Ribosome profiling
ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பு அல்லது ரைபோ-செக் (ரைபோசோம் ஃபுட் பிரிண்டிங் என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) என்பது கிட்டத்தட்ட 50 ஆண்டுகளுக்கு முன்பு ஜோன் ஸ்டீட்ஸ் மற்றும் மர்லின் கோசக் ஆகியோரால் உருவாக்கப்பட்ட ஒரு நுட்பத்தின் தழுவலாகும், இது நிக்கோலஸ் இங்கோலியா மற்றும் ஜொனாதன் வைஸ்மேன் ஆகியோர் அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறையுடன் வேலை செய்யத் தழுவினர், இது எந்த எம்ஆர்என்ஏக்கள் தீவிரமாக மொழிபெயர்க்கப்படுகின்றன என்பதைத் தீர்மானிக்க சிறப்பு தூதர் ஆர்என்ஏ (எம்ஆர்என்ஏ) வரிசைமுறையைப் பயன்படுத்துகிறது. எந்த எம்ஆர்என்ஏக்கள் தீவிரமாக மொழிபெயர்க்கப்படுகின்றன என்பதைத் தீர்மானிக்கப் பயன்படுத்தக்கூடிய ஒரு தொடர்புடைய நுட்பம் டிரான்ஸ்லேட்டிங் ரைபோசோம் அஃபினிட்டி பியூரிஃபிகேஷன் (டிஆர்ஏபி) முறையாகும், இது ராக்ஃபெல்லர் பல்கலைக்கழகத்தில் நதானியேல் ஹெயின்ட்ஸ் (பால் கிரீன்கார்ட் மற்றும் மிரியம் ஹெய்மன் ஆகியோருடன் இணைந்து) உருவாக்கப்பட்டது. TRAP ரைபோசோம் கால்தடத்தை உள்ளடக்கியது அல்ல, ஆனால் செல் வகை-குறிப்பிட்ட தகவல்களை வழங்குகிறது. விளக்கம் இது ஒரு குறிப்பிட்ட தருணத்தில் ஒரு செல்லில் தீவிரமாக மொழிபெயர்க்கும் அனைத்து ரைபோசோம்களின் "உலகளாவிய ஸ்னாப்ஷாட்" ஐ உருவாக்குகிறது, இது ஒரு டிரான்ஸ்லேடோம் என்று அழைக்கப்படுகிறது. இதன் விளைவாக, மொழிபெயர்ப்பு தொடக்க தளங்களின் இருப்பிடம், ஒரு செல் அல்லது திசுவில் மொழிபெயர்க்கப்பட்ட ORF களின் நிரப்பு, ஒரு தூதர் RNA இல் ரைபோசோம்களின் விநியோகம் மற்றும் ரைபோசோம்களை மொழிபெயர்க்கும் வேகம் ஆகியவற்றை அடையாளம் காண ஆராய்ச்சியாளர்களுக்கு இது உதவுகிறது. ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பு ஆர்என்ஏ-செக் போலல்லாமல் மொழிபெயர்ப்பு மூலம் டிகோடிங் செயல்முறையின் போது ரைபோசோமால் பாதுகாக்கப்பட்ட எம்ஆர்என்ஏ வரிசைகளை மட்டுமே குறிவைக்கிறது, இது ஒரு மாதிரியில் உள்ள கொடுக்கப்பட்ட வரிசையின் எம்ஆர்என்ஏ அனைத்தையும் வரிசைப்படுத்துகிறது. இந்த நுட்பம் பாலிசோம் விவரக்குறிப்பிலிருந்து வேறுபட்டது. வரலாறு ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பு ஒரு ரைபோசோமுக்குள் உள்ள எம்ஆர்என்ஏ பாதுகாப்பற்ற எம்ஆர்என்ஏ பகுதிகளை சீரழிக்கும் நியூக்ளியேஸ்களைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் தனிமைப்படுத்தப்படலாம் என்ற கண்டுபிடிப்பை அடிப்படையாகக் கொண்டது. இந்த நுட்பம் எம்ஆர்என்ஏக்கள் புரதமாக மாற்றப்படும் பகுதிகளையும், உலகளாவிய மரபணு வெளிப்பாட்டைப் பற்றிய நுண்ணறிவை வழங்க ஒவ்வொரு பிராந்தியத்தின் மொழிபெயர்ப்பு நிலைகளையும் பகுப்பாய்வு செய்கிறது. அதன் வளர்ச்சிக்கு முன்பு, விவோவில் மொழிபெயர்ப்பை அளவிடுவதற்கான முயற்சிகளில் பாலிசோம்களிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஆர். என். ஏ பற்றிய மைக்ரோஅரே பகுப்பாய்வு, அத்துடன் எபிடோப் குறிக்கப்பட்ட ரைபோசோம்களின் இணைப்பு சுத்திகரிப்பு மூலம் மொழிபெயர்ப்பு விவரக்குறிப்பு ஆகியவை அடங்கும். இவை பயனுள்ள மற்றும் நிரப்பு முறைகள், ஆனால் ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பு மூலம் வழங்கப்பட்ட உணர்திறன் மற்றும் நிலை தகவலை அனுமதிக்காது. ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பின் மூன்று முக்கிய பயன்பாடுகள் உள்ளனஃ மொழிபெயர்க்கப்பட்ட எம்ஆர்என்ஏ பகுதிகளை அடையாளம் காண்பது, புதிய பெப்டைடுகள் எவ்வாறு மடிக்கப்படுகின்றன என்பதைக் கவனிப்பது மற்றும் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட குறிப்பிட்ட புரதங்களின் அளவை அளவிடுவது. மொழிபெயர்க்கப்பட்ட எம்ஆர்என்ஏ பகுதிகளை அடையாளம் காண்பது குறிப்பிட்ட மருந்துகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பு எம்ஆர்என்ஏவின் தொடக்க பகுதிகள், நீளமான பகுதிகள் மற்றும் மொழிபெயர்ப்பு நிறுத்தப்படும் பகுதிகளை அடையாளம் காண முடியும். தொடங்கும் பகுதிகளை ஹாரிங்டனின் அல்லது லாக்டிடோமைசின் சேர்ப்பதன் மூலம் மேலும் துவக்கப்படுவதைத் தடுக்கலாம். இது செல் லைசேட் முழுவதும் உள்ள எம்ஆர்என்ஏக்களின் தொடக்க கோடானை பகுப்பாய்வு செய்ய அனுமதிக்கிறது, இது மொழிபெயர்ப்பைத் தொடங்கும் ஏயூஜி அல்லாத வரிசைகளைத் தீர்மானிக்கப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. இடமாற்றத்தைத் தடுக்கும் சைக்ளோஹெக்ஸிமைடு போன்ற நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பிகளைச் சேர்ப்பதன் மூலம் மற்ற நீளமான பகுதிகளைக் கண்டறியலாம், ரைபோசோமுக்குள் பெப்டைடுகளின் பரிமாற்றத்தைத் தடுக்கும் குளோராம்ஃபெனிகோல் அல்லது வெப்ப உறைதல் போன்ற மருந்து அல்லாத வழிமுறைகள். இந்த நீளம் உறைதல் முறைகள் மொழிபெயர்ப்பின் இயக்கவியலை பகுப்பாய்வு செய்ய அனுமதிக்கின்றன. பல ரைபோசோம்கள் ஒற்றை எம்ஆர்என்ஏ மூலக்கூறை மொழிபெயர்ப்பு செயல்முறையை விரைவுபடுத்த மொழிபெயர்க்க முடியும் என்பதால், ரைபோசெக் எம்ஆர்என்ஏ-க்குள் உள்ள புரத குறியீட்டு பகுதிகளை நிரூபிக்கிறது மற்றும் எம்ஆர்என்ஏ வரிசைப்படுத்தப்படுவதைப் பொறுத்து இது எவ்வளவு விரைவாக செய்யப்படுகிறது என்பதை நிரூபிக்கிறது. இது குறிப்பிட்ட கோடன்களில் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமுக்குள் இடைநிறுத்த தளங்களைக் காட்ட ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பை அனுமதிக்கிறது. மெதுவான அல்லது இடைநிறுத்தப்பட்ட மொழிபெயர்ப்பின் இந்த தளங்கள் ரைபோசோம் அடர்த்தியின் அதிகரிப்பால் நிரூபிக்கப்படுகின்றன, மேலும் இந்த இடைநிறுத்தங்கள் குறிப்பிட்ட புரதங்களை உயிரணுக்குள் அவற்றின் பாத்திரங்களுடன் இணைக்க முடியும். சிஐபி உடன் பெப்டைட் மடிப்பு இணைப்பு ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பு புதிதாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட புரதங்கள் எவ்வாறு, எப்போது மடிக்கப்படுகின்றன என்பதை தெளிவுபடுத்தலாம். ரிபோ-செக் வழங்கிய கால்தடங்களைப் பயன்படுத்தி, சேப்பரோன்கள் போன்ற காரணிகளுடன் தொடர்புடைய குறிப்பிட்ட ரைபோசோம்களைச் சுத்திகரிக்க முடியும். குறிப்பிட்ட நேர புள்ளிகளில் ரைபோசோமை இடைநிறுத்துவது, காலப்போக்கில் ஒரு பாலிபெப்டைடை மொழிபெயர்க்க அனுமதிக்கிறது, மேலும் வெவ்வேறு புள்ளிகளை ஒரு சேப்பரோனுக்கு வெளிப்படுத்துகிறது மற்றும் சிஐபி பயன்படுத்தி வெளியேற்றுவது இந்த மாதிரிகளை சுத்தப்படுத்துகிறது மற்றும் எந்த நேரத்தில் பெப்டைட் மடிக்கப்படுகிறது என்பதைக் காட்ட முடியும். புரதத் தொகுப்பை அளவிடுதல் ரிபோ-செக் புரதத் தொகுப்புக்கான ஒரு பதிலாளியான மொழிபெயர்ப்பு செயல்திறனை மதிப்பிடுவதற்கும் பயன்படுத்தப்படலாம். இந்த பயன்பாட்டிற்காக, ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பு மற்றும் பொருந்தக்கூடிய ஆர்என்ஏ வரிசைமுறை தரவு உருவாக்கப்படுகின்றன. ஆரம்ப தரவு பகுப்பாய்வுகளை அர்ப்பணிக்கப்பட்ட கணக்கீட்டு கட்டமைப்புகள் மூலம் அடைய முடியும். மொழிபெயர்ப்பு செயல்திறனை அதன் ஆர்என்ஏ வெளிப்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்தும் போது ஒவ்வொரு மரபணுவின் ரைபோசோம் ஆக்கிரமிப்பாகக் கணக்கிடலாம். இந்த அணுகுமுறை ஆர்என்ஏவுடன் பிணைக்கும் புரதங்களின் திசைதிருப்பப்பட்ட இடையூறுடன் இணைக்கப்படலாம் மற்றும் மொழிபெயர்ப்பில் உள்ள வேறுபாட்டை அளவிட ரைபோசோம் விவரக்குறிப்பைப் பயன்படுத்தலாம். இந்த சீர்குலைந்த எம்ஆர்என்ஏக்கள் புரதங்களுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம், அவற்றின் பிணைப்பு தளங்கள் ஏற்கனவே ஆர்என்ஏவில் வரைபடமாக்கப்பட்டுள்ளன, இது ஒழுங்குமுறையைக் குறிக்கிறது. செயல்முறை செல்கள் அல்லது திசுக்களை லைஸ் செய்து ரைபோசோம்களுடன் பிணைக்கப்பட்ட எம்ஆர்என்ஏ மூலக்கூறுகளை தனிமைப்படுத்துகிறது. வளாகங்களை நிலைநிறுத்தவும். இது பொதுவாக சைக்ளோஹெக்ஸிமைடு மூலம் செய்யப்படுகிறது, ஆனால் பிற இரசாயனங்கள் பயன்படுத்தப்படலாம். மொழிபெயர்ப்பு-திறமையற்ற லைசிஸ் நிலைமைகளுடன் மொழிபெயர்ப்பு தடுப்பான்களை கைவிடுவதும் சாத்தியமாகும். ரைபோ நியூக்ளியேஸ்களைப் பயன்படுத்தி, ரைபோசோம்களால் பாதுகாக்கப்படாத ஆர்என்ஏவை ஜீரணிக்கவும். சுக்ரோஸ் சாய்வு அடர்த்தி மையவிலக்கு அல்லது சிறப்பு குரோமடோகிராஃபி நெடுவரிசைகளைப் பயன்படுத்தி எம்ஆர்என்ஏ-ரைபோசோம் வளாகங்களை தனிமைப்படுத்தவும். புரதங்களை அகற்ற கலவையின் ஃபீனால்/குளோரோஃபார்ம் சுத்திகரிப்பு. முன்பு பாதுகாக்கப்பட்ட எம்ஆர்என்ஏ துண்டுகளுக்கான அளவைத் தேர்ந்தெடுக்கவும். 3 'அடாப்டரை துண்டுகளாக இணைக்கவும். அறியப்பட்ட ஆர்ஆர்என்ஏ அசுத்தங்களைக் கழிக்கவும் (விருப்பப்படி). தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைப் பயன்படுத்தி ஆர்என்ஏவை சிடிஎன்ஏவாக மாற்றியமைக்கவும். ஸ்ட்ராண்ட்-குறிப்பிட்ட முறையில் பெருக்கவும். வரிசை வாசிக்கிறது. மொழிபெயர்ப்பு சுயவிவரத்தைத் தீர்மானிக்க வரிசை முடிவுகளை மரபணு வரிசைக்கு சீரமைக்கவும். ரைபோசோம் விவரக்குறிப்புக்காக குறிப்பாக வடிவமைக்கப்பட்ட கணக்கீட்டு அணுகுமுறைகளைப் பயன்படுத்தி இதன் விளைவாக வரும் தரவை பகுப்பாய்வு செய்யுங்கள். பொருள் ஆர்என்ஏ-ரைபோசோம் வளாகங்கள் சைக்ளோஹெக்ஸிமைடு நியூக்ளியேஸ்கள் ஃபீனால்/குளோரோஃபார்ம் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் டிஎன்டிபி வரிசைமுறை முறை-சிடிஎன்ஏ நூலகம். குறிப்புகள் வெளிப்புற இணைப்புகள் GWIPS-அதாவது உலாவி ரிபோகாலாக்ஸி RPF-DB டிரிப்ஸ்-VIZ உலாவி ரிபோஃப்ளோ, ரிபோர், ரிபோபை மரபியல் நுட்பங்கள் ரிபோசைம் மூலக்கூறு உயிரியல் நுட்பங்கள்