன்-குறிப்பிட்ட பி. சி. ஆருக்கு மாறாக, மெத்திலேஷன் மற்றும் மெத்திலேஷன் இல்லாத வரிசைகள் இரண்டையும் பெருக்கும். மெத்திலேற்றப்படாத சைட்டோசின்களின் அனைத்து தளங்களும் உணர்ச்சி இழையின் விளைவாக பெருக்கப்பட்ட வரிசையில் தைமின்களாகவும், பெருக்கப்பட்ட ஆண்டிசென்ஸ் இழையில் அடினைன்களாகவும் காட்டப்படுகின்றன. பி. சி. ஆர் ப்ரைமர்களில் உயர் செயல்திறன் வரிசைமுறை அடாப்டர்களை இணைப்பதன் மூலம், பி. சி. ஆர் தயாரிப்புகளை பெருமளவில் இணையான வரிசைமுறையுடன் வரிசைப்படுத்தலாம். மாற்றாக, மற்றும் உழைப்பு-தீவிரமான, பி. சி. ஆர் தயாரிப்பு குளோன் மற்றும் வரிசைப்படுத்தப்படலாம். வரிசைப்படுத்தலுக்கான தயாரிப்பை மேம்படுத்த நெஸ்டட் பி. சி. ஆர் முறைகளைப் பயன்படுத்தலாம். பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தி அடுத்தடுத்த அனைத்து டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வு நுட்பங்களும் ஃப்ரோமர் மற்றும் பலர் அளித்த இந்த அறிக்கையை அடிப்படையாகக் கொண்டவை. (படம் 2). பெரும்பாலான பிற முறைகள் உண்மையான வரிசைமுறை அடிப்படையிலான நுட்பங்கள் அல்ல என்றாலும், பொதுவாக பைசல்பைட்-மாற்ற டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வு நுட்பங்களை விவரிக்க "பைசல்பைட் வரிசைமுறை" என்ற சொல் பெரும்பாலும் பயன்படுத்தப்படுகிறது. மெத்திலேஷன்-குறிப்பிட்ட பி. சி. ஆரைப் பயன்படுத்தாமல் பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவை பகுப்பாய்வு செய்ய பைரோசீக்வென்சிங் பைரோசீக்வென்சிங் பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஆர்வமுள்ள பிராந்தியத்தின் பி. சி. ஆர் பெருக்கத்தைத் தொடர்ந்து, இப்பகுதியில் உள்ள குறிப்பிட்ட சிபிஜி தளங்களின் பைசல்பைட்-மாற்றப்பட்ட வரிசையை தீர்மானிக்க பைரோசீக்வென்சிங் பயன்படுத்தப்படுகிறது. தனிப்பட்ட தளங்களில் சி-டு-டி விகிதத்தை வரிசை நீட்டிப்பின் போது சி மற்றும் டி இணைப்பின் அளவை அடிப்படையாகக் கொண்டு அளவிட முடியும். இந்த முறையின் முக்கிய வரம்பு தொழில்நுட்பத்தின் செலவு ஆகும். இருப்பினும், பைரோசீக்வென்சிங் உயர்-செயல்திறன் ஸ்கிரீனிங் முறைகளுக்கு நீட்டிப்பை அனுமதிக்கிறது. இந்த நுட்பத்தின் ஒரு மாறுபாடு, வோங் மற்றும் பலர் விவரித்தபடி, ஒற்றை-நியூக்ளியோடைடு பாலிமார்பிசம்களை வரிசைமுறை ப்ரைமரின் வரிசையில் இணைக்கும் அல்லீல்-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்துகிறது, இதனால் தாய்வழி மற்றும் தந்தைவழி அல்லீல்களின் தனித்தனி பகுப்பாய்வு அனுமதிக்கிறது. இந்த நுட்பம் மரபணு முத்திரை பகுப்பாய்விற்கு குறிப்பாக பயனுள்ளதாக இருக்கும். மெத்திலேஷன்-சென்சிடிவ் சிங்கிள்-ஸ்ட்ராண்ட் கான்ஃபார்மேஷன் அனாலிசிஸ் (எம். எஸ்.-எஸ். எஸ். சி. ஏ) இந்த முறை சிங்கிள்-நியூக்ளியோடைடு பாலிமார்பிசம் (எஸ். என். பி) பகுப்பாய்விற்காக உருவாக்கப்பட்ட சிங்கிள்-ஸ்ட்ராண்ட் கான்ஃபார்மேஷன் பாலிமார்பிசம் அனாலிசிஸ் (எஸ். எஸ். சி. ஏ) முறையை அடிப்படையாகக் கொண்டது. டினேச்சரேட்டிங் அல்லாத எலக்ட்ரோபோரேசிஸில் வேறுபட்ட இடம்பெயர்வுகளின் அடிப்படையில் ஒரே அளவிலான ஆனால் தனித்துவமான வரிசையின் ஒற்றை-இழைகள் கொண்ட டிஎன்ஏ துண்டுகளுக்கு இடையில் எஸ்எஸ்சிஏ வேறுபடுகிறது. எம்எஸ்-எஸ்எஸ்சிஏவில், இது பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட, ஆர்வமுள்ள சிபிஜி தளங்களைக் கொண்ட பிசிஆர்-பெருக்கப்பட்ட பகுதிகளை வேறுபடுத்திப் பார்க்கப் பயன்படுகிறது. ஒரு நியூக்ளியோடைடு வேறுபாடு மட்டுமே இருக்கும்போது எஸ். எஸ். சி. ஏ. க்கு உணர்திறன் இல்லை என்றாலும், பைசல்பைட் சிகிச்சை அடிக்கடி ஆர்வமுள்ள பெரும்பாலான பகுதிகளில் பல சி-டு-டி மாற்றங்களைச் செய்கிறது, இதன் விளைவாக ஏற்படும் உணர்திறன் 100% ஐ அணுகுகிறது. எம். எஸ்.-எஸ். எஸ். சி. ஏ இசைக்குழுவின் தீவிரங்களின் விகிதத்தின் அடிப்படையில் டிஎன்ஏ மெத்திலேசனின் அளவு பற்றிய அரை அளவு பகுப்பாய்வையும் வழங்குகிறது. இருப்பினும், இந்த முறை தனிப்பட்ட மெத்திலேஷன் தளங்களைக் காட்டிலும் ஆர்வமுள்ள பிராந்தியத்தில் ஒட்டுமொத்தமாக அனைத்து சிபிஜி தளங்களையும் மதிப்பிடுவதற்காக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது. உயர் தெளிவுத்திறன் உருகுதல் பகுப்பாய்வு (எச்ஆர்எம்) மாற்றப்படாத பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவிலிருந்து மாற்றப்பட்டதை வேறுபடுத்துவதற்கான மற்றொரு முறை உயர் தெளிவுத்திறன் உருகுதல் பகுப்பாய்வு (எச்ஆர்எம்) ஐப் பயன்படுத்துகிறது, இது ஆரம்பத்தில் எஸ்என்பிகளை வேறுபடுத்துவதற்காக வடிவமைக்கப்பட்ட அளவு பிசிஆர் அடிப்படையிலான நுட்பமாகும். பி. சி. ஆர் பெருக்கிகள் வெப்பநிலை அதிகரிப்பு மூலம் நேரடியாக பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகின்றன, இதன் விளைவாக உருகும்போது ஒரு இன்டர்கலேட்டிங் ஃப்ளோரசன்ட் சாயத்தை விடுவிக்கின்றன. பெருக்கியில் உள்ள சி-டு-டி உள்ளடக்கத்தால் குறிப்பிடப்படும் மெத்திலேசனின் அளவு, உருகுவதன் வேகம் மற்றும் சாயத்தின் வெளியீட்டை தீர்மானிக்கிறது. இந்த முறை ஒற்றை குழாய் மதிப்பீட்டில் நேரடி அளவை அனுமதிக்கிறது, ஆனால் குறிப்பிட்ட சி. பி. ஜி தளங்களைக் காட்டிலும் பெருக்கப்பட்ட பகுதியில் ஒட்டுமொத்தமாக மெத்திலேசனை மதிப்பிடுகிறது. மெத்திலேஷன்-சென்சிடிவ் சிங்கிள்-நியூக்ளியோடைடு ப்ரைமர் எக்ஸ்டென்ஷன் (எம்எஸ்-ஸ்னூப்இ) எம்எஸ்-ஸ்னூப்இ ஒற்றை-நியூக்ளியோடைடு பாலிமார்பிசம்களை பகுப்பாய்வு செய்வதற்காக ஆரம்பத்தில் வடிவமைக்கப்பட்ட ப்ரைமர் எக்ஸ்டென்ஷன் முறையைப் பயன்படுத்துகிறது. டிஎன்ஏ பைசல்பைட்-மாற்றப்படுகிறது, மேலும் பைசல்பைட்-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் ஆர்வமுள்ள சிபிஜிக்கு சற்று முன்பு அடிப்படை ஜோடி வரை வரிசைக்கு அனீல் செய்யப்படுகின்றன. டைடாக்ஸினியூக்ளியோடைடுகளை முடிக்கும் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைப் பயன்படுத்தி ஒரு அடிப்படை ஜோடியை சி (அல்லது டி) க்குள் நீட்டிக்க ப்ரைமர் அனுமதிக்கப்படுகிறது, மேலும் சி முதல் டி வரையிலான விகிதம் அளவு ரீதியாக தீர்மானிக்கப்படுகிறது. இந்த சிஃ டி விகிதத்தை தீர்மானிக்க பல முறைகளைப் பயன்படுத்தலாம். ஆரம்பத்தில், எம்எஸ்-ஸ்னூப்இ கதிரியக்க டிடிஎன்டிபிகளை ப்ரைமர் நீட்டிப்பின் நிருபராக நம்பியிருந்தது. ஃப்ளோரசன்ஸ் அடிப்படையிலான முறைகள் அல்லது பைரோசீக்வென்சிங்கையும் பயன்படுத்தலாம். இருப்பினும், மேட்ரிக்ஸ்-உதவி லேசர் டெசார்ப்ஷன் அயனியாக்கம்/டைம்-ஆஃப்-ஃப்ளைட் (மால்டி-டிஓஎஃப்) மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி பகுப்பாய்வு இரண்டு பாலிமார்பிக் ப்ரைமர் நீட்டிப்பு தயாரிப்புகளுக்கு இடையில் வேறுபடுத்திப் பார்க்க, சாராம்சத்தில், எஸ்என்பி மரபணு வகைப்படுத்தலுக்காக வடிவமைக்கப்பட்ட நல்ல மதிப்பீட்டின் அடிப்படையில் பயன்படுத்தப்படலாம். அயன் ஜோடி தலைகீழ்-கட்ட உயர் செயல்திறன் கொண்ட திரவ நிறமாற்றமும் (ஐபி-ஆர்பி-எச். பி. எல். சி) ப்ரைமர் நீட்டிப்பு தயாரிப்புகளை வேறுபடுத்திப் பார்க்கப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. அடிப்படை-குறிப்பிட்ட பிளவு/மால்டி-டோஃப் ஏ சமீபத்தில் எஹ்ரிச் மற்றும் பலர் விவரித்த முறை. நியூக்ளியோடைடு மாற்றங்களிலிருந்து பெறப்பட்ட தகவல்களை மேம்படுத்த ஒரு அடிப்படை-குறிப்பிட்ட பிளவு படியைச் சேர்ப்பதன் மூலம் பைசல்பைட்-மாற்றங்களை மேலும் பயன்படுத்திக் கொள்கிறது. ஆர்வமுள்ள பகுதியின் இன் விட்ரோ டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை முதலில் ஆர். என். ஏவில் பயன்படுத்துவதன் மூலம் (ஆரம்ப பெருக்கத்தில் பி. சி. ஆர் ப்ரைமரில் ஆர்என்ஏ பாலிமரேஸ் ஊக்குவிப்பு தளத்தைச் சேர்ப்பதன் மூலம்), ஆர்என்ஏ டிரான்ஸ்கிரிப்டை அடிப்படை-குறிப்பிட்ட தளங்களில் பிளவுபடுத்த ஆர்என்ஏ ஏ பயன்படுத்தப்படலாம். ஆர்என்ஏஸ் ஏ ஆர்என்ஏவை குறிப்பாக சைட்டோசின் மற்றும் யூராசில் ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளில் பிளவுபடுத்துவதால், சைட்டோசின்-குறிப்பிட்ட (சி-குறிப்பிட்ட) பிளவு விரும்பப்படும்போது பிளவு-எதிர்ப்பு டிடிடிபியை சேர்ப்பதன் மூலமும், யூராசில்-குறிப்பிட்ட (யு-குறிப்பிட்ட) பிளவு விரும்பப்படும்போது டிசிடிபியை இணைப்பதன் மூலமும் அடிப்படை-குறிப்பிட்ட தன்மை அடையப்படுகிறது. பிளவுபட்ட துண்டுகளை மால்டி-டோஃப் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யலாம். பைசல்பைட் சிகிச்சையின் விளைவாக பிளவு தளங்களை சி-டு-யு மாற்றங்கள் மூலம் அறிமுகப்படுத்துதல்/அகற்றுதல் அல்லது பெருக்கப்பட்ட தலைகீழ் இழையில் ஜி-டு-ஏ மாற்றங்களால் துண்டு வெகுஜனத்தில் மாற்றம் ஏற்படுகிறது. சி-குறிப்பிட்ட பிளவு அனைத்து மெத்திலேட்டட் சிபிஜி தளங்களிலும் குறிப்பாக வெட்டப்படும். இதன் விளைவாக வரும் துண்டுகளின் அளவுகளை பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம், ஒட்டுமொத்த பிராந்தியத்தின் மெத்திலேசனின் அளவை தீர்மானிப்பதை விட, பிராந்தியத்திற்குள் உள்ள சிபிஜி தளங்களின் டிஎன்ஏ மெத்திலேசனின் குறிப்பிட்ட வடிவத்தை தீர்மானிக்க முடியும். இந்த முறை உயர்-செயல்திறன் திரையிடலுக்கான செயல்திறனை நிரூபித்தது, பல திசுக்களில் உள்ள ஏராளமான சிபிஜி தளங்களை செலவு குறைந்த முறையில் விசாரிக்க அனுமதிக்கிறது. மெத்திலேஷன்-குறிப்பிட்ட