Illumina dye sequencing
இலுமினா சாய வரிசைமுறை என்பது டிஎன்ஏவில் உள்ள அடிப்படை ஜோடிகளின் தொடரைத் தீர்மானிக்கப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு நுட்பமாகும், இது டிஎன்ஏ வரிசைமுறை என்றும் அழைக்கப்படுகிறது. மாற்றியமைக்கக்கூடிய வேதியியல் கருத்துரு பாரிஸில் உள்ள பாஸ்டர் நிறுவனத்தில் புருனோ கனார்ட் மற்றும் சைமன் சர்ஃபாடி ஆகியோரால் கண்டுபிடிக்கப்பட்டது. இது கேம்பிரிட்ஜ் பல்கலைக்கழகத்தைச் சேர்ந்த சங்கர் பாலசுப்ரமணியன் மற்றும் டேவிட் க்ளெனர்மேன் ஆகியோரால் உருவாக்கப்பட்டது, பின்னர் அவர் சோலெக்ஸாவை நிறுவினார், இது பின்னர் இல்லுமினாவால் கையகப்படுத்தப்பட்டது. இந்த வரிசைமுறை முறை டிஎன்ஏ இழைகளின் மீது கழுவப்படும்போது ஒற்றை நியூக்ளியோடைடுகளை அடையாளம் காண உதவும் தலைகீழ் சாய-முனையர்களை அடிப்படையாகக் கொண்டது. இது முழு-மரபணு மற்றும் பிராந்திய வரிசைமுறை, டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் பகுப்பாய்வு, மெட்டஜெனோமிக்ஸ், சிறிய ஆர்என்ஏ கண்டுபிடிப்பு, மெத்திலேஷன் விவரக்குறிப்பு மற்றும் மரபணு அளவிலான புரத-நியூக்ளிக் அமில தொடர்பு பகுப்பாய்வு ஆகியவற்றிற்கும் பயன்படுத்தப்படலாம். கண்ணோட்டம் இது மூன்று அடிப்படை படிகளில் செயல்படுகிறதுஃ பெருக்குதல், வரிசைப்படுத்துதல் மற்றும் பகுப்பாய்வு செய்தல். இந்த செயல்முறை சுத்திகரிக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவுடன் தொடங்குகிறது. டிஎன்ஏ துண்டிக்கப்பட்டு, பெருக்கம், வரிசைமுறை மற்றும் பகுப்பாய்வு ஆகியவற்றின் போது குறிப்பு புள்ளிகளாக செயல்படும் பிரிவுகளைக் கொண்ட அடாப்டர்கள் சேர்க்கப்படுகின்றன. மாற்றியமைக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ ஒரு ஓட்டம் செல்லில் ஏற்றப்படுகிறது, அங்கு பெருக்கம் மற்றும் வரிசைமுறை நடைபெறும். ஓட்டம் செல் நானோவெல்ல்களைக் கொண்டுள்ளது, அவை துண்டுகளை வெளியேற்றி கூட்ட நெரிசலுக்கு உதவுகின்றன. ஒவ்வொரு நானோவெல்லிலும் ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகள் உள்ளன, அவை அடாப்டர்கள் இணைக்க ஒரு நங்கூரமிடும் புள்ளியை வழங்குகின்றன. துண்டுகள் இணைக்கப்பட்டவுடன், கொத்து உருவாக்கம் என்று அழைக்கப்படும் ஒரு கட்டம் தொடங்குகிறது. இந்த படி டிஎன்ஏவின் ஒவ்வொரு துண்டின் ஆயிரம் பிரதிகளை உருவாக்குகிறது மற்றும் பிரிட்ஜ் பெருக்கம் பி. சி. ஆர் மூலம் செய்யப்படுகிறது. அடுத்து, ப்ரைமர்கள் மற்றும் மாற்றியமைக்கப்பட்ட நியூக்ளியோடைடுகள் சிப்பில் கழுவப்படுகின்றன. இந்த நியூக்ளியோடைடுகள் ஒரு தலைகீழ் ஒளிரும் தடுப்பானைக் கொண்டுள்ளன, எனவே டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் டிஎன்ஏ துண்டில் ஒரு நேரத்தில் ஒரு நியூக்ளியோடைடை மட்டுமே சேர்க்க முடியும். ஒவ்வொரு சுற்று தொகுப்புக்குப் பிறகும், ஒரு கேமரா சிப்பின் படத்தை எடுக்கிறது. ஃப்ளோரசன்ட் குறிச்சொல்லின் அலைநீளம் மூலம் எந்த அடித்தளம் சேர்க்கப்பட்டது என்பதை ஒரு கணினி தீர்மானிக்கிறது மற்றும் சிப்பில் உள்ள ஒவ்வொரு இடத்திற்கும் அதை பதிவு செய்கிறது. ஒவ்வொரு சுற்றுக்குப் பிறகும், இணைக்கப்படாத மூலக்கூறுகள் கழுவப்படுகின்றன. 3 'ஃப்ளோரசன்ட் முனையத் தடுப்புக் குழுவை அகற்ற ஒரு இரசாயன நீக்குதல் படி பயன்படுத்தப்படுகிறது. முழு டிஎன்ஏ மூலக்கூறு வரிசைப்படுத்தப்படும் வரை இந்த செயல்முறை தொடர்கிறது. இந்த தொழில்நுட்பத்தின் மூலம், மரபணு அமைப்பு முழுவதும் ஆயிரக்கணக்கான இடங்கள் ஒரே நேரத்தில் பெரிய இணையான வரிசைமுறை மூலம் வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன. செயல்முறை மரபணு நூலகம் டிஎன்ஏ சுத்திகரிக்கப்பட்ட பிறகு, ஒரு டிஎன்ஏ நூலகம், மரபணு நூலகம் உருவாக்கப்பட வேண்டும். ஒரு மரபணு நூலகத்தை உருவாக்க இரண்டு வழிகள் உள்ளன, சோனிகேஷன் மற்றும் டேக்மென்டேஷன். டேக்மென்டேஷன் மூலம், டிரான்ஸ்போசேஸ்கள் சீரற்ற முறையில் டிஎன்ஏவை 50 முதல் 500 பிபி துண்டுகளுக்கு இடையில் அளவுகளாக வெட்டி, ஒரே நேரத்தில் அடாப்டர்களை சேர்க்கின்றன. மரபணு டிஎன்ஏவை துண்டு துண்டாக சோனிகேஷனைப் பயன்படுத்துவதன் மூலமும் ஒரு மரபணு நூலகத்தை உருவாக்க முடியும். மின்காந்த ஒலி அலைகளைப் பயன்படுத்தி டிஎன்ஏவை ஒத்த அளவுகளாக சோனிகேஷன் துண்டுகள். வலது மற்றும் இடது அடாப்டர்கள் சோனிகேஷனுக்குப் பிறகு டி 7 டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் மற்றும் டி 4 டிஎன்ஏ லிகேஸ் மூலம் இணைக்கப்பட வேண்டும். அடாப்டர்கள் இணைக்கப்படாத இழைகள் கழுவப்படுகின்றன. அடாப்டர்கள் அடாப்டர்கள் மூன்று வெவ்வேறு பிரிவுகளைக் கொண்டுள்ளனஃ திடமான ஆதரவுக்கு நிரப்பு வரிசை (ஓட்டம் செல்லில் உள்ள ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகள்), பார்கோடு வரிசை (குறியீடுகள்) மற்றும் வரிசைமுறை ப்ரைமருக்கான பிணைப்பு தளம். குறியீடுகள் பொதுவாக ஆறு அடிப்படை ஜோடிகள் நீளமானவை மற்றும் மாதிரிகளை அடையாளம் காண டிஎன்ஏ வரிசை பகுப்பாய்வின் போது பயன்படுத்தப்படுகின்றன. குறியீடுகள் 96 வெவ்வேறு மாதிரிகளை ஒன்றாக இயக்க