Ribose-seq
ரைபோஸ்-செக் என்பது மரபியல் ஆராய்ச்சியில் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு வரைபட நுட்பமாகும், இது மரபியல் டி. என். ஏவில் உட்பொதிக்கப்பட்ட ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளின், குறிப்பாக ரிபோநியூக்ளியோசைடு மோனோபாஸ்பேட்டுகளின் (ஆர். என். எம். பி) முழு சுயவிவரத்தையும் தீர்மானிக்க பயன்படுத்தப்படுகிறது. உட்பொதிக்கப்பட்ட ரிபோநியூக்ளியோடைடுகள் உயிரணுக்களில் டிஎன்ஏவில் மிகவும் பொதுவான மாற்றமாக கருதப்படுகின்றன, மேலும் மரபணு டிஎன்ஏவில் அவை இருப்பது மரபணு நிலைத்தன்மையை பாதிக்கும். எலியின் டிஎன்ஏவில் உள்ள ரிபோநியூக்ளியோடைடுகள் நோய் நோயியல் நோயை பாதிக்கலாம் என்று சமீபத்திய ஆய்வுகள் பரிந்துரைத்துள்ளன, மரபணு டிஎன்ஏவில் ரிபோநியூக்ளியோடைடு சேர்ப்பது மருத்துவ மரபியல் ஆராய்ச்சியின் முக்கிய இலக்காக மாறியுள்ளது. யூகாரியோடிக் அல்லது புரோக்கரியோடிக் டிஎன்ஏவில் இணைக்கப்பட்டுள்ள ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளின் துல்லியமான இருப்பிடம் மற்றும் வகையை விஞ்ஞானிகள் தீர்மானிக்க ரைபோஸ்-செக் அனுமதிக்கிறது. இந்த நுட்பம் ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளின் 2 'முனையில் காணப்படும் கூடுதல் ஹைட்ராக்சில் குழுக்களின் (OH) இருப்பைப் பயன்படுத்துகிறது, இது டி. என். ஏவை சிதைத்து சீர்குலைக்கும். இந்த நுட்பம் ஜார்ஜியா இன்ஸ்டிடியூட் ஆப் டெக்னாலஜியின் ஆராய்ச்சியாளர்கள் குழுவுடன் இணைந்து உருவாக்கப்பட்டது, இதில் பிரான்செஸ்கா ஸ்டோரிசி மற்றும் கியுங் துக் கோ (இப்போது கலிபோர்னியா சான் பிரான்சிஸ்கோ பல்கலைக்கழகத்தில்) மற்றும் கொலராடோ அன்சுட்ஸ் மருத்துவப் பள்ளியில் ஜே ஹெசெல்பெர்த் ஆகியோர் அடங்குவர். நியூக்ளிக் அமிலங்கள் அனைத்து உயிரினங்களிலும் மரபணு தகவல்களைக் கொண்டு செல்லும் அத்தியாவசிய மேக்ரோ மூலக்கூறுகள் ஆகும். இந்த பயோபாலிமர்கள் நியூக்ளியோடைடு மோனோமர்களைக் கொண்டுள்ளன, அவை பாஸ்பேட் குழு, நைட்ரஜன் கொண்ட காரம் மற்றும் ஐந்து கார்பன் சர்க்கரை (ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளில் ரைபோஸ் மற்றும் டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியோடைடுகளில் டியோக்ஸிரிபோஸ்) ஆகியவற்றைக் கொண்ட கரிம மூலக்கூறுகள் ஆகும். ரிபோநியூக்ளியோடைடுகள் பொதுவாக ரிபோநியூக்ளிக் அமிலத்தில் (ஆர்என்ஏ) அமைந்திருந்தாலும், அவை டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளிக் அமிலத்திலும் (டிஎன்ஏ) காணப்படுகின்றன. டிஎன்ஏவில் உட்பொதிக்கப்பட்ட ரிபோநியூக்ளியோசைடு மோனோபாஸ்பேட்டுகளின் (ஆர்என்எம்பி) முதல் கண்டுபிடிப்பு 1973 ஆம் ஆண்டில் லாரன்ஸ் கிராஸ்மேன், ராபர்ட் வாட்சன் மற்றும் ஜெரோம் வினோகிராட் ஆகியோரால் சுட்டி மற்றும் மனித உயிரணுக்களில் இருந்து மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏவில் இருந்தது. 2006 ஆம் ஆண்டில், ஸ்கிசோசாக்கரோமைசஸ் பாம்பே ("பிளவு ஈஸ்ட்") அணு டிஎன்ஏவில் ஆர்என்எம்பிகள் இருப்பது உறுதி செய்யப்பட்டது, மேலும் பிற இனங்களில் ஆய்வு தொடர்கிறது. டிஎன்ஏவில் ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளைச் சேர்ப்பது பல ஆய்வுகள் டிஎன்ஏவில் இருந்து ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளைச் சேர்க்கவோ, அகற்றவோ அல்லது உருவாக்கவோக்கூடிய வழிமுறைகளை அடையாளம் கண்டுள்ளன. முதன்மையாக, டிஎன்ஏ தொகுப்பு செயல்பாட்டின் போது டிஎன்ஏவில் ரிபோநியூக்ளியோடைடுகள் இணைக்கப்படுகின்றன. டிஎன்ஏ ரெப்ளிகேஷனைத் தொடங்க, குறுகிய ஆர்என்ஏ ப்ரைமர்கள் நிரப்பு