Paired-end tag
ஜோடி-முனை குறிச்சொற்கள் (PET) (சில நேரங்களில் "ஜோடி-முனை குறிச்சொற்கள்", அல்லது வெறுமனே "குறிச்சொற்கள்") என்பது ஒரு டிஎன்ஏ துண்டின் 5 'மற்றும் 3' முனைகளில் உள்ள குறுகிய வரிசைகளாகும், அவை (கோட்பாட்டளவில்) ஒரு மரபணுவில் ஒரு முறை மட்டுமே ஒன்றாக இருக்கும் அளவுக்கு தனித்துவமானவை, எனவே அவற்றுக்கிடையே உள்ள டிஎன்ஏவின் வரிசையை தேடலின் போது (முழு-மரபணு வரிசை தரவு இருந்தால்) அல்லது மேலும் வரிசைப்படுத்தலின் போது (குறிச்சொல் தளங்கள் முதன்மை அனீலிங் தளங்களாக செயல்பட போதுமான தனித்துவமானவை என்பதால்) கிடைக்கும். இடைப்பட்ட டிஎன்ஏ இல்லாத ஜோடி-இறுதி குறிச்சொற்கள் (பிஇடி) பிஇடி நூலகங்களில் உள்ளன, அதாவது, ஒரு பிஇடி ஒரு குறுகிய 5 'லிங்கர் வரிசை, ஒரு குறுகிய 5' வரிசை குறிச்சொல், ஒரு குறுகிய 3 'வரிசை குறிச்சொல் மற்றும் ஒரு குறுகிய 3' லிங்கர் வரிசை ஆகியவற்றைக் கொண்ட மரபணு அல்லது சிடிஎன்ஏவின் ஒரு பெரிய துண்டைக் குறிக்கிறது. குறிச்சொற்களை தனித்துவமாக வரைபடமாக்க 13 அடிப்படை ஜோடிகள் போதுமானது என்று கருத்தியல் ரீதியாக காட்டப்பட்டது. இருப்பினும், தனித்துவமான ரீட்களை மேப்பிங் செய்ய நீண்ட வரிசைகள் மிகவும் நடைமுறைக்குரியவை. PETகளை உற்பத்தி செய்யப் பயன்படுத்தப்படும் எண்டோநியூக்ளியேஸ்கள் (கீழே விவாதிக்கப்பட்டுள்ளன) நீண்ட குறிச்சொற்களைக் கொடுக்கின்றன (18/20 அடிப்படை ஜோடிகள் மற்றும் 25/27 அடிப்படை ஜோடிகள்) ஆனால் 50-100 அடிப்படை ஜோடிகளின் வரிசைகள் வரைபடம் மற்றும் செலவு செயல்திறன் ஆகிய இரண்டிற்கும் உகந்ததாக இருக்கும். பல டிஎன்ஏ துண்டுகளிலிருந்து பிஇடிகளை பிரித்தெடுத்த பிறகு, அவை திறமையான வரிசைப்படுத்தலுக்காக ஒன்றாக இணைக்கப்படுகின்றன (இணைக்கப்படுகின்றன). சராசரியாக, 20-30 குறிச்சொற்களை சாங்கர் முறையுடன் வரிசைப்படுத்தலாம், இது நீண்ட வாசிப்பு நீளத்தைக் கொண்டுள்ளது. குறிச்சொல் வரிசைகள் குறுகியதாக இருப்பதால், தனிப்பட்ட PET கள் அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறைக்கு மிகவும் பொருத்தமானவை, அவை குறுகிய வாசிப்பு நீளங்கள் மற்றும் அதிக செயல்திறன் கொண்டவை. PET வரிசைமுறையின் முக்கிய நன்மைகள் குறுகிய துண்டுகளை மட்டுமே வரிசைப்படுத்துவதன் மூலம் அதன் குறைக்கப்பட்ட செலவு, மரபணுவில் உள்ள கட்டமைப்பு மாறுபாடுகளைக் கண்டறிதல் மற்றும் ஒற்றை குறிச்சொற்களுடன் ஒப்பிடும்போது மரபணுவுடன் மீண்டும் சீரமைக்கும் போது அதிகரித்த குறிப்பிட்ட தன்மை, இது டிஎன்ஏ துண்டின் ஒரு முனையை மட்டுமே உள்ளடக்கியது. PET நூலகத்தை உருவாக்குவது PET நூலகங்கள் பொதுவாக இரண்டு பொதுவான முறைகளில் தயாரிக்கப்படுகின்றனஃ குளோனிங் அடிப்படையிலான மற்றும் குளோனிங் இல்லாத அடிப்படையிலானவை. குளோனிங் அடிப்படையிலான துண்டு துண்டான மரபணு டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்வமுள்ள நிரப்பு டிஎன்ஏ (சிடிஎன்ஏ) பிளாஸ்மிட் திசையன்களாக குளோன் செய்யப்படுகிறது. குளோனிங் தளங்கள் அடாப்டர் வரிசைகளுடன் பக்கவாட்டில் உள்ளன, அவை எண்டோநியூக்ளியேஸ்களுக்கான கட்டுப்பாட்டு தளங்களைக் கொண்டுள்ளன (கீழே விவாதிக்கப்பட்டுள்ளன). செருகல்கள் பிளாஸ்மிட் திசையன்களுடன் இணைக்கப்படுகின்றன, மேலும் தனிப்பட்ட திசையன்கள் பின்னர் ஈ. கோலியாக மாற்றப்பட்டு PET நூலகத்தை உருவாக்குகின்றன. பிளாஸ்மிட்டைச் சுத்திகரிப்பதன் மூலமும், திசையன்களின் முனைகளில் இரண்டு குறுகிய வரிசைகளை விட்டுச் செல்லும் குறிப்பிட்ட எண்டோநியூக்லீஸ் மூலம் ஜீரணிக்கப்படுவதன் மூலமும் PET வரிசைகள் பெறப்படுகின்றன. உட்புற மூலக்கூறு (நீர்த்த) நிலைமைகளின் கீழ், திசையன்கள் மறு வட்டமிடப்பட்டு இணைக்கப்படுகின்றன, திசையனில் டைட்டாக்குகளை மட்டுமே விட்டுச்செல்கின்றன. குளோனுக்கு தனித்துவமான வரிசைகள் இப்போது ஒன்றாக இணைக்கப்பட்டுள்ளன. அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறை நுட்பத்தைப் பொறுத்து, PET வரிசைகளை ஒற்றை, பரிமாணப்படுத்தப்பட்ட அல்லது நீண்ட சங்கிலிகளாக இணைக்கலாம். குளோனிங் இல்லாத அடிப்படையிலான குளோனிங்கிற்கு பதிலாக, எண்டோநியூக்ளீஸ் வரிசையைக் கொண்ட அடாப்டர்கள் துண்டு துண்டான மரபணு டிஎன்ஏ அல்லது சிடிஎன்ஏவின் முனைகளில் இணைக்கப்படுகின்றன. மூலக்கூறுகள் பின்னர் சுய வட்டமயமாக்கப்பட்டு, எண்டோநியூக்ளீஸ் மூலம் செரிக்கப்பட்டு, PET ஐ வெளியிடுகின்றன. வரிசைப்படுத்துவதற்கு முன்பு, இந்த PET கள் அடாப்டர்களுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ளன, அவற்றுடன் பி. சி. ஆர் ப்ரைமர்கள் பெருக்கத்திற்கு அனீல் செய்கின்றன. நூலகத்தின் குளோனிங் அடிப்படையிலான கட்டுமானத்தின் நன்மை என்னவென்றால், இது எதிர்கