Ribonucleoprotein Networks Analyzed by Mutational Profiling
ரிபோநியூக்ளியோபுரோட்டீன் நெட்வொர்க்குகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட பிறழ்வு விவரக்குறிப்பு (ஆர்என்பி-எம்ஏபி) என்பது ஆர்என்ஏ-புரத நெட்வொர்க்குகள் மற்றும் புரத பிணைப்பு தளங்களை நியூக்ளியோடைடு தெளிவுத்திறனில் ஆராய்வதற்கான ஒரு உத்தி ஆகும். ஆர்என்பி அசெம்பிளி மற்றும் செயல்பாடு பற்றிய தகவல்கள் உயிரியல் வழிமுறைகளைப் பற்றி நன்கு புரிந்துகொள்ள உதவும். ஆர்என்பி-எம்ஏபி ஆர்என்ஏ-பிணைக்கப்பட்ட புரதங்களை முடக்குவதற்கு ஒரு பன்முக-செயல்பாட்டு குறுக்கு இணைப்பான என்ஹெச்எஸ்-டயாஜிரின் (எஸ்டிஏ) ஐப் பயன்படுத்துகிறது. ஆர்என்ஏ-புரத குறுக்கு இணைப்புகள் உருவாக்கப்பட்டவுடன், எம்ஏபி தலைகீழ் படியெடுத்தல் பின்னர் புரதத்தால் பிணைக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏக்களை தலைகீழாக படியெடுத்தல் மற்றும் ஆர்என்ஏ-புரத குறுக்கு இணைப்புகளின் தளத்தில் பிறழ்வுகளை அறிமுகப்படுத்துகிறது. சிடிஎன்ஏக்களின் வரிசை முடிவுகள் புரத-ஆர்என்ஏ தொடர்பு நெட்வொர்க்குகள் மற்றும் புரத பிணைப்பு தளங்கள் ஆகிய இரண்டைப் பற்றிய தகவல்களையும் வெளிப்படுத்துகின்றன. மூலோபாய கூறுகள் ஆர்என்ஏ-எம்ஏபி மூன்று முக்கிய கூறுகளை உள்ளடக்கியதுஃ ரிபோநியூக்ளியோபுரோட்டின்கள் (ஆர்என்பி): ஆர்என்ஏக்கள் மற்றும் ஆர்என்ஏ-பிணைப்பு புரதங்களால் (ஆர்பிபி) ஆன வளாகங்கள் என்ஹெச்எஸ்-டயசிரின் (எஸ்டிஏ): ஒரு செல் ஊடுருவக்கூடிய குறுக்கு இணைக்கும் உலை. எஸ். டி. ஏ இரண்டு எதிர்வினை குழுக்களைக் கொண்டுள்ளது-ஒரு டயாஜிரின் மற்றும் ஒரு சுசினிமைடைல் எஸ்டர். சுசினிமைடைல் எஸ்டர்கள் மற்றும் அமீன் குழுக்களுக்கு இடையிலான எதிர்வினை (எ. கா. லைசின் பக்க சங்கிலிகள்) பெப்டைட் பிணைப்புகளை (அல்லது அமைடு பிணைப்புகள்) விளைவிக்கின்றன. 365 நானோமீட்டர் அலைநீளம் கொண்ட புற ஊதா ஒளிக்கு வெளிப்படும்போது, நியூக்ளியோடைடு ரைபோஸ்கள் மற்றும் தளங்களை நோக்கி ஒரு இடைநிலை பரந்த எதிர்வினை உருவாகிறது. இதன் விளைவாக, புரதங்கள் எஸ். டி. ஏ இணைப்பாளரால் ஆர்என்ஏவுடன் இணைக்கப்படுகின்றன. பிறழ்வு விவரக்குறிப்பு (எம்ஏபி): புரத-ஆர்என்ஏ பிணைப்பு தளங்களில் மாற்றியமைக்கப்பட்ட எச்சங்களை இணைக்க நிதானமான நம்பகத்தன்மையுடன் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டஸைப் பயன்படுத்தும் ஒரு முறை. லைசின் (அல்லது அர்ஜினைன்) எச்சங்கள் மற்றும் சுசினிமைடைல் எஸ்டர்களின் அமைன் குழுக்களுக்கு இடையில் அமைடு பிணைப்புகளை உருவாக்குவதன் மூலம் ஆர். என். ஏ உடன் புரத எச்சங்களை இணைக்க நீண்ட அலைநீளம் கொண்ட புற ஊதா மற்றும் எஸ். டி. ஏ வினையூக்கிகள் முதலில் உயிரணுக்களுக்கு வழங்கப்படுகின்றன. அடுத்து, குறுக்கு இணைக்கப்பட்ட ஆர்என்பிகளைக் கொண்ட செல்கள் லைஸ் செய்யப்படுகின்றன மற்றும் ஆர்என்ஏ-பிணைக்கப்பட்ட