பி. சி. ஆர் (எம். எஸ். பி) மெத்திலேஷன் பகுப்பாய்வின் இந்த மாற்று முறை பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவையும் பயன்படுத்துகிறது, ஆனால் ஆர்வமுள்ள பகுதியை வரிசைப்படுத்த வேண்டியதன் அவசியத்தைத் தவிர்க்கிறது. அதற்கு பதிலாக, ப்ரைமர் ஜோடிகள் மாற்றப்படாத 5-மெத்தில்ஸைட்டோசின்களை மட்டுமே பூர்த்தி செய்யும் வரிசைகளைச் சேர்ப்பதன் மூலம் "மெத்திலேட்டட்-ஸ்பெசிபிக்" ஆக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன, அல்லது, மறுபுறம், "மெத்திலேட்டட்-ஸ்பெசிபிக்", மெத்திலேட்டட் சைட்டோசின்களிலிருந்து மாற்றப்பட்ட தைமின்களை பூர்த்தி செய்கின்றன. மெத்திலேஷன் என்பது பெருக்கத்தை அடைய குறிப்பிட்ட ப்ரைமரின் திறனால் தீர்மானிக்கப்படுகிறது. அதிக மெத்திலேஷன் அடர்த்தி கொண்ட சி. பி. ஜி தீவுகளை விசாரிக்க இந்த முறை குறிப்பாக பயனுள்ளதாக இருக்கும், ஏனெனில் ப்ரைமரில் உள்ள சி. பி. ஜி ஜோடிகளின் எண்ணிக்கை அதிகரித்திருப்பது மதிப்பீட்டின் தனித்துவத்தை அதிகரிக்கிறது. சி. பி. ஜி ஜோடியை ப்ரைமரின் 3 'முனையில் வைப்பது உணர்திறனை மேம்படுத்துகிறது. எம். எஸ். பி. யைப் பயன்படுத்தும் ஆரம்ப அறிக்கை 0.01% அல்லீல்களின் மெத்திலேசனைக் கண்டறிய போதுமான உணர்திறனை விவரித்தது. பொதுவாக, ஒரு குறிப்பிட்ட இடத்தில் மெத்திலேஷன் நிலையை விசாரிக்கும்போது எம். எஸ். பி மற்றும் அதனுடன் தொடர்புடைய நெறிமுறைகள் மிகவும் உணர்திறன் வாய்ந்ததாகக் கருதப்படுகின்றன. மெத்திலைட் முறை எம்எஸ்பியை அடிப்படையாகக் கொண்டது, ஆனால் அளவு பிசிஆர் பயன்படுத்தி ஒரு அளவு பகுப்பாய்வை வழங்குகிறது. மெத்திலேட்டட்-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, மேலும் மெத்திலேட்டட்-குறிப்பிட்ட ஃப்ளோரசன்ஸ் ரிப்போர்ட்டர் ப்ரோப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, இது பெருக்கப்பட்ட பகுதிக்கு அனீல் செய்கிறது. மாற்று பாணியில், சம்பந்தப்பட்ட வரிசைமுறைகளுக்குள் சி. பி. ஜி ஜோடிகளுக்கு இடையே பாகுபாடு தேவைப்பட்டால், மெத்திலேஷன் குறிப்பிட்ட தன்மை இல்லாமல் ப்ரைமர்கள் அல்லது ப்ரோப் வடிவமைக்கப்படலாம். மெத்திலேட்டட் குறிப்பு டிஎன்ஏவைக் குறிக்கும் வகையில் அளவு செய்யப்படுகிறது. வெற்றிகரமாக பைசல்பைட்-மாற்றப்பட்ட டிஎன்ஏ (கான்லைட்-எம்எஸ்பி) க்கான பிசிஆரின் தனித்துவத்தை அதிகரிக்க இந்த நெறிமுறையில் ஒரு மாற்றம் இந்த குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தை அளவிட பைசல்பைட்-மாற்றப்படாத டிஎன்ஏவுக்கு கூடுதல் ஆய்வைப் பயன்படுத்துகிறது. எம்எஸ்பி-பெருக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தி மேலும் முறை உருகுதல் வளைவு பகுப்பாய்வு (மெக்-எம்எஸ்பி) பயன்படுத்தி தயாரிப்புகளை பகுப்பாய்வு செய்கிறது. இந்த முறை பைசல்பைட்-மாற்றப்பட்ட டி. என். ஏவை மெத்திலேட்டட்-குறிப்பிட்ட மற்றும் மெத்திலேட்டட்-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் இரண்டுடனும் பெருக்குகிறது, மேலும் உருகுதல் வளைவு பகுப்பாய்வில் உருவாக்கப்படும் வேறுபட்ட சிகரங்களை