டிஎன்ஏவில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டன, இது முதன்மை ரெப்ளிகேஷன் என்சைம்களான டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ்களின் அடுத்தடுத்த பிணைப்பு மற்றும் ரெப்ளிகேஷன் நடவடிக்கையை அனுமதிக்கிறது. பொதுவாக, இந்த ப்ரைமர்கள் பின்னர் நியூக்ளியேஸ் என்சைம்கள், ஆர்என்எஸ் எச் அல்லது ஃப்ளாப் ஸ்ட்ரக்சர்-ஸ்பெசிபிக் எண்டோநியூக்லீஸ் 1 (எஃப்இஎன் 1) மூலம் அகற்றப்படுகின்றன. எனவே, ஆர்என்ஏ ப்ரைமர்கள் வடிவில் டிஎன்ஏவில் இருக்கும் நிலையற்ற ஆர்என்எம்பிகளின் கணிசமான அளவு உள்ளது, பின்னர் அவை அகற்றப்படுகின்றன. டிஎன்ஏ ரெப்ளிகேஷன் தொடங்கப்பட்ட பிறகு, ஆர்என்எம்பிகளை டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ்கள் மூலம் டிஎன்ஏவில் முழுமையாக இணைக்க முடியும், மேலும் இது 1,000 டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியோடைடுகளுக்கு 1 ரிபோநியூக்ளியோடைடு இணைக்கப்பட்ட டிஎன்ஏவில் ரிபோநியூக்ளியோடைடு இணைப்பின் முக்கிய பொறிமுறையைக் குறிக்கிறது. உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பிகள் பெரும்பாலும் ரிபோநியூக்ளியோடைடு அரிப்பு பழுதுபார்ப்பு (ஆர்இஆர்) பொறிமுறையால் அகற்றப்படுவதை இலக்காகக் கொண்டுள்ளன. இருப்பினும், ஆர்இஆர் சரியாக வேலை செய்யவில்லை என்றால், இது டிஎன்ஏவில் உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பிகளின் தொடர்ச்சியான ஆதாரமாக மாறும். டிஎன்ஏவில் ஆர்என்எம்பிகள் எழக்கூடிய மற்றொரு வழிமுறை ஆக்ஸிஜனேற்ற அழுத்தத்தின் மூலம் ஆகும், இது டிஎன்ஏவில் உள்ள டியோக்ஸிரைபோஸ் அலகை ரைபோஸாக மாற்றுகிறது. ஆர்இஆர் பாதை டிஎன்ஏவிலிருந்து ஆர்என்எம்பிகளை அகற்றுவதற்கான மிகவும் திறமையான செயல்முறையாக இருந்தாலும், டிஎன்ஏ பிரதிபலிப்பின் போது டிஎன்ஏ பாலிமரேஸின் சரிபார்ப்பு நடவடிக்கைகளால் திட்டமிடப்பட்ட 3 '-5' எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ் செயல்பாட்டின் மூலமும் ரிபோ நியூக்ளியோடைடுகளை அகற்ற முடியும். ஐசோமரேஸ் நொதி, டோபோஐசோமரேஸ் I ஆல் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படும் கீறல்கள் கூடுதல் ஆர்என்எம்பி அகற்றும் முறைகளில் அடங்கும். டிஎன்ஏவில் உள்ள ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளின் விளைவுகள் அகற்றப்பட்டு மாற்றப்படாவிட்டால், டிஎன்ஏவில் உள்ள ரிபோநியூக்ளியோடைடுகள் செல்லுலார் செயல்முறைகளில் கட்டமைப்பு, வேதியியல் மற்றும் செயல்பாட்டு தாக்கங்களை ஏற்படுத்தும். முதலில் டி. என். ஆல் அங்கீகரிக்கப்பட்டது. 1993 ஆம் ஆண்டில் ஜசிஹ்ரீ மற்றும் பலர், ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளின் இருப்பு டி. என். ஏவின் சுழல் வடிவத்தை பி வடிவத்திலிருந்து ஏ வடிவத்திற்கு மாற்றும். இது, பல இரசாயன விளைவுகளுக்கு கூடுதலாக, டிஎன்ஏவுடன் புரதங்களின் பிணைப்பை பாதிக்கலாம் மற்றும் குரோமாட்டின் இயக்கவியல், டிஎன்ஏ பிரதி, டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், பழுதுபார்ப்பு மற்றும் ஒடுக்கற்பிரிவு போன்ற செயல்முறைகளுக்கு தாக்கங்களை ஏற்படுத்தும். கூடுதலாக, சில டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ்கள் டிஎன்ஏ ரெப்ளிகேஷனின் போது உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பிகளைத் தவிர்க்க முடியாது, இது ஆர்என்எம்பிகளின் நீண்ட இழைகளைக் கொண்ட தளங்களில் மேலும் அதிகரிக்கிறது. இது பிரதி அழுத்தத்தை ஏற்படுத்தலாம், இது டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், குரோமோசோம் பிரிப்பு மற்றும் எதிர்கால பிரதிபலிப்பில் தலையிடக்கூடும். மேலும், ஆர்இஆர் செயல்பாட்டில் சில துணை தயாரிப்புகள் அல்லது தோல்விகள் டிஎன்ஏ முறிவுகள், மறுசீரமைப்புகள் மற்றும் மரபணு உறுதியற்ற தன்மைக்கு வழிவகுக்கும். 