Digital transcriptome subtraction
டிஜிட்டல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் கழித்தல் (டி. டி. எஸ்) என்பது புரவலன் வரிசைகளின் கணக்கீட்டு அகற்றல் மூலம் புதிய நோய்க்கிருமி டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் இருப்பைக் கண்டறிய ஒரு உயிர் தகவலியல் முறையாகும். டிடிஎஸ் என்பது ஈரமான-ஆய்வக அணுகுமுறை பிரதிநிதித்துவ வேறுபாடு பகுப்பாய்வின் (ஆர்டிஏ) நேரடி சிலிகோ அனலாக் ஆகும், மேலும் இது பக்கச்சார்பற்ற உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை மற்றும் ஹோஸ்டின் உயர்தர, சிறுகுறிப்பு குறிப்பு மரபணு கிடைப்பதன் மூலம் சாத்தியமானது. இந்த முறை குறிப்பாக தொற்று நோய்களின் நோய்க்குறியியல் முகவரை ஆராய்கிறது மற்றும் மேர்க்கெல் செல் புற்றுநோயை ஏற்படுத்தும் சந்தேகத்திற்குரிய முகவரான மேர்க்கெல் செல் பாலிமாவைரஸைக் கண்டுபிடிப்பதில் மிகவும் பிரபலமானது. புதிய நோய்க்கிருமிகளைக் கண்டறிய கணக்கீட்டு கழித்தலைப் பயன்படுத்துவது முதன்முதலில் 2002 ஆம் ஆண்டில் மேயர்சன் மற்றும் பலர் முன்மொழிந்தனர். மனித வெளிப்படுத்தப்பட்ட வரிசை குறிச்சொல் (EST) தரவுத்தொகுப்புகளைப் பயன்படுத்துதல். கொள்கை பரிசோதனையின் சான்றாக, மேயர்சன் மற்றும் பலர். இடமாற்றத்திற்குப் பிந்தைய நிணநீர் பெருக்கக் கோளாறில் (பி. டி. எல். டி) எப்ஸ்டீன்-பார் வைரஸ்-பாதிக்கப்பட்ட நிணநீர் செல்களைப் பயன்படுத்தி இது ஒரு சாத்தியமான அணுகுமுறை என்பதை நிரூபித்தது. 2007 ஆம் ஆண்டில், "டிஜிட்டல் டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் கழித்தல்" என்ற சொல் சாங்-மூர் குழுவால் உருவாக்கப்பட்டது, மேலும் மேர்க்கெல் செல் புற்றுநோயில் மேர்க்கெல் செல் பாலிமாவைரஸைக் கண்டறிய பயன்படுத்தப்பட்டது. எம்சிவி கண்டுபிடிப்புக்கு ஒரே நேரத்தில், இந்த அணுகுமுறை ஒரு நன்கொடையாளரிடமிருந்து உறுப்பு மாற்று அறுவை சிகிச்சையைத் தொடர்ந்து மூன்று நோயாளிகள் இதே போன்ற நோய்களால் இறந்த ஒரு வழக்கில் ஒரு புதிய அரினா வைரஸை இறப்புக்கான காரணமாக உட்படுத்த பயன்படுத்தப்பட்டது. முறை சி. டி. என். ஏ நூலகத்தின் கட்டுமானம் மனித மரபணு டி. என். ஏவை அகற்ற டினேஸ் I உடன் சிகிச்சைக்குப் பிறகு, மொத்த ஆர்என்ஏ முதன்மை பாதிக்கப்பட்ட திசுவிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்படுகிறது. மெசஞ்சர் ஆர்என்ஏ பின்னர் பாலி-ஏ வாலுடன் பிணைக்கும் ஒலிகோ-டிடி நெடுவரிசையைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்படுகிறது, இது குறிப்பாக டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்பட்ட மரபணுக்களில் காணப்படும் ஒரு சமிக்ஞையாகும். சீரற்ற ஹெக்ஸாமர்களைப் பயன்படுத்தி, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் (ஆர்டி) அனைத்து எம்ஆர்என்ஏவையும் சிடிஎன்ஏவாக மாற்றுகிறது மற்றும் பாக்டீரியா திசையன்களாக குளோன் செய்யப்படுகிறது. பாக்டீரியாக்கள், பொதுவாக ஈ. கோலை, பின்னர் சிடிஎன்ஏ திசையன்களைப் பயன்படுத்தி மாற்றப்பட்டு ஒரு மார்க்கரைப் பயன்படுத்தி தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன, மாற்றப்பட்ட குளோன்களின் தொகுப்பு சிடிஎன்ஏ நூலகமாகும். இது திசு எம்ஆர்என்ஏவின் ஸ்னாப்-ஷாட்டை உருவாக்குகிறது, இது நிலையானது மற்றும் பிற்காலத்தில் வரிசைப்படுத்தப்படலாம். வரிசைமுறை மற்றும் தரக் கட்டுப்பாடு சிடிஎன்ஏ நூலகம் மிகவும் ஆழமாக வரிசைப்படுத்தப்பட வேண்டும் (அதாவது. ஒரு கோட்பாட்டு அரிய நோய்க்கிருமி வரிசையைக் கண்டறிவதற்காக (அட்டவணை 1), குறிப்பாக அந்நிய வரிசை புதுமையானதாக இருந்தால். சாங்-மூர் பல வரிசைமுறை தளங்களைப் பயன்படுத்தி 200,000 டிரான்ஸ்கிரிப்ட்கள் அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட வரிசைமுறை ஆழத்தை பரிந்துரைக்கிறார். தவறான-நேர்மறை முடிவுகளைக் குறைக்க மூல வரிசைமுறைகளுக்கு கடுமையான தரக் கட்டுப்பாடு பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஆரம்ப தரமான திரை தெளிவற்ற வரிசைகளை விலக்க பல பொதுவான அளவுருக்களைப் பயன்படுத்துகிறது, உயர்-நம்பகத்தன்மை (ஹை-ஃபை) ரீட்களின் தரவுத்தொகுப்பை விட்டுச்செல்கிறது. குறைந்த ஃப்ரெட் ஸ்கோர் கட்ஆஃப் குறைந்த தரமான இறுதி காட்சிகளை அகற்ற பயன்படுத்தப்படுகிறது. பொதுவாக, ஒவ்வொரு அடிப்படை அழைப்பிலும் 99%-99.9% துல்லியத்தை உறுதிப்படுத்த 20 அல்லது 30 என்ற ஃப்ரெட் ஸ்கோர் கட்ஆஃப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. திசையன் மற்றும் அடாப்டர் அகற்றுதல். குறைந்த சிக்கலானது-ஒரு வரிசையின் சிக்கலானது பாலி-டிடி அல்லது பாலி-டிஏ போன்ற ஒரு தொடரில் (ஹோமோ-பாலிமர்கள்) ஒரே மாதிரியான தளங்களின் எண்ணிக்கையை பிரதிபலிக்கிறது. மனித மறுசுழற்சி டிஎன்ஏ. நீளம்-அளவுரு பயன்படுத்தப்பட்ட வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்திற்கு குறிப்பிட்ட உகந்த வாசிப்பு நீளத்தைப் பொறுத்தது. இ. கோலை மரபணு வரிசைகளை வெடிக்கச் செய்து விலக்குங்கள். மெகாபிளாஸ்டைப் பயன்படுத்தி, ஹை-ஃபை ரீட்கள் பின்னர் சிறுகுறிப்பு தரவுத்தளங்களில் உள்ள வரிசைகளுடன் பொருந்துகின்றன, மேலும் எந்தவொரு நேர்மறையான பொருத்தங்களும் தரவுத்தொகுப்பிலிருந்து கழிக்கப்படுகின்றன. மனித வரிசையின் நேர்மறையான பொருத்தத்திற்கான குறைந்தபட்ச ஹிட் நீளம் பொதுவாக 30 தொடர்ச்சியான ஒத்த தளங்கள் ஆகும், இது BLAST மதிப்பெண் 60 க்கு சமம்; பொதுவாக, மீதமுள்ள வரிசை சிறிய பொருந்தாத தன்மைகளை (20 நியூக்ளியோடைடில் 1) அனுமதிக்க குறைவான கடுமையான அளவுருக்களுடன் மீண்டும் BLAST