ஒப்பிடுவதன் மூலம் இரண்டு தயாரிப்புகளின் அளவு விகிதத்தை தீர்மானிக்கிறது. அளவீட்டு பி. சி. ஆர் மற்றும் உருகுதல் பகுப்பாய்வு ஆகிய இரண்டையும் பயன்படுத்தும் உயர் தெளிவுத்திறன் உருகுதல் பகுப்பாய்வு முறை அறிமுகப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, குறிப்பாக, குறைந்த அளவிலான மெத்திலேஷன் மைக்ரோஅரே அடிப்படையிலான முறைகளை உணர்திறன் கண்டறிவதற்காக மைக்ரோஅரே அடிப்படையிலான முறைகள் பைசல்பைட்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவை பகுப்பாய்வு செய்ய கிடைக்கக்கூடிய தொழில்நுட்பங்களின் தர்க்கரீதியான விரிவாக்கமாகும். ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு மைக்ரோஅரேக்கள் சி. பி. ஜி தளங்களை இலக்காகக் கொண்ட ஜோடி ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு கலப்பின ஆய்வுகளைப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன. ஒன்று மாற்றப்படாத மெத்திலேற்றட் வரிசைக்கு நிரப்பு, மற்றொன்று சி-டு-யு-மாற்றப்பட்ட மெத்திலேற்றட் வரிசைக்கு நிரப்பு. பைசல்பைட்டால் முழுமையடையாமல் மாற்றப்பட்ட டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கப்படுவதைத் தடுக்க ஆய்வுகள் பைசல்பைட்-குறிப்பிட்டவை. இலுமினா மெத்திலேஷன் மதிப்பீடு என்பது அத்தகைய ஒரு மதிப்பீடாகும், இது பைசல்பைட் வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்தை மைக்ரோ அரே மட்டத்தில் பயன்படுத்தி மரபணு அளவிலான மெத்திலேஷன் தரவை உருவாக்குகிறது. வரம்புகள் 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்சிட்டோசின் பைசல்பைட் வரிசைமுறை பாலூட்டி மரபணுக்கள் முழுவதும் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, இருப்பினும் ஒரு புதிய பாலூட்டி டிஎன்ஏ மாற்றம் 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்சிட்டோசின் கண்டுபிடிப்புடன் சிக்கல்கள் எழுந்துள்ளன. 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்சைட்டோசின் பைசல்பைட் சிகிச்சையின் மூலம் சைட்டோசின்-5-மெத்தில்சல்போனேட்டாக மாறுகிறது, இது வரிசைப்படுத்தப்படும்போது சி என படிக்கிறது. எனவே, பைசல்பைட் வரிசைமுறை 5-மெத்தில்சைட்டோசின் மற்றும் 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்சைட்டோசின் இடையே பாகுபாடு காட்ட முடியாது. இதன் பொருள் என்னவென்றால், பைசல்பைட் வரிசைமுறையிலிருந்து வரும் வெளியீட்டை டிஎன்ஏ மெத்திலேஷன் மட்டுமே என்று வரையறுக்க முடியாது, ஏனெனில் இது 5-மெத்தில்சைட்டோசின் மற்றும் 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்சைட்டோசின் ஆகியவற்றின் கலவையாகும். சிகாகோ பல்கலைக்கழகத்தில் சுவான் ஹீ என்பவரால் டெட்-உதவி ஆக்ஸிஜனேற்ற பைசல்பைட் வரிசைமுறையின் வளர்ச்சி இப்போது ஒற்றை அடிப்படை தெளிவுத்திறனில் இரண்டு மாற்றங்களையும் வேறுபடுத்திக் காட்ட முடிகிறது. முழுமையற்ற மாற்றம் பைசல்பைட் வரிசைமுறை ஒவ்வொரு ஒற்றை மெத்திலேற்றப்படாத சைட்டோசின் எச்சத்தையும் யூராசிலாக மாற்றுவதை நம்பியுள்ளது. மாற்றம் முழுமையடையவில்லை