அனுமதிக்கின்றன, இது மல்டிபிளெக்சிங் என்றும் அழைக்கப்படுகிறது. பகுப்பாய்வின் போது, கணினி அனைத்து வாசிப்புகளையும் ஒரே குறியீட்டுடன் ஒன்றாக தொகுக்கும். இல்லுமினா ஒரு "தொகுப்பின் மூலம் வரிசை" அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்துகிறது. இந்த செயல்முறை அக்ரிலாமைடு பூசப்பட்ட கண்ணாடி ஓட்ட செல்லின் உள்ளே நடைபெறுகிறது. ஓட்ட உயிரணுவில் உயிரணுவின் அடிப்பகுதியில் ஒலிக்கோ நியூக்ளியோடைடுகள் (குறுகிய நியூக்ளியோடைடு வரிசைகள்) உள்ளன, மேலும் அவை வரிசைமுறையின் போது டி. என். ஏ இழைகளை தக்கவைக்க திடமான ஆதரவாக செயல்படுகின்றன. துண்டு துண்டான டிஎன்ஏ ஓட்டம் கலத்தின் மீது கழுவப்படுவதால், பொருத்தமான அடாப்டர் நிரப்பு திடமான ஆதரவுடன் இணைக்கப்படுகிறது. பாலம் பெருக்கம் இணைக்கப்பட்டவுடன், கிளஸ்டர் உற்பத்தியைத் தொடங்கலாம். ஒரே மாதிரியான நூற்றுக்கணக்கான டிஎன்ஏ இழைகளை உருவாக்குவதே குறிக்கோள். சில முன்னோக்கி இழையாக இருக்கும்; மீதமுள்ளவை, தலைகீழாக இருக்கும். இதனால்தான் வலது மற்றும் இடது அடாப்டர்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பாலம் பெருக்கம் மூலம் கிளஸ்டர்கள் உருவாக்கப்படுகின்றன. டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் டிஎன்ஏவின் ஒரு இழையுடன் நகர்கிறது, அதன் நிரப்பு இழையை உருவாக்குகிறது. அசல் தண்டு கழுவப்பட்டு, தலைகீழ் இழையை மட்டுமே விட்டுச்செல்கிறது. தலைகீழ் இழையின் மேற்புறத்தில் ஒரு அடாப்டர் வரிசை உள்ளது. டிஎன்ஏ ஸ்ட்ராண்ட் வளைந்து ஒலிகோவுடன் இணைகிறது, இது மேல் அடாப்டர் வரிசைக்கு நிரப்பு ஆகும். பாலிமரேஸ்கள் தலைகீழ் இழையுடன் இணைக்கப்படுகின்றன, மேலும் அதன் நிரப்பு இழைகள் (அசல் இழையை ஒத்தவை) உருவாக்கப்படுகின்றன. இப்போது இரட்டை ஸ்ட்ராண்டட் டிஎன்ஏ இயற்கைக்கு மாறானது, இதனால் ஒவ்வொரு இழையும் ஓட்டம் செல்லில் நங்கூரமிடப்பட்ட ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடு வரிசையுடன் தனித்தனியாக இணைக்க முடியும். ஒன்று தலைகீழ் இழையாக இருக்கும், மற்றொன்று முன்னோக்கி இருக்கும். இந்த செயல்முறை பிரிட்ஜ் பெருக்கம் என்று அழைக்கப்படுகிறது, மேலும் இது ஒரே நேரத்தில் ஃப்லோ செல் முழுவதும் ஆயிரக்கணக்கான கிளஸ்டர்களுக்கு நிகழ்கிறது. குளோனல் பெருக்கம் மீண்டும் மீண்டும், டிஎன்ஏ இழைகள் வளைந்து திடமான ஆதரவுடன் இணைக்கப்படும். டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஒரு புதிய இழையை ஒருங்கிணைத்து இரட்டை சிக்கலான பகுதியை