ஆகும். இந்த கட்டத்தில் பெரும்பாலான வரிசைகள் (> 99 சதவீதம்) தரவுத்தொகுப்பிலிருந்து அகற்றப்பட வேண்டும். கழிக்கப்பட்ட வரிசைகளில் பொதுவாக பின்வருவன அடங்கும்ஃ குறிப்பு மனித டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்-வெளிப்பாடு நூலக தொகுப்புகளிலிருந்து அறியப்பட்ட எந்தவொரு மனித டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களையும் நீக்குகிறது. குறிப்பு மனித மரபணு-சி. டி. என். ஏ நூலக கட்டுமானத்தின் போது சிறுகுறிப்பு செயல்முறை மற்றும் எந்தவொரு மாசுபடுத்தும் மரபணு வரிசைகளாலும் தவறவிட்ட மரபணுக்களை நீக்குகிறது. மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ-மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ விரைவான பிறழ்வு விகிதம் காரணமாக மிகவும் ஏராளமாகவும் பன்முகத்தன்மையுடனும் உள்ளன. இம்யூனோகுளோபூலின் பகுதி-இம்யூனோகுளோபூலின் இருப்பிடம் மிகவும் பாலிமார்பிக் ஆகும், இல்லையெனில் குறிப்பு மரபணுவுடன் மோசமான சீரமைப்பு காரணமாக தவறான-நேர்மறையை ஏற்படுத்தும். பிற முதுகெலும்பு வரிசைகள் "புரவலன் அல்லாத" வேட்பாளர்களின் கணக்கிடப்படாத வரிசைகள் பகுப்பாய்வு நோய்க்கிருமி தரவுத்தளங்களுடன் சீரமைத்தல் கடுமையான கழித்தல் சுற்றுகளுக்குப் பிறகு, மீதமுள்ள வரிசைகள் குறைவாக இல்லாத இணைப்புகளாக தொகுக்கப்பட்டு குறைந்த-இறுக்கமான அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி அறியப்பட்ட நோய்க்கிருமி வரிசைகளுடன் சீரமைக்கப்படுகின்றன. நோய்க்கிருமி மரபணுக்கள் விரைவாக பிறழ்வடைவதால், நியூக்ளியோடைடு-நியூக்ளியோடைடு சீரமைப்புகள் அல்லது பிளாஸ்டன் பொதுவாக தகவலறிந்தவை அல்ல, ஏனெனில் கோடான் சிதைவு காரணமாக அமினோ அமில எச்சத்தை மாற்றாமல் சில தளங்களில் பிறழ்வுகள் ஏற்பட வாய்ப்புள்ளது. அனைத்து 6 திறந்த வாசிப்பு கட்டமைப்புகளின் சிலிகோ மொழிபெயர்க்கப்பட்ட புரத வரிசைகளையும் அமினோ அமில வரிசையுடன் சிறுகுறிப்பு புரதங்கள் அல்லது பிளாஸ்ட்எக்ஸ் உடன் பொருத்துவது விருப்பமான சீரமைப்பு முறையாகும், ஏனெனில் இது ஒரு தொடர்புடைய திரிபு/இனங்களுடன் பொருந்துவதன் மூலம் ஒரு புதிய நோய்க்கிருமியை அடையாளம் காணும் வாய்ப்பை அதிகரிக்கிறது. நேர்மறையான பொருத்தத்திற்கான வாய்ப்புகளை அதிகரிக்க இந்த கட்டத்தில் கேண்டிடேட் வரிசைகளின் சோதனை நீட்டிப்பும் பயன்படுத்தப்படலாம். டி நோவோ அசெம்பிளி அறியப்பட்ட நோய்க்கிருமிகளுடனான சீரமைப்பு தகவலற்றதாகவோ அல்லது தெளிவற்றதாகவோ இருக்கும் சந்தர்ப்பங்களில், முழுமையான நோய்க்கிருமி மரபணு வரிசையை உருவாக்க முதன்மை பாதிக்கப்பட்ட திசுக்களில் ப்ரைமர் நடைபயிற்சி செய்வதற்கான வார்ப்புருக்களாக கேண்டிடேட் வரிசையின் இணைப்புகளைப் பயன்படுத்தலாம். வைரஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ட்கள் மிகவும் அரிதான