2015 வாக்கில், ஆர்என்எம்பிகளை டிஎன்ஏவில் இணைப்பதற்கான சில வழிமுறைகள், அதன் விளைவுகள் மற்றும் தோராயமான விகிதங்கள் பெருகிய முறையில் தெளிவாகத் தெரிந்தன. இருப்பினும், மரபணு முழுவதும் ஆர்என்எம்பிகளின் இருப்பிடத்தை அடையாளம் காண்பதற்கான ஒரு நுட்பம் இன்னும் இல்லை. அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறை தொழில்நுட்பங்களின் வளர்ந்து வரும் அணுகல் பெரும்பாலும் மரபணு டிஎன்ஏ முழுவதும் ஆர்என்எம்பிகளை மிகவும் துல்லியமாக அடையாளம் காணும் இலக்கை நோக்கிய முன்னேற்றத்தை எளிதாக்கியது. 2015 ஆம் ஆண்டில், கியுங் துக் கோ, சத்யா பாலசந்தர், ஜே ஆர் ஹெஸல்பெர்த் மற்றும் பிரான்செஸ்கா ஸ்டோரிசி ஆகியோர் டி. என். ஏவில் ஆர். என். எம். பி. களின் முறையான விவரக்குறிப்புக்கான புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட நுட்பமான ரைபோஸ்-செக்கை வழங்கினர். மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் நியூக்ளியர் டிஎன்ஏ முழுவதும் ஆர்என்எம்பிகளின் மரபணு அளவிலான அடையாளம், அதிர்வெண் மற்றும் உள்ளூர்மயமாக்கல் ஆகியவற்றை ஆவணப்படுத்த அவர்கள் சாக்கரோமைசஸ் செரிவிசியா மரபணுவில் ரைபோஸ்-செக்கைப் பயன்படுத்தினர். இந்த கண்டுபிடிப்புகள் இறுதியில் மரபணு முழுவதும் ஆர். என். எம். பி இணைப்புகளின் வடிவங்களைப் பற்றிய புதிய நுண்ணறிவை வழங்கின. ரைபோஸ்-செக்கு இணையாக, டிஎன்ஏவில் உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பிகளின் தளங்களைப் பிடிக்க மூன்று பிற நுட்பங்கள் உருவாக்கப்பட்டனஃ எம்ரிபோ-செக்கு, ஹைடென்-செக்கு மற்றும் பு-செக்கு. ரைபோஸ்-செக் செயல்முறை உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறைக்கான தயாரிப்பில் ரைபோ நியூக்ளியோடைடுகளைப் பிடிக்கவும் குறிக்கவும் பல தனித்துவமான அம்சங்களைப் பயன்படுத்துகிறது. ஆர்என்எம்பி தளங்களை நேரடியாக குறிவைக்க, ஆசிரியர்கள் ஒரு கார சிகிச்சை செயல்முறையைப் பயன்படுத்தினர், இது ஆர்என்எம்பி தளங்களில் டிஎன்ஏவை சிதைத்து பிளவுபடுத்துகிறது. இந்த இடங்களில் பிளவுக்கான குறிப்பிட்ட தன்மை இந்த பிராந்தியத்தில் உள்ள மூலக்கூறின் ஒப்பீட்டு உணர்திறன் காரணமாக இயக்கப்படுகிறது, ஏனெனில் ரிபோநியூக்ளியோடைடுகளில் கூடுதல் ஹைட்ராக்சில் குழு உள்ளது. இந்த சிறிய துண்டுகளின் நிலைத்தன்மை மற்றும் செறிவூட்டல் மற்றும் பி. சி. ஆர் பெருக்கத்திற்கு முன்னதாக டி 5 எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ் செரிமானத்திலிருந்து பாதுகாப்பை அனுமதிக்க, ஒற்றை சிக்கித் தவிக்கும் டிஎன்ஏ துண்டுகள்-ஆர்வமுள்ள ஆர்என்எம்பி மற்றும் ஒரு தனித்துவமான மூலக்கூறு அடையாள எண்ணைக் கொண்டுள்ளன-ஒற்றை சிக்கித் தவிக்கும் டிஎன்ஏ (எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ) வட்டங்களை உருவாக்க சுயமாக இணைக்கப்பட்டுள்ளன. ஒரு ஆர்என்எம்பி மற்றும் டிஎன்ஏ முனையின் பிணைப்பை எளிதாக்குவதற்காக, கோ மற்றும் பலர். அராபிடோப்ஸிஸ் தலியானா டி. ஆர். என். ஏ லிகேஸின் (ஏ. டி. ஆர். என். எல்) தனித்துவமான பிணைப்பு நடவடிக்கையைப் பயன்படுத்தி 2 '-பாஸ்பேட்டை (ஆர்என்எம்பி பக்கம்) 5'-பாஸ்பேட்டுடன் (டிஎன்ஏ பக்கம்) பிணைக்க அனுமதிக்கிறது. இறுதியாக, இந்த நுட்பத்திலிருந்து உருவாக்கப்பட்ட முழு நூலகத்தின் உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை கைப்பற்றப்பட்ட அனைத்து உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பிகளின் மரபணு ஆயத்தங்களை அடையாளம் காட்டுகிறது. 