உருவாக்கும், மேலும் அது இயல்பற்றதாக இருக்கும், இதனால் ஒரு பகுதியில் உள்ள அனைத்து டிஎன்ஏ இழைகளும் ஒரே மூலத்திலிருந்து (குளோனல் பெருக்கம்) வரும். தரக் கட்டுப்பாட்டு நோக்கங்களுக்காக குளோனல் பெருக்கம் முக்கியமானது. ஒரு ஸ்ட்ராண்ட் ஒற்றைப்படை வரிசையைக் கொண்டிருப்பது கண்டறியப்பட்டால், விஞ்ஞானிகள் தலைகீழ் ஸ்ட்ராண்டை சரிபார்த்து, அது அதே ஒற்றைப்படைத்தன்மையின் நிரப்பு என்பதை உறுதிப்படுத்தலாம். முன்னோக்கி மற்றும் தலைகீழ் இழைகள் கலைப்பொருட்களிலிருந்து பாதுகாப்பதற்கான காசோலைகளாக செயல்படுகின்றன. இல்லுமினா வரிசைமுறை டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைப் பயன்படுத்துவதால், அடிப்படை மாற்று பிழைகள் காணப்படுகின்றன, குறிப்பாக 3 'முடிவில். கிளஸ்டர் ஜெனரேஷனுடன் இணைந்த ஜோடி எண்ட் ரீட்கள் பிழை ஏற்பட்டதை உறுதிப்படுத்த முடியும். தலைகீழ் மற்றும் முன்னோக்கி இழைகள் ஒருவருக்கொருவர் நிரப்பு இருக்க வேண்டும், அனைத்து தலைகீழ் வாசிப்புகளும் ஒருவருக்கொருவர் பொருந்த வேண்டும், மேலும் அனைத்து முன்னோக்கி வாசிப்புகளும் ஒருவருக்கொருவர் பொருந்த வேண்டும். ஒரு ரீட் அதன் சகாக்களுக்கு போதுமான ஒத்ததாக இல்லாவிட்டால் (அதனுடன் அது ஒரு குளோனாக இருக்க வேண்டும்), ஒரு பிழை ஏற்பட்டிருக்கலாம். சில ஆய்வகங்களின் பகுப்பாய்வுகளில் குறைந்தபட்சம் 97 சதவீதம் ஒற்றுமை பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது. தொகுப்பின் மூலம் வரிசை குளோனல் பெருக்கத்தின் முடிவில், அனைத்து தலைகீழ் இழைகளும் ஓட்டம் செல்லிலிருந்து கழுவப்பட்டு, முன்னோக்கி இழைகளை மட்டுமே விட்டுச்செல்கின்றன. ஒரு ப்ரைமர் முன்னோக்கி இழைகள் அடாப்டர் ப்ரைமர் பிணைப்பு தளத்துடன் இணைக்கப்படுகிறது, மேலும் ஒரு பாலிமரேஸ் டிஎன்ஏ இழையில் ஒளிரும் வகையில் குறிக்கப்பட்ட டிஎன்டிபியை சேர்க்கிறது. ஃப்ளோரோஃபோர் ஒரு தடுப்புக் குழுவாக செயல்படுவதால் ஒரு சுற்றுக்கு ஒரு தளத்தை மட்டுமே சேர்க்க முடியும்; இருப்பினும், தடுப்புக் குழு மீளக்கூடியது. நான்கு வண்ண வேதியியலைப் பயன்படுத்தி, நான்கு தளங்களில் ஒவ்வொன்றும் ஒரு தனித்துவமான உமிழ்வைக் கொண்டுள்ளன, மேலும் ஒவ்வொரு சுற்றுக்குப் பிறகும், எந்த தளம் சேர்க்கப்பட்டது என்பதை இயந்திரம் பதிவு செய்கிறது. நிறம் பதிவு செய்யப்பட்டவுடன் ஃப்ளோரோஃபோர் கழுவப்பட்டு மற்றொரு டி. என். டி. பி ஓட்டம் கலத்தின் மீது கழுவப்பட்டு செயல்முறை மீண்டும் செய்யப்படுகிறது. நெக்ஸ்ட்செக் மற்றும் பின்னர் மினிஸெக் ஆகியவற்றின் வெளியீட்டில் தொடங்கி, இல்லுமினா ஒரு புதிய இரண்டு வண்ண வரிசை வேதியியலை அறிமுகப்படுத்தியது. நியூக்ளியோடைடுகள் இரண்டு வண்ணங்களில் ஒன்று (சிவப்பு அல்லது பச்சை), நிறம் இல்லை ("கருப்பு") அல்லது இரண்டு வண்ணங்களையும் இணைப்பதன் மூலம் வேறுபடுகின்றன (சிவப்பு மற்றும் பச்சை நிறங்களுக்கு இடையில் கலவையாக ஆரஞ்சு நிறத்தில் தோன்றும்). டிஎன்ஏ ஸ்ட்ராண்ட் படித்தவுடன், இப்போது சேர்க்கப்பட்ட ஸ்ட்ராண்ட் கழுவப்படுகிறது. பின்னர், குறியீட்டு 1 ப்ரைமர் இணைக்கப்பட்டு, குறியீட்டு 1 வரிசையை பாலிமரைஸ் செய்து கழுவப்படுகிறது. இழைகள் மீண்டும் ஒரு பாலத்தை உருவாக்குகிறது, மேலும் டிஎன்ஏ இழையின் 3 'முனை ஓட்டம் செல்லில் ஒரு ஒலிகோவுடன் இணைகிறது. குறியீட்டு 2 ப்ரைமர் இணைக்கப்பட்டு, வரிசையை பாலிமரைஸ் செய்து, கழுவப்படுகிறது. ஒரு பாலிமரேஸ் வளைந்த இழையின் மேல் நிரப்பு இழையை வரிசைப்படுத்துகிறது. அவை பிரிக்கப்படுகின்றன, மேலும் ஒவ்வொரு இழையின் 3 'முனையும் தடுக்கப்படுகிறது. முன்னோக்கி இழைகள் கழுவப்பட்டு, தொகுப்பு மூலம் வரிசைமுறை செயல்முறை தலைகீழ் இழைகளுக்கு மீண்டும் நிகழ்கிறது. தரவு பகுப்பாய்வு ஒரே நேரத்தில் மில்லியன் கணக்கான கிளஸ்டர்களுக்கு வரிசைமுறை நிகழ்கிறது, மேலும் ஒவ்வொரு கிளஸ்டரும் டிஎன்ஏ செருகலின் ~ 1,000 ஒத்த நகல்களைக் கொண்டுள்ளது. கான்டிக்ஸ் என்று அழைக்கப்படும் ஒன்றுடன் ஒன்று இணைக்கப்பட்ட பகுதிகளைக் கொண்ட துண்டுகளைக் கண்டறிந்து அவற்றை வரிசைப்படுத்துவதன் மூலம் வரிசைத் தரவு பகுப்பாய்வு செய்யப்படுகிறது. ஒரு குறிப்பு வரிசை அறியப்பட்டால், மாறுபாடு அடையாளத்திற்காக இணைப்புகள் அதனுடன் ஒப்பிடப்படுகின்றன. துண்டாக்கப்படாத வரிசை ஒருபோதும் இயக்கப்படவில்லை என்றாலும் இந்த துண்டு செயல்முறை விஞ்ஞானிகளை முழுமையான வரிசையைக் காண அனுமதிக்கிறது; இருப்பினும், இல்லுமினா வாசிப்பு நீளங்கள் மிக நீளமாக இல்லாததால் (ஹைசெக் வரிசைமுறை 90 பிபி நீளமுள்ள வாசிப்பு நீளங்களை உருவாக்க முடியும்), இது குறுகிய டாண்டம் ரிபீட் பகுதிகளைத் தீர்ப்பதற்கான ஒரு போராட்டமாக இருக்கலாம். மேலும், வரிசை டி நோவோ மற்றும் ஒரு குறிப்பு இல்லை என்றால், மீண்டும் மீண்டும் பகுதிகள் வரிசை அசெம்பிளியில் நிறைய சிரமத்தை ஏற்படுத்தும். தவறான பாலிமரேஸ்கள், சிமெரிக் வரிசைகள் மற்றும் பி. சி. ஆர்-பியாஸ் ஆகியவற்றால் அடிப்படை மாற்றீடுகள் (குறிப்பாக 3 'ரீட்களின் முடிவில்) கூடுதல் சிரமங்களில் அடங்கும், இவை அனைத்தும் தவறான வரிசையை உருவாக்க பங்களிக்கக்கூடும். மற்ற