விகிதம் திசு எம்ஆர்என்ஏ (1 மில்லியனில் 10 டிரான்ஸ்கிரிப்ட்கள்) என்பதால், குறைந்த பாதுகாப்பு காரணமாக அசல் கேண்டிடேட் காட்சிகளின் அடிப்படையில் மட்டுமே ஒரு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமை உருவாக்க வாய்ப்பில்லை. நோய்க்கிருமியின் சரிபார்ப்பு உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை தரவுகளில் ஒரு புட்டேடிவ் நோய்க்கிருமி அடையாளம் காணப்பட்டவுடன், பாதிக்கப்பட்ட நோயாளிகளில் நோய்க்கிருமி இருப்பதை அதிக உணர்திறன் கொண்ட நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தி சரிபார்க்க வேண்டியது அவசியம், அதாவதுஃ ஆர்டி-பிசிஆர் மற்றும் நோய்க்கிருமி எம்ஆர்என்ஏ இருப்பதை உறுதிப்படுத்த 3 '-மற்றும் 5'-ரேஸ் உள்ளிட்ட வழித்தோன்றல் முறைகள். திசுக்களில் உள்ள நோய்க்கிருமி இருப்பதை தீர்மானிக்க தொடர்புடைய நோய்க்கிருமிக்கு ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிஸ்ட்ரி. நோய்க்கிருமி-குறிப்பிட்ட ஆன்டிபாடி டைட்டரை அளவிடுவதற்கான செரோலாஜிக்கல் சோதனைகள். பாக்டீரியா கலாச்சாரம்/வைரஸ் கலாச்சாரம், இது ஆய்வக நோயறிதலில் தங்கத் தரமாகக் கருதப்படுகிறது. பயன்பாடுகள் டிடிஎஸ்-க்கான முதன்மை பயன்பாடு புற்றுநோயில் நோய்க்கிருமி வைரஸ்களை அடையாளம் காண்பதில் உள்ளது. புற்றுநோய் அல்லாத நோய்களில் வைரஸ் நோய்க்கிருமிகளை அடையாளம் காணவும் இதைப் பயன்படுத்தலாம். எதிர்கால மருத்துவ பயன்பாடுகளில் தனிநபர்களில் வழக்கமான அடிப்படையில் டி. டி. எஸ் பயன்பாடு அடங்கும். டிடிஎஸ் விவசாயத்திற்கும் பொருந்தும், உற்பத்தியில் தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும் நோய்க்கிருமிகளை அடையாளம் காணும். கணக்கீட்டு கழித்தல் ஏற்கனவே ஒரு மெட்டஜெனோமிக்ஸ் ஆய்வில் பயன்படுத்தப்பட்டது, இது ஐஏபிவி மூலம் வைரஸ் நோய்த்தொற்றை தேனீக்களில் காலனி சரிவு கோளாறுடன் தொடர்புபடுத்தியது. நன்மைகள் நோய்க்கிருமி வரிசை பற்றி முன் அறிவு தேவையில்லை. முன்பு தொடர்புபடுத்தப்படாத, சிகிச்சையளிக்கக்கூடிய நோய்க்கிருமிகளை அடையாளம் காண முடியும். ஏற்கனவே கிடைக்கக்கூடிய மூலக்கூறு முறைகள் மற்றும் வளங்களைப் பயன்படுத்துகிறது. குறைபாடுகள் நோய்க்கிருமி இருப்பதை அடையாளம் காட்டுகின்றன, ஆனால் நோய்க்கான காரண இணைப்பை நிறுவுவதில்லை. கோக்கின் அனுமானம் மற்றும் பிராட்போர்டு ஹில் அளவுகோல்களைப் பார்க்கவும். ஆய்வு செய்யப்படும் உயிரினத்திற்கு மிகவும் நம்பகமான, முழுமையான குறிப்பு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் இருக்க வேண்டும். அயல் வரிசை அடையாளம் இல்லாதது ஒரு நோய்க்கிருமி அயல் பொருளை முற்றிலுமாக விலக்க முடியாது. குறிப்புகள் உயிர் தகவலியல்