என்றால், அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்வு மாற்றப்படாத மெத்திலேற்றப்படாத சைட்டோசின்களை மெத்திலேட்டட் சைட்டோசின்கள் என்று தவறாக விளக்கும், இதன் விளைவாக மெத்திலேற்றலுக்கான தவறான நேர்மறையான முடிவுகள் கிடைக்கும். ஒற்றை இழையுள்ள டிஎன்ஏவில் உள்ள சைட்டோசின்கள் மட்டுமே பைசல்பைட் தாக்குதலுக்கு ஆளாகின்றன, எனவே பகுப்பாய்வுக்கு உட்படும் டிஎன்ஏவின் சிதைவு முக்கியமானது. வெப்பநிலை மற்றும் உப்பு செறிவு போன்ற எதிர்வினை அளவுருக்கள் டி. என். ஏவை ஒற்றை இழைகள் கொண்ட இணக்கத்தில் பராமரிக்கவும் முழுமையான மாற்றத்தை அனுமதிக்கவும் பொருத்தமானவை என்பதை உறுதிப்படுத்துவது முக்கியம். அகரோஸ் ஜெல்லில் டிஎன்ஏவை உட்பொதிப்பது டிஎன்ஏ இழைகளை உடல் ரீதியாக தனித்தனியாக வைத்திருப்பதன் மூலம் மாற்ற விகிதத்தை மேம்படுத்துவதாக தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது. முழுமையற்ற மாற்று விகிதங்களை மதிப்பிடலாம் மற்றும் சரிசெய்யலாம்-வரிசைமுறை நூலகத்தில் ஒரு உள் கட்டுப்பாட்டைச் சேர்ப்பதன் மூலம் வரிசைப்படுத்திய பிறகு, லாம்ப்டா பேஜ் டி. என். ஏ (இது மெத்திலேற்றப்படாதது என்று அறியப்படுகிறது) அல்லது குளோரோபிளாஸ்ட் மரபணு போன்ற உயிரினத்தில் அறியப்பட்ட மெத்திலேற்றப்படாத பகுதிக்கு பைசல்பைட் வரிசைமுறை ரீட்களை சீரமைப்பதன் மூலம். பைசல்பைட் சிகிச்சையின் போது டிஎன்ஏ சிதைவு பைசல்பைட் வரிசைமுறையில் ஒரு பெரிய சவால் டிஎன்ஏவின் சீரழிவு ஆகும், இது மாற்றத்துடன் ஒரே நேரத்தில் நடைபெறுகிறது. நீண்ட அடைகாக்கும் நேரங்கள், உயர்ந்த வெப்பநிலை மற்றும் அதிக பைசல்பைட் செறிவு போன்ற முழுமையான மாற்றத்திற்குத் தேவையான நிலைமைகள், அடைகாக்கப்பட்ட டி. என். ஏவில் சுமார் 90 சதவீதம் சீரழிவுக்கு வழிவகுக்கும். டிஎன்ஏவின் தொடக்க அளவு பெரும்பாலும் குறைவாக இருப்பதால், அத்தகைய விரிவான சீரழிவு சிக்கலானதாக இருக்கலாம். சீரழிவு சீரற்ற இழைகள் உடைவதன் விளைவாக சிதைவுகளாக நிகழ்கிறது. எனவே, விரும்பிய பி. சி. ஆர் பெருக்கி எவ்வளவு நீளமாக இருக்கிறதோ, அப்படியே இருக்கும் டெம்ப்ளேட் மூலக்கூறுகளின் எண்ணிக்கை மிகவும் குறைவாக இருக்கும். இது பி. சி. ஆர் பெருக்கத்தின் தோல்விக்கு வழிவகுக்கும், அல்லது வார்ப்புரு மூலக்கூறுகளின் வரையறுக்கப்பட்ட மாதிரியின் விளைவாக மெத்திலேஷன் நிலைகள் குறித்த அளவு துல்லியமான தகவல்களை இழக்க வழிவகுக்கும். எனவே, பயன்படுத்தப்படும் எதிர்வினை நிலைமைகளின் விளைவாக ஏற்படும் டிஎன்ஏ சீரழிவின் அளவை மதிப்பிடுவதும், இது விரும்பிய பெருக்கியை எவ்வாறு பாதிக்கும் என்பதைக் கருத்தில் கொள்வதும் முக்கியம். அடைகாக்கும் வெப்பநிலையில் சைக்கிள் ஓட்டுவது போன்ற டிஎன்ஏ சீரழிவைக் குறைக்க நுட்பங்களையும் பயன்படுத்தலாம். 