வரிசைமுறை முறைகளுடன் ஒப்பீடு இந்த நுட்பம் சாங்கர் வரிசைமுறை போன்ற பாரம்பரிய வரிசைமுறை முறைகளை விட பல நன்மைகளை வழங்குகிறது. சாங்கர் வரிசைமுறைக்கு இரண்டு எதிர்வினைகள் தேவைப்படுகின்றன, ஒன்று முன்னோக்கி ப்ரைமருக்கும் மற்றொன்று தலைகீழ் ப்ரைமருக்கும். இலுமினாவைப் போலல்லாமல், சாங்கர் வரிசைமுறை டிஎன்ஏ துண்டின் வரிசையை தீர்மானிக்க ஒளிரும் டைடோக்ஸினியூக்ளியோசைடு ட்ரைபாஸ்பேட்டுகளை (டிடிஎன்டிபி) பயன்படுத்துகிறது. டிடிஎன்டிபிகள் 3 'ஓஎச் குழுவைக் காணவில்லை மற்றும் டிஎன்ஏ தொகுப்பை நிரந்தரமாக நிறுத்துகின்றன. ஒவ்வொரு எதிர்வினை குழாயிலும், டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் மற்றும் ப்ரைமர்களுடன் டிஎன்டிபிகள் மற்றும் டிடிஎன்டிபிகள் சேர்க்கப்படுகின்றன. டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ முழுமையாக ஒருங்கிணைக்கப்பட வேண்டும் என்பதால் டிடிஎன்டிபி-களுக்கும் டிஎன்டிபி-களுக்கும் உள்ள விகிதம் முக்கியமானது, மேலும் டிடிஎன்டிபி-களின் அதிகப்படியான அளவு டிஎன்ஏ டெம்ப்ளேட்டின் ஒரே அளவு மற்றும் நிலைப்பாட்டின் பல துண்டுகளை உருவாக்கும். டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் ஒரு டிடிஎன்டிபி சேர்க்கும்போது துண்டு நிறுத்தப்பட்டு ஒரு புதிய துண்டு ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது. ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு துண்டும் கடைசி நியூக்ளியோடைடை விட ஒரு நியூக்ளியோடைடு நீளமானது. டிஎன்ஏ வார்ப்புரு முழுமையாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்டவுடன், துண்டுகள் கேபில்லரி எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் பிரிக்கப்படுகின்றன. கேபில்லரி குழாயின் அடிப்பகுதியில் ஒரு லேசர் ஒளிரும் வகையில் பெயரிடப்பட்ட டி. டி. என். டி. பி. க்களைத் தூண்டுகிறது மற்றும் ஒரு கேமரா வெளிப்படும் நிறத்தைப் பிடிக்கிறது. இல்லுமினா சாய வரிசைமுறையின் தானியங்கி தன்மை காரணமாக, ஒரே நேரத்தில் பல இழைகளை வரிசைப்படுத்தவும், உண்மையான வரிசைமுறை தரவை விரைவாகப் பெறவும் முடியும். சாங்கர் வரிசைமுறையுடன், ஒரு நேரத்தில் ஒரு இழையை மட்டுமே வரிசைப்படுத்த முடியும் மற்றும் ஒப்பீட்டளவில் மெதுவாக உள்ளது. இல்லுமினா டிஎன்ஏ பாலிமரேஸை மட்டுமே பயன்படுத்துகிறது, மற்ற வரிசைமுறை நுட்பங்களுக்குத் தேவையான பல, விலையுயர்ந்த நொதிகளுக்கு மாறாக (அதாவது. பைரோசீக்வென்சிங்). குறிப்புகள் டிஎன்ஏ வரிசைமுறை முறைகள்