புரதங்கள் பெப்டைட் சேர்க்கைகளில் செரிக்கப்படுகின்றன. எம்ஏபி தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பின்னர் புரத-ஆர்என்ஏ பிணைப்பு தளங்களை பெப்டைட் அடக்ட்-தூண்டப்பட்ட பிறழ்வுகள் மூலம் பெயரிட செய்யப்படுகிறது. பிறழ்வு கொண்ட சிடிஎன்ஏ உற்பத்தியின் வரிசைமுறை பிறழ்வு தளங்களை (அல்லது ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளங்கள்) வெளிப்படுத்தும் மற்றும் ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளங்களுக்கு இடையிலான தொடர்புகள் 3-நியூக்ளியோடைடு சாளரங்களைப் பயன்படுத்தி கணக்கீட்டு ரீதியாக தீர்மானிக்கப்படுகின்றன. பகுப்பாய்வு ஆர்என்பி-எம்ஏபி தள அடையாளம் ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளங்கள் புரத பிணைக்கப்பட்ட நியூக்ளியோடைடுகளாக வரையறுக்கப்படுகின்றன. SDA மற்றும் UV சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் UV மட்டுமே சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரி வரிசை அளவீடுகள் சீரமைக்கப்பட்டுள்ளன மற்றும் பிறழ்வுகள் ஷேப்மேப்பர் 2 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்படுகின்றன. ஒரு நியூக்ளியோடைடுக்கான SDA அல்லது RNP-MaP வினைத்திறன் என்பது குறுக்கு இணைக்கப்பட்ட (SDA மற்றும் UV சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட) பிறழ்வு அதிர்வெண் மற்றும் குறுக்கு இணைக்கப்படாத (UV மட்டும்) பிறழ்வு அதிர்வெண் ஆகியவற்றின் விகிதமாகும். வேறுபட்ட பிறழ்வு கையொப்பங்களைப் பயன்படுத்தி, ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளங்கள் அறியப்பட்ட கட்டமைப்பின் ரிபோநியூக்ளியோபுரோட்டின்களின் பகுப்பாய்விலிருந்து பெறப்பட்ட ஒவ்வொரு ஆர்என்ஏ நியூக்ளியோடைடிலும் (யு, ஏ, சி மற்றும் ஜி) உலகளாவிய இயல்பாக்குதல் காரணிகள் மற்றும் வரம்புகளின் அடிப்படையில் அடையாளம் காணப்படுகின்றன. ஒரு நியூக்ளியோடைடு மூன்று வடிகட்டிகளை கடந்து சென்றால் அது ஒரு ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளமாக அடையாளம் காணப்படுகிறதுஃ எஸ்டிஏ + புற ஊதா-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரியில் பிறழ்வு நிகழ்வுகளின் எண்ணிக்கை புற ஊதா-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரியை விட குறைந்தது 50 அதிகமாக இருக்கும். தள வினைத்திறன்கள் நியூக்ளியோடைடு சார்ந்த வரம்புகளை () மீற வேண்டும், அவை அனுபவபூர்வமாக பின்வருமாறு வரையறுக்கப்படுகின்றனஃ அங்கு நியூக்ளியோடைடு U, A, C அல்லது G என்பது ஒரு> 10 Å குழுவில் உள்ள நியூக்ளியோடைடுகளின் 90 சதவீதம் வினைத்திறன் மதிப்புகளால் வரையறுக்கப்பட்ட பின்னணி வரம்பாகும், இது அனைத்து நியூக்ளியோடைடுகளுக்கான அனைத்து வினைத்திறன்களின் சராசரி அனைத்து நியூக்ளியோடைடுகளுக்கான வினைத்திறன்களின் நிலையான விலகல் கணக்கிடப்பட்ட