2020 ஆம் ஆண்டில், நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ் டிஎன்ஏ சேதத்தைக் குறைப்பதற்கான மாற்று நொதி அணுகுமுறையான NEBNext என்சைமாடிக் மெத்தில்-செக்கை உருவாக்கியது. பிற கவலைகள் பைசல்பைட் சிகிச்சையைத் தொடர்ந்து ஒரு குறிப்பிடத்தக்க சிக்கல் என்னவென்றால், கரைசலின் போதிய அல்கலைசேஷன் காரணமாக பைரிமிடின் எச்சங்களின் முழுமையற்ற டீசல்போனேஷன் ஆகும். இது சில டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ்களைத் தடுக்கலாம், அடுத்தடுத்த பி. சி. ஆரை கடினமாக்குகிறது. இருப்பினும், டீசல்போனேஷன் முழுமையாக இருக்கும் என்பதை உறுதிப்படுத்த கரைசலின் pH ஐ கண்காணிப்பதன் மூலம் இந்த சூழ்நிலையைத் தவிர்க்க முடியும். ஒரு இறுதி கவலை என்னவென்றால், பைசல்பைட் சிகிச்சை மாதிரியில் உள்ள சிக்கலின் அளவை பெரிதும் குறைக்கிறது, இது பல பி. சி. ஆர் எதிர்வினைகள் செய்யப்பட வேண்டுமானால் சிக்கலாக இருக்கலாம் (2006). ப்ரைமர் வடிவமைப்பு மிகவும் கடினமானது, மேலும் பொருத்தமற்ற குறுக்கு கலப்பினமயமாக்கல் அடிக்கடி நிகழ்கிறது. பயன்பாடுகள்ஃ மரபணு அளவிலான மெத்திலேற்றம் பகுப்பாய்வு பைசல்பைட் வரிசைமுறையின் முன்னேற்றங்கள் அவற்றை மரபணு அளவிலான அளவில் பயன்படுத்துவதற்கான சாத்தியத்திற்கு வழிவகுத்தன, முன்பு, டிஎன்ஏ மெத்திலேசனின் உலகளாவிய அளவீடு மற்ற நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தி மட்டுமே சாத்தியமானது, அதாவது கட்டுப்பாடு மைல்கல் மரபணு ஸ்கேனிங். மனித எபிஜெனோமின் வரைபடம் பல விஞ்ஞானிகளால் மனித மரபணு திட்டத்தை நிறைவு செய்வதற்கான தர்க்கரீதியான பின்தொடர்தலாக பார்க்கப்படுகிறது. மரபணு வரிசையின் செயல்பாடு எவ்வாறு செயல்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது என்பதைப் புரிந்துகொள்வதில் இந்த எபிஜெனோமிக் தகவல் முக்கியமானதாக இருக்கும். மரபணுவை விட எபிஜெனோம் குறைவான நிலையானதாக இருப்பதால், இது மரபணு-சுற்றுச்சூழல் தொடர்புகளில் முக்கியமானதாக கருதப்படுகிறது. இருப்பினும், எபிஜெனோம் மரபணுவை விட மிகவும் மாறுபடும் என்பதால், மரபணு வரிசைமுறையை விட எபிஜெனோமிக் மேப்பிங் இயல்பாகவே மிகவும் சிக்கலானது. ஒருவரின் எபிஜெனோம் வயதுக்கு ஏற்ப மாறுபடும், திசுக்களுக்கு இடையில் வேறுபடுகிறது, சுற்றுச்சூழல் காரணிகளால் மாற்றப்படுகிறது மற்றும் நோய்களில் மாறுபாடுகளைக் காட்டுகிறது. இருப்பினும், பல்வேறு வயது, திசு வகைகள் மற்றும் நோய் நிலைகளைக் குறிக்கும் இத்தகைய வளமான எபிஜெனோமிக் மேப்பிங், எபிஜெனெடிக் மதிப்பெண்களின் இயல்பான செயல்பாடு மற்றும் வயதான மற்றும் நோய்க்கு வழிவகுக்கும் வழிமுறைகள் பற்றிய மதிப்புமிக்க தகவல்களை வழங்கும். குளோனிங் தொழில்நுட்பத்தில் சாத்தியமான முன்னேற்றங்கள் எபிஜெனோமிக் மேப்பிங்கின் நேரடி நன்மைகளில் அடங்கும். சாதாரண நம்பகத்தன்மை மற்றும் ஆயுட்காலம் கொண்ட குளோன் செய்யப்பட்ட விலங்குகளை உற்பத்தி செய்வதில் தோல்வியுற்றது எபிஜெனெடிக் மதிப்பெண்களின் பொருத்தமற்ற வடிவங்களின் விளைவாகும் என்று நம்பப்படுகிறது. மேலும், மாறுபட்ட மெத்திலேஷன் வடிவங்கள் பல புற்றுநோய்களில் நன்கு வகைப்படுத்தப்படுகின்றன. உலகளாவிய ஹைபோமெத்திலேஷன் மரபணு நிலைத்தன்மையைக் குறைக்கிறது, அதே நேரத்தில் கட்டி ஒடுக்கும் மரபணு ஊக்குவிப்பாளர்களின் உள்ளூர் ஹைபர்மெத்திலேஷன் பெரும்பாலும் அவற்றின் செயல்பாட்டு இழப்புக்கு காரணமாகிறது. மெத்திலேசனின் குறிப்பிட்ட வடிவங்கள் குறிப்பிட்ட புற்றுநோய் வகைகளைக் குறிக்கின்றன, முன்கணிப்பு மதிப்பைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் சிறந்த சிகிச்சையின் போக்கை வழிநடத்த உதவும். உலகெங்கிலும் பெரிய அளவிலான எபிஜெனோம் வரைபட முயற்சிகள் நடந்து வருகின்றன, மேலும் அவை மனித எபிஜெனோம் திட்டத்தின் கீழ் ஏற்பாடு செய்யப்பட்டுள்ளன. இது ஒரு பல அடுக்கு மூலோபாயத்தை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இதன் மூலம் பைசல்பைட் வரிசைமுறை ஒரு குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான குறிப்பு எபிஜெனோம்களுக்கான உயர் தெளிவுத்திறன் மெத்திலேஷன் சுயவிவரங்களைப் பெற பயன்படுத்தப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் பரந்த அளவிலான மாதிரிகளில் குறைவான முழுமையான பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. இந்த அணுகுமுறை ஒரு குறிப்பிட்ட அளவு வளங்களிலிருந்து பெறப்பட்ட நுண்ணறிவை அதிகரிப்பதை நோக்கமாகக் கொண்டுள்ளது, ஏனெனில் உயர் தெளிவுத்திறன் கொண்ட மரபணு அளவிலான வரைபடம் ஒரு விலையுயர்ந்த பணியாக உள்ளது. மரபணு-தொகுப்பு பகுப்பாய்வு (எடுத்துக்காட்டாக டேவிட் மற்றும் கோசெக் போன்ற கருவிகளைப் பயன்படுத்துதல்) உயர்-செயல்திறன் மெத்திலேஷன் தரவுகளுக்கு (எ. கா. மரபணு அளவிலான பைசல்பைட் வரிசைமுறை); ஒவ்வொரு மரபணுவையும் குறிவைக்கும் சிபிஜி ஆய்வுகள்/சிபிஜி தளங்களின் எண்ணிக்கையில் உள்ள வேறுபாடுகளைக் கட்டுப்படுத்த மாதிரி லேபிள் வரிசைமாற்றங்களைப் பயன்படுத்தி அல்லது புள்ளிவிவர மாதிரியைப் பயன்படுத்தி இதைச் சரிசெய்ய முடியும் என்று பரிந்துரைக்கப்படுகிறது. ஆக்ஸிஜனேற்ற பைசல்பைட் வரிசைமுறை 5-மெத்தில்சிட்டோசின் மற்றும் 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்சிட்டோசின் இரண்டும் பைசல்பைட் வரிசைமுறையில் சி ஆகப் படிக்கப்படுகின்றன. ஆக்சிஜனேற்ற பைசல்பைட் வரிசைமுறை என்பது 5-மெத்தில் சைட்டோசின் மற்றும் 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில் சைட்டோசின் இடையே ஒற்றை அடிப்படை தெளிவுத்திறனில் வேறுபடுத்துவதற்கான ஒரு முறையாகும். இந்த முறை 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்ஸைட்டோசினின் ஒரு குறிப்பிட்ட (டெட்-உதவி) இரசாயன ஆக்சிஜனேற்றத்தை 5-ஃபார்மைல்ஸைட்டோசினாகப் பயன்படுத்துகிறது, இது பின்னர் பைசல்பைட் சிகிச்சையின் போது யூராசிலாக மாறுகிறது. டிஎன்ஏ மாதிரியில் உண்மையான மெத்திலேஷன் நிலையின் வரைபடத்தை வழங்கும் 5-மெத்தில்ஸைட்டோசின் மட்டுமே சி என்று படிக்கும் ஒரே அடித்தளமாகும். பைசல்பைட் மற்றும் ஆக்சிஜனேற்ற பைசல்பைட் வரிசைமுறைக்கு இடையிலான வேறுபாட்டை அளவிடுவதன் மூலம் 5-ஹைட்ராக்ஸிமெத்தில்சைட்டோசின் அளவுகளையும் அளவிட முடியும். குறைக்கப்பட்ட பிரதிநிதித்துவம் பைசல்பைட் வரிசைமுறை குறிப்புகள் வெளிப்புற இணைப்புகள் பைசல்பைட் மாற்று நெறிமுறை மனித எபிஜெனோம் திட்டம் (எச். இ. பி)-தரவு-சாங்கர் இன்ஸ்டிடியூட் தி எபிஜெனோம் நெட்வொர்க் ஆஃப் எக்ஸலன்ஸ் மூலக்கூறு உயிரியல் எபிஜெனெடிக்ஸ் மரபியல் நுட்பங்கள்