2019 ஆம் ஆண்டில், ஸ்டோரிஸி ஆய்வகம் ரைபோஸ்-செக்கிற்கான புதுப்பிக்கப்பட்ட மற்றும் மேலும் உகந்த நெறிமுறையை வழங்கியது. குறுகிய மூலக்கூறு பார்கோடு அடாப்டர்கள், சிறிய துண்டுகள், மாற்றப்பட்ட பி. சி. ஆர் அமைப்புகள் மற்றும் ஜெல்லில் இருந்து வெட்டுவதற்கும் சுத்திகரிப்பதற்கும் சரிசெய்யப்பட்ட அளவு வரம்புகளைப் பயன்படுத்துவது ஆகியவை இந்த மாற்றங்களில் அடங்கும். ஒட்டுமொத்தமாக, மேம்படுத்தப்பட்ட நெறிமுறை பெரிய மரபணுக்களுக்கான பயன்பாடுகளுக்கான முறையின் செயல்திறனை கணிசமாக அதிகரிக்கக்கூடும் என்று பரிந்துரைக்கப்பட்டது. முறைகள் தயாரிப்பு மரபணு டிஎன்ஏ பிரித்தெடுத்தல் ஆர்வமுள்ள உயிரணுக்களில் இருந்து மரபணு டிஎன்ஏவைப் பிரித்தெடுக்க, உயிரணுக்கள் முதலில் இயந்திர அல்லது இரசாயன முறைகளைப் பயன்படுத்தி இணைக்கப்பட வேண்டும். இது ஒவ்வொரு உயிரணுவின் கருக்களிலிருந்தும் டிஎன்ஏவை வெளியிடுகிறது, இது சுத்திகரிக்கப்பட்டு அளவிட அனுமதிக்கிறது. ரைபோஸ்-செக் நெறிமுறைக்கு மொத்தம் 10uG டிஎன்ஏ தேவைப்படுகிறது. ரைபோஸ்-செக் அடாப்டர் தயாரித்தல் ரைபோஸ்-செக் அடாப்டர் ஒரு டிடி (டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியோடைட் தைமின்), அதைத் தொடர்ந்து ஒரு அனீலிங் வரிசை, இரண்டு ப்ரைமர் வரிசைமுறைகள் மற்றும் ஒரு தனித்துவமான மூலக்கூறு அடையாளங்காட்டி (யுஎம்ஐ) ஆகியவற்றால் ஆனது. ரைபோஸ்-செக் அடாப்டரைத் தயாரிக்க, மூன்று ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகள் (ஒலிகோஸ்) ஒரு கரைசலில் சேர்க்கப்பட்டு 95-100 °C க்கு சூடாக்கப்படுகின்றன. இந்த வெப்பநிலையில், ஒலிகோ வரிசைகள் ஒருவருக்கொருவர் அனீல் செய்து, ரைபோஸ்-செக் அடாப்டர்களின் சஸ்பென்ஷனை உருவாக்குகின்றன. உப்புநீக்கப்பட்ட இரட்டை இழைகள் கொண்ட ரைபோஸ்-செக் அடாப்டரின் அளவு பின்னர் அளவிடப்படுகிறது. ரைபோஸ்-செக்கு 10 யூஎம் செறிவு தேவைப்படுகிறது. ரைபோஸ்-செக் மரபணு டிஎன்ஏவின் துண்டு துண்டாக அப்பட்டமான-இறுதி கட்டுப்பாடு நொதி செரிமானத்தைப் பயன்படுத்தி துண்டிக்கப்படுகிறது. செரிமானத்தைத் தொடர்ந்து, துண்டு துண்டான டிஎன்ஏ சுத்திகரிக்கப்பட்டு அளவிடப்படுகிறது. ஆர்என்எம்பி பிடிப்பு விகிதத்தை அதிகரிக்க ஆர்என்எம்பி பிடிப்பு நுட்பங்களுக்கான (ஆர்இஎன்எம்பி பிடிப்பு நுட்பங்கள்) கட்டுப்பாடு நொதி தொகுப்பு மற்றும் கலவை உகப்பாக்கம் கருவிகள் உருவாக்கப்பட்டன. இதன் விளைவாக வரும் கரைசல் 500-முதல் 3,000-பிபி மரபணு துண்டுகளின் எண்ணிக்கையைக் கொண்டுள்ளது, இதன் சராசரி அளவு ~ 1.5 கேபி ஆகும். அடுத்தடுத்த டிஏ-டெய்லிங் மற்றும் அடாப்டர் பிணைப்புக்கு 10 கக் துண்டு துண்டான மரபணு டிஎன்ஏ தேவைப்படுகிறது. டிஏ-டெய்லிங் மற்றும் அடாப்டர் லைகேஷன் டிஏ மூலக்கூறுகள் ஒவ்வொரு துண்டின் வால்களுடனும் பிணைக்கப்பட்டுள்ளன, இது ரைபோஸ்-செக் அடாப்டரின் டிடி அடுத்த கட்டத்தில் அதனுடன் தொடர்புடைய டிஏ வாலை பிணைக்க அனுமதிக்கிறது. இந்த செயல்முறையைத் தொடர்ந்து, டிஏ-வால் டிஎன்ஏ சுத்திகரிக்கப்பட்டு தண்ணீரால் வெளியேற்றப்படுகிறது. ரைபோஸ்-செக் அடாப்டர், அதன் சீரற்ற 8-பேஸ் தனித்துவமான மூலக்கூறு அடையாளங்காட்டி (யுஎம்ஐ) மற்றும் ஒற்றை டிடி ஓவர்ஹாங் ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது, பின்னர் ஒரே இரவில் கரைசலை 15சி க்கு குளிர்விக்க இலக்கு துண்டின் டிஏ முனையில் இணைக்கப்படுகிறது. மாதிரி பின்னர் சுத்திகரிக்கப்பட்டு அல்கலி சிகிச்சைக்கு தயாரிக்கப்படுகிறது. அல்கலி சிகிச்சையின் போது, இரட்டை ஸ்ட்ராண்டட் டிஎன்ஏ (டிஎஸ்டிஎன்ஏ) சோடியம் ஹைட்ராக்சைடு மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்படுகிறது, இது ஒரு வலுவான காரம், டிஎஸ்டிஎன்ஏவை சிதைக்க மற்றும் உட்பொதிக்கப்பட்ட ரிபோநியூக்ளியோடைடு தளங்களில் டிஎன்ஏவை பிளவுபடுத்துகிறது. இது வெளிப்படும் இரண்டு முனைகளுடன் ஒற்றை-இழையுள்ள டிஎன்ஏ (எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ) துண்டுகளை உருவாக்குகிறதுஃ ஒன்று 2′, 3′-சுழற்சி பாஸ்பேட் முனை மற்றும் எதிர் 5′-ஹைட்ராக்சில் முனை. காரக் கரைசல் பின்னர் நடுநிலையாக்கப்பட்டு, எஸ். எஸ். டி. என். ஏ சுத்திகரிக்கப்படுகிறது. சுய பிணைப்பு (சுற்றறிக்கை) அடுத்து, எஸ். எஸ். டி. என். ஏ கொண்ட கரைசல் அராபிடோப்ஸிஸ் தலியானா டி. ஆர். என். ஏ லிகேஸ் (ஏ. டி. ஆர். என். எல் 24) உடன் அடைகாக்கப்படுகிறது. ஆர்என்ஏவின் 2′, 3′-சுழற்சி பாஸ்பேட் முனைகளை 2′-பாஸ்பேட்டாக மாற்றுவதன் மூலம் ஏ. தாலினானா ஆர்ஆர்என்ஏ முதிர்ச்சிக்கு ஏடிஆர்என்எல் உதவுகிறது மற்றும் ஆர்என்ஏ அல்லது டிஎன்ஏவின் 5′-பாஸ்பேட் முனைகளுடன் இணைக்கிறது. எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ கரைசலுக்கு ஏடிஆர்என்எல் அறிமுகப்படுத்துவது எஸ்எஸ்டிஎன்ஏவின் சுய பிணைப்பை ஊக்குவிக்கிறது, ஏனெனில் 2 ', 3' சுழற்சி பாஸ்பேட் முனைகள் அதே எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ இழையின் 5 'பாஸ்பேட் முனையில் இணைகின்றன. இதன் விளைவாக ஏற்படும் சுழற்சி எஸ். எஸ். டி. என். ஏ கட்டமைப்புகள் இலக்கு உட்பொதிக்கப்பட்ட ரிபோநியூக்ளியோடைடு வரிசை, ஒரு யு. எம். ஐ மற்றும் ஒலிகோ வரிசைகளைக் கொண்டுள்ளன, அவை வட்ட எஸ். எஸ். டி. என். ஏ கட்டமைப்பின் மீதமுள்ள பகுதிகளை உருவாக்குகின்றன. நேரியல் எஸ். எஸ். டி. என். ஏ அகற்றுதல் சுய பிணைப்பால் உருவாக்கப்பட்ட வட்ட எஸ். எஸ். டி. என். ஏ கட்டமைப்புகள் டி 5 எக்ஸோ நியூக்ளியேஸ் நொதியால் ஏற்படும் சீரழிவை எதிர்க்கின்றன. இருப்பினும், கட்டுப்பாடற்ற, நேரியல் எஸ். எஸ். டி. என். ஏ இல்லை. எனவே, தயாரிப்புகள் மற்றும் மீதமுள்ள டிஎன்ஏ துண்டுகளை டி 5 எக்ஸோ நியூக்ளியேஸுடன் சிகிச்சையளிப்பது தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட கட்டுப்பாடற்ற, நேரியல் எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ இழைகளை சீரழிக்கிறது, அதே நேரத்தில் சுய-கட்டுப்பட்ட எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ வட்டங்களை அப்படியே விட்டுவிடுகிறது. இந்த வழியில், தேவையற்ற நேரியல் எஸ். எஸ். டி. என். ஏ துண்டுகள் சீரழிந்து, வெற்றிகரமாக இணைக்கப்பட்ட எஸ். எஸ். டி. என். ஏ வட்டங்கள் மட்டுமே உள்ளன. பி. சி. ஆர் சாத்தியமாகும் முன், எஸ். எஸ். டி. என். ஏ வட்டங்களின் இணைக்கப்பட்ட சந்திப்புகளில் உள்ள 2 'பாஸ்பேட் குழுக்கள் அகற்றப்பட வேண்டும். இதை நிறைவேற்றுவதற்காக, வட்ட எஸ். எஸ். டி. என். ஏ கரைசல் 2 'பாஸ்போ டிரான்ஸ்ஃபெரேஸ், டி. பி. டி 1 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்படுகிறது, பிணைப்பு சந்திப்பில் மீதமுள்ள 2' பாஸ்பேட்டை நீக்குகிறது. பாலிமரேஸ் சங்கிலி எதிர்வினை (பி. சி. ஆர்) ரைபோஸ்-செக்கைத் தொடர்ந்து, பி. சி. ஆர் பெருக்கத்தைப் பயன்படுத்தி ஒவ்வொரு எஸ். எஸ். டி. என். ஏ வட்டத்திலும் பெருக்கம் செய்யப்படுகிறது. பி. சி. ஆரின் முதல் சுற்றில், வரிசைமுறை ப்ரைமர்கள் கரைசலுக்கு அறிமுகப்படுத்தப்படுகின்றன மற்றும் எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ வட்டங்கள் பெருக்கப்படுகின்றன. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட வரிசைமுறை ப்ரைமர்கள் விருப்பமான இலக்கு நூலகத்துடன் இணக்கமாக இருக்க வேண்டும். விவரங்களுக்கு விண்ணப்பங்கள் பிரிவைப் பார்க்கவும். பி. சி. ஆரின் இரண்டாவது சுற்றில், மேலும் குறிப்பிட்ட வரிசைமுறை ப்ரைமர்கள் அறிமுகப்படுத்தப்படுகின்றன, மேலும் எஸ்எஸ்டிஎன்ஏ வட்டங்கள் மேலும் பெருக்கப்படுகின்றன. ரைபோஸ்-செக் நூலகத்தின் இருப்பை உறுதிப்படுத்தவும், நேர்மறை மற்றும் எதிர்மறை கட்டுப்பாடுகளை சரிபார்க்கவும் பாலியாக்ரிலாமைடு ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் (PAGE) செய்யப்படுகிறது. வரிசைப்படுத்துவதற்கு முன்பு ரைபோஸ்-செக் நூலகத்தை சுத்திகரிக்க அளவு தேர்வு மற்றும் ஜெல் சுத்திகரிப்பு ஜெல் சுத்திகரிப்பு பயன்படுத்தப்படுகிறது. இந்த கட்டத்தில், ஆர்வத்தின் இலக்கு அளவு வரம்பிற்கு வெளியே வரும் துண்டுகளை அகற்ற துண்டுகள் நீளத்தால் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன. கீழ்நிலை பயன்பாடுகளுக்கு பயன்படுத்தவும் ஆர்வத்தின் வரிசைகள் கைப்பற்றப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்ட பிறகு, மாதிரிகள் வரிசைப்படுத்தப்பட்டு கீழ்நிலை பயன்பாடுகளுக்கு பயன்படுத்தப்படலாம். விவரங்களுக்கு விண்ணப்பங்கள் பிரிவைப் பார்க்கவும். பயன்பாடுகள் ரைபோஸ்-செக் பல சூழ்நிலைகளிலும், பல்வேறு யூகாரியோடிக் இனங்களின் பல உயிரணு வகைகளிலும் பயன்படுத்தப்படலாம் (பார்க்கஃ நன்மைகள் மற்றும் வரம்புகள்). ஆரம்ப குணாதிசயமான ரைபோஸ்-செக் முதன்முதலில் கோ மற்றும் பலர் பயன்படுத்தினர். (2015) ஆர். என். ஏ. எஸ்-எச்2 குறைபாடு (ஆர். என். எச்201) வளரும் ஈஸ்டின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் அணு டிஎன்ஏவில் ஆர். என். எம். பி. களின் இருப்பிடத்தை வகைப்படுத்த. அணு மரபணுவில் ஒரு கிலோபேஸ் (kb) க்கு 0.449 rNMP களிலும், மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணுவில் ஒரு kb க்கு 19.5 rNMP களிலும் rNMP கள் இருப்பதை அவர்கள் கண்டறிந்தனர். கூடுதலாக, கோ மற்றும் பலர். (2015) டி. என். ஏவில் ஆர். சி. க்கள் மற்றும் ஆர். ஜி. க்களை இணைப்பதற்கான ஒரு வெளிப்படையான சார்பை அடையாளம் காண முடிந்தது. ஈஸ்ட் செல்களில், ஆர். சி. க்கள் மற்றும் ஆர். ஜி. க்கள் அனைத்து தளங்களின் அந்தந்த எதிர்பார்க்கப்படும் அதிர்வெண்களுடன் ஒப்பிடுகையில், ஆர். ஏ. க்கள் மற்றும் ஆர். யூ. க்களை விட அதிக அதிர்வெண்களில் மரபணு டிஎன்ஏவில் தக்கவைக்கப்படுவதை அவர்கள் கண்டறிந்தனர். அடிப்படை வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், ஆர்என்எம்பிகள் பெரும்பாலும் அணு மற்றும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏ இரண்டிலும் ஒரு டிஏவின் உடனடியாக கீழ்நிலையில் இருந்த தளங்களில் இருந்தன. ஆர்என்எம்பி இணைப்புக்கான பல கூடுதல் "ஹாட்ஸ்பாட்களும்" குறிப்பிட்ட மரபணு அம்சங்களைப் பொறுத்து அடையாளம் காணப்பட்டன (எ. கா. குறிப்பிட்ட மரபணு தளங்கள், இழைகள் அல்லது குரோமோசோம் பகுதிகளில்). பல இனங்களின் ஒப்பீடுகள் ஆரம்ப குணாதிசயத்தின் அடிப்படையில் விரிவடைவது, பாலசந்தர் மற்றும் பலர். (2020) அவற்றின் ரைபோஸ்-செக் நெறிமுறையை உகந்ததாக்கியது மற்றும் மூன்று ஈஸ்ட் இனங்களின் பல விகாரங்களின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் நியூக்ளியர் டிஎன்ஏ முழுவதும் ஆர்என்எம்பிகளை வரைபடமாக்க ஒரு உயிர் தகவலியல் கருவியுடன் (ரைபோஸ்-மேப், https://github.com/agombolay/ribose-map இல் கிடைக்கிறது) இணைந்து பயன்படுத்தப்பட்டதுஃ சாக்கரோமைசஸ் செரிவிசியே, சாக்கரோமைசஸ் பாரடாக்ஸஸ் மற்றும் ஸ்கிசோசாக்கரோமைசஸ் பாம்பே. இந்த இனங்கள் மற்றும் விகாரங்கள் ஒவ்வொன்றிலிருந்தும் மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிஎன்ஏவில் (எம்டிடிஎன்ஏ), கொடுக்கப்பட்ட மரபணு நிலையில் இணைக்கப்பட்டுள்ள ஆர்என்எம்பி வகை உடனடி மேல்நோக்கிய நிலையில் (-1) அமைந்துள்ள டிஎன்எம்பியால் மிகவும் பாதிக்கப்படுகிறது என்பது நிரூபிக்கப்பட்டது. பல மரபணுக்களில் ரைபோஸ்-செக்கைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், பாலசந்தர் மற்றும் பலர். ஈஸ்ட் விகாரங்கள் மற்றும் இனங்களுக்கு இடையிலான பல்வேறு ஒற்றுமைகளையும் வேறுபாடுகளையும் தெளிவுபடுத்த முடிந்தது. அனைத்து இனங்களின் mtDNA இல் உள்ள rNMP வடிவங்கள் rU களின் குறைந்த அதிர்வெண்களைக் காட்டின; இருப்பினும், எஸ். பாரடாக்ஸஸ் மற்றும் எஸ். செரிவிசியே ஆகியவை rC க்கான விருப்பங்களைக் குறிக்கின்றன, அதே நேரத்தில் எஸ். பாம்பே rG க்கான விருப்பங்களைக் குறிக்கிறது. அணு டிஎன்ஏவில், மூன்று ஈஸ்ட் இனங்கள் பெரும்பாலும் ஒத்திருந்தன. கூடுதலாக, ஆர். என். எம். பி. க்கள் குறுகிய-நியூக்ளியோடைடு மீண்டும் மீண்டும் வரிசைமுறைகளில் கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்டன. ரைபோஸ்-செக்கின் இந்த பயன்பாடு ஆர்என்எம்பி ஒருங்கிணைப்பு வடிவங்களின் தன்மைப்படுத்தலுக்கும், வரிசைச் சூழலுக்குள் இந்த செயல்முறையின் சாத்தியமான இயக்கிகளை அடையாளம் காணவும் அனுமதித்தது. ஈஸ்ட் மரபணுவிற்கு அப்பால் ஒரு ஈஸ்ட் அல்லாத இனத்தில் நடத்தப்பட்ட முதல் ரிபோநியூக்ளியோடைடு மேப்பிங் ஆய்வில், ரைபோஸ்-செக் ரைபோஸ்-மேப்புடன் இணைந்து ஆர்என்எம்பிகளை அணு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் குளோரோபிளாஸ்ட் மரபணுக்கள் முழுவதும் வரைபடமாக்க பயன்படுத்தப்பட்டது. இந்த இனத்தின் மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் குளோரோபிளாஸ்ட் டிஎன்ஏவில், ஆர்ஏக்கள் மற்ற தளங்களை விட முன்னுரிமை அடிப்படையில் இணைக்கப்பட்டதாகத் தோன்றியது, அதே நேரத்தில் அணு டிஎன்ஏ ஆர்ஜி மற்றும் ஆர்சி இணைப்பில் சார்பு காட்டியது. அனைத்து சி. ரீன்ஹார்ட்டி ஆர்கனெல்ல்களிலும், rU தொடர்ந்து மிகக் குறைந்த பிரதிநிதித்துவம் கொண்ட rNMP ஆகும், இது ஈஸ்ட் மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் கண்டுபிடிப்புகளுடன் ஒத்துப்போகிறது. ஈஸ்ட் சுயவிவரங்களைப் போலவே, சி. ரீன்ஹார்ட்டியில் ஆர்என்எம்பிகளை இணைப்பது டிஎன்எம்பியால் உடனடியாக மேல்நோக்கி (நிலை-1) பாதிக்கப்படுகிறது. இந்த அமைப்பில், ரைபோஸ்-செக்கின் பயன்பாடு முதல் முறையாக இந்த இனத்தில் ஆர்என்எம்பி ஒருங்கிணைப்பு விநியோகங்கள் மற்றும் வடிவங்களை அடையாளம் காண அனுமதித்தது. ரைபோஸ்-செக்கின் நன்மைகள் மற்றும் வரம்புகள் ரைபோஸ்-செக் டிஎன்ஏவில் உட்பொதிக்கப்பட்ட ரைபோ நியூக்ளியோடைடுகளை குறிப்பாக குறிவைக்கிறது, மேலும் ஆர்என்ஏ ப்ரைமர்கள் அல்லது ஒகசாகி துண்டுகளைப் பிடிக்காது என்பதால், இது மிகவும் மாற்றக்கூடியது மற்றும் பல்வேறு வகையான மரபணு டிஎன்ஏவில் உட்பொதிக்கப்பட்ட ரைபோ நியூக்ளியோடைடுகளை திறம்பட குறிவைக்க முடியும். எனவே, தரப்படுத்தப்பட்ட நடைமுறைகள் தேவையில்லாமல், சிறிய மரபணு மூலக்கூறுகள் அல்லது பெரிய அணு மரபணுக்கள் உட்பட பல்வேறு வகையான மரபணுக்களில் ஆர்என்எம்பி வரைபடத்தை ரைபோஸ்-செக் அனுமதிக்கிறது. கூடுதலாக, ரைபோஸ்-செக்கின் தனித்துவம் ஆர்என்எம்பிகளை வரைபடமாக்க அனுமதிக்கிறது, இதில் டிஎன்ஏ சுற்றுச்சூழல் அழுத்தங்களுக்கு ஆளாகிறது, இது முறிவுகள் மற்றும்/அல்லது அபாஸிக் தளங்களை உருவாக்குவதன் மூலம் டிஎன்ஏவை சேதப்படுத்துகிறது. ரைபோஸ்-செக் உயர்-செயல்திறன் வரிசைப்படுத்தலுக்கான அடாப்டர்களில் உள்ள யுஎம்ஐயைப் பயன்படுத்துகிறது, இது வரிசைமுறை ரீட்களைக் கணக்கிட அனுமதிக்கிறது, இதனால் ஆர்என்எம்பி ஹாட்ஸ்பாட்களை மிகவும் துல்லியமாக கண்டறிய உதவுகிறது. ரைபோஸ்-செக் ஈஸ்ட் செல்களுக்கு குறிப்பிட்டதல்ல; இந்த நுட்பம் எந்த இனத்திலிருந்தும் எந்த உயிரணு வகையிலும் பயன்படுத்தப்படலாம், இது பெரும்பாலான உயிரினங்களில் ஆர். என். எம். பி. களின் இருப்பிடம் மற்றும் வடிவத்தை தெளிவுபடுத்துவதற்கான ஒரு பயனுள்ள கருவியாக அமைகிறது. ரைபோஸ்-செக் பொதுவான ஆய்வக உபகரணங்கள் மற்றும் வினைப்பொருள்களைப் பயன்படுத்துகிறது, அவை மிகவும் எளிதான மூலமாகும், இது பல மூலக்கூறு உயிரியல் ஆய்வகங்களில் பயன்படுத்த அணுகக்கூடிய நுட்பமாக அமைகிறது. ரைபோஸ்-செக்கின் வரம்புகள் இது ஒற்றை ஆர். என். எம். பி. க்களை இலக்காகக் கொண்டிருப்பதால், ரைபோஸ்-செக் நீண்ட ரைபோ நியூக்ளியோடைடு பாதைகளைப் பிடிக்க முடியாது. எனவே, ஆர்என்ஏ ப்ரைமர்கள் அல்லது ஒகசாகி துண்டுகளை வரைபடமாக்குவதற்கு ரைபோஸ்-செக் ஒரு பொருத்தமான நுட்பமாக இருக்காது, அவை டிஎன்ஏ பிரதி அல்லது முறிவுகளின் போது உருவாகலாம். ரைபோஸ்-செக் மரபணு டிஎன்ஏவிலிருந்து ஆர்என்எம்பி நூலகங்களைத் தயாரிக்க சுமார் 4 நாட்கள் ஆகும். நெறிமுறையும் ஒப்பீட்டளவில் சிக்கலானது, இதற்கு பல படிகள் தேவைப்படுகின்றன. நிரப்பு முறைகள் ரைபோஸ்-மேப் ரைபோஸ்-மேப் என்பது பெரிய, சிக்கலான ஆர்என்எம்பி மூல வரிசைமுறை தரவுத்தொகுப்புகளை செயலாக்குவதற்கும் பகுப்பாய்வு செய்வதற்கும் ஒரு உயிர் தகவலியல் கருவியாகும். ரைபோஸ்-மேப் ரைபோஸ்-செக், எம்ரிபோசெக், பு-செக், ஆல்க்-ஹைடென்-செக் மற்றும் ஆர். எச். ஐ. ஐ-ஹைடென்-செக் ஆகியவற்றுடன் இணக்கமானது. (பார்க்கஃ ஆர்என்எம்பி பிடிப்பதற்கான பிற நுட்பங்கள்). ரெஸ்காட் (ரெஸ்ட்ரிக்ஷன் என்சைம் செட் அண்ட் காம்பினேஷன் ஆப்டிமைசேஷன் டூல்ஸ்) ரெஸ்காட் என்பது ஒரு கணக்கீட்டு முறையாகும், இது ஆர்என்எம்பி-கைப்பற்றப்பட்ட பகுதிகளின் மரபணு பாதுகாப்பை ஒரு குறிப்பிட்ட கட்டுப்பாட்டு என்சைம்களுக்கு கணக்கிடுகிறது, பின்னர் ஆர்இ செட்டுகளை உகந்ததாக்கி, ஆர்என்எம்பி பிடிப்பு விகிதத்தை அதிகரிக்க அதிக பாதுகாப்பு கொண்ட ஆர்இ செட்டைத் தேர்ந்தெடுக்கிறது. ஆர்என்எம்பி எம்ரிபோசெக்கைப் பிடிப்பதற்கான பிற நுட்பங்கள்ஃ 5 'பக்கத்திலிருந்து உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பியின் மேல்நோக்கி டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியோடைடைப் பிடிக்க மனித ஆர்என்எஸ் எச்2 மற்றும் டி4 விரைவு தசைநார்களைப் பயன்படுத்துகிறது. RHII-ஹைடென்-செக்ஃ உட்பொதிக்கப்பட்ட rNMP ஐ அதன் 5 'பக்கத்திலிருந்து பிடிக்க எஸ்செரிச்சியா கோலி RNase HII மற்றும் T4 RNA லிகேஸைப் பயன்படுத்துகிறது. ஆர்எச்ஐஐ-ஹைட்இன்-செக் ஒரு ஆர்என்எம்பி மற்றும் ஒகசாகி துண்டுகளுடன் முடிவடையும் டிஎன்ஏ வரிசையையும் பிடிக்க முடியும். பு-செக்ஃ 3 'பக்கத்திலிருந்து உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பியின் கீழ்நிலை டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியோடைடைப் பிடிக்க கார நிலைமைகள் மற்றும் டி 4 ஆர்என்ஏ லிகேஸைப் பயன்படுத்துகிறது. ஒகாசாகி துண்டுகளைப் பிடிக்க முடியும். ஆல்க்-ஹைட்இன்-செக்ஃ 3 'பக்கத்திலிருந்து உட்பொதிக்கப்பட்ட ஆர்என்எம்பியின் கீழ்நிலை டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியோடைடைப் பிடிக்க கார நிலைமைகள் மற்றும் டி 4 ஆர்என்ஏ லிகேஸைப் பயன்படுத்துகிறது. ஒகாசாகி துண்டுகளையும் பிடிக்க முடியும். ஆர்எஸ்க்யூ-செக் (ரிபோநியூக்ளியோடைடு ஸ்கேனிங் அளவீட்டு வரிசைமுறை): ஆர்என்எம்பியின் மேல்நோக்கிய அண்டை நாடான டியோக்ஸிரிபோநியூக்ளியோடைடைப் பிடிக்க முழுமையான அளவீட்டைப் பயன்படுத்துகிறது. குறிப்புகள் ரிபோநியூக்ளியேஸ்கள் மரபணு வரைபடம்