Z-காரணி பூஜ்ஜியத்தை விட அதிகமாக உள்ளது கணக்கிடப்பட்ட Z-காரணி வரையறுக்கப்படுகிறது, அங்கு SDA மற்றும் UV உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட நியூக்ளியோடைடிட்டின் பிறழ்வு விகிதம் மற்றும் UV உடன் மட்டுமே சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட நியூக்ளியோடைடிட்டின் பிறழ்வு விகிதம், அங்கு சிகிச்சை (SDA + UV அல்லது UV மட்டும்) புரதம்-RNA தொடர்பு நெட்வொர்க் ஆர்என்பி-எம்ஏபி தொடர்புகள் ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளங்களிலிருந்து சுயாதீனமான ஆர்என்ஏவுடன் புரத பிணைப்பின் நிரப்பு அளவை வழங்குகின்றன. அவை ரிங்மேப்பர் எனப்படும் ஜி-சோதனை கட்டமைப்பைப் பயன்படுத்தி அடையாளம் காணப்படுகின்றன. ஆர்என்பி-எம்ஏபி தொடர்புகளுக்கு ஒரு ஒற்றை ஆர்என்ஏ மூலக்கூறு குறைந்தது இரண்டு குறுக்கு இணைப்புகளை உருவாக்க வேண்டும் மற்றும் மூன்று சூழ்நிலைகளில் ஏதேனும் ஒன்றிலிருந்து எழுகிறதுஃ ஒரு புரதமானது ஒரு ஆர்என்ஏவின் இரண்டு இடங்களுடன் பிணைக்கிறது இரண்டு புரதங்கள் ஒரு ஆர்என்ஏவில் இரண்டு இடங்களுடன் தொடர்பு கொண்டு பிணைக்கின்றன இரண்டு புரதங்கள் ஒரு ஆர்என்ஏவில் இரண்டு இடங்களில் ஒரு ஒருங்கிணைந்த அசெம்பிளி செயல்முறையால் டெபாசிட் செய்யப்படுகின்றன ஆர்என்பி-எம்ஏபி தொடர்புகளைப் பயன்படுத்தி, புரத-ஆர்என்ஏ தொடர்பு தளங்களின் நெட்வொர்க் கண்டறியப்பட்டு பின்னர் செயல்பாட்டு பகுப்பாய்விற்கு பயன்படுத்தப்படலாம். தொடர்புடைய முறைகள் குறுக்கு-இணைக்கும் நோயெதிர்ப்பு தேய்மானம் (சிஎல்ஐபி) சிஎல்ஐபி புற ஊதா குறுக்கு-இணைத்தல் மற்றும் நோயெதிர்ப்பு தேய்மானத்தை இணைப்பதன் மூலம் ஆர்என்ஏவுடன் புரத தொடர்புகளை பகுப்பாய்வு செய்கிறது. சிஎல்ஐபி அடிப்படையிலான நுட்பங்கள் ஆர்என்ஏ பிணைப்பு புரத பிணைப்பு தளங்களை மரபணு அளவிலான அளவில் வரைபடமாக்க முடியும். பல சி. எல். ஐ. பி-அடிப்படையிலான முறைகள் பின்வருமாறுஃ எச். ஐ. டி. எஸ்.-சி. எல். ஐ. பி. (கிராஸ்லிங்கிங் இம்யூனோப்ரீசிபிடேஷன் அல்லது சி. எல். ஐ. பி.-செக் மூலம் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஆர். என். ஏ-வின் உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை) பி. ஏ. ஆர்.-சி. எல். ஐ. பி. (ஃபோட்டோஆக்டிவேட்டபிள் ரிபோநியூக்ளியோசைடு-மேம்படுத்தப்பட்ட குறுக்கு-இணைப்பு மற்றும் இம்யூனோப்ரீசிபிடேஷன்) ஐ. சி. எல். ஐ. பி. (தனிப்பட்ட நியூக்ளியோடைடு-தெளிவுத்திறன் குறுக்கு-இணைப்பு மற்றும் இம்யூனோப்ரீசிபிடேஷன்) ஈ. சி. எல். ஐ. பி. (மேம்படுத்தப்பட்ட குறுக்கு-இணைப்பு மற்றும் இம்யூனோப்ரீசிபிடேஷன் அதைத் தொடர்ந்து உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை) எஸ். சி. எல். ஐ. பி. (எளிய குறுக்கு-இணைப்பு மற்றும் இம்யூனோப்ரீசிபிடேஷன்) மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி குவான்டிடேடிவ் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (எம். எஸ்) (எம். லேபிளிங் எம். எஸ் முறைகள் நிலையான ஐசோடோப் லேபிள்களின் வேறுபட்ட பயன்பாடு அல்லது மாதிரிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகளில் புரதங்களின் இரசாயன குறிச்சொல் ஆகியவற்றை உள்ளடக்கியது. பெயரிடப்பட்ட பெப்டைடுகளின் விகிதத்தின் மூலம் செறிவூட்டல் மதிப்பெண்கள் மற்றும் உண்மையான பிணைப்பு கூட்டாளர்களைப் பெற இது பயன்படுத்தப்படுகிறது. லேபிள் இல்லாத எம். எஸ் முறைகள் மாதிரிகள் மற்றும் கட்டுப்பாடுகளில் புரதங்களை அடையாளம் காண முடியும். குறிப்பிட்ட புரதங்களுக்கான உண்மையான பிணைப்பு கூட்டாளிகளை வேறுபடுத்துவதற்காக, அளவு அல்லாத எம். எஸ்ஸிலிருந்து நிறமாலை எண்ணிக்கை தரவுகளுடன் பயன்படுத்தப்படும் பகுப்பாய்வு கருவிகள் ஒரு உண்மையான ஆர். பி. பி-ஆர். என். ஏ தொடர்புக்கான நிகழ்தகவைப் பெற பயன்படுத்தப்படுகின்றன நன்மைகள் மற்றும் வரம்புகள் நன்மைகள் ஆர். என். பி-எம். ஏ. பி செயல்பாட்டு ரீதியாக முக்கியமான ஆர். என். ஏ-புரத பிணைப்பு நெட்வொர்க்குகளை பிணைக்கும் தள அடர்த்தி மற்றும் இடைவினை புரதங்களின் முந்தைய அறிவிலிருந்து சுயாதீனமான ஒன்றோடொன்று இணைப்பதன் மூலம் வெளிப்படுத்த உதவும். பகுப்பாய்வின் பக்கச்சார்பற்ற தன்மை காரணமாக, ஆர்என்பி-எம்ஏபி இனங்களுக்கிடையே பாதுகாக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏ-புரத தொடர்புகளைக் கண்டறிய முடிகிறது. ஆர்என்பி-எம்ஏபி பெரிய குறியீட்டு அல்லாத ஆர்என்ஏக்கள் அல்லது வைரஸ் ஆர்என்ஏக்களில் கூட செயல்பாட்டு ரீதியாக முக்கியமான கூறுகளின் குணாதிசயத்தை எளிதாக்க முடியும். வரம்புகள் ஒரு தனித்துவமான நுட்பமாக, ஆர்என்பி-எம்ஏபி புரத-ஆர்என்ஏ பிணைப்பு வழிமுறைகள் அல்லது புரத அடையாளங்களை தீர்மானிக்க பயன்படுத்த முடியாது. அவ்வாறு செய்ய, ஆர்என்பி-எம்ஏபி சிஎல்ஐபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி போன்ற பிற நுட்பங்களுடன் இணைந்து பயன்படுத்தப்பட வேண்டும். ஆர்என்பி-எம்ஏபி பகுப்பாய்விற்கு மிக உயர்ந்த வாசிப்பு-ஆழங்கள் தேவைப்படுகின்றன. ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளங்களை அடையாளம் காண, 1000x வரிசைமுறை பாதுகாப்பு தேவைப்படுகிறது, அதே நேரத்தில் ஆர்என்பி-எம்ஏபி தொடர்பு தளங்களுக்கு 10,000x வரிசைமுறை பாதுகாப்பு தேவைப்படுகிறது. தொலைதூர (> 500 நியூக்ளியோடைடுகள்) ஆர்என்பி-எம்ஏபி தளங்களுக்கு இடையிலான ஆர்என்பி-எம்ஏபி தொடர்புகளை வகைப்படுத்தும் திறனில் கடுமையான வரம்புகள் உள்ளன. இது எம்ஏபி தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்முறை (500-600 நியூக்ளியோடைடுகள்) மற்றும் வரிசைமுறை கருவி கிளஸ்டரிங் (<1,000 நியூக்ளியோடைடுகள்) ஆகியவற்றின் வரம்புகளால் ஏற்படுகிறது. குறிப்புகள் மரபியல் நுட்பங்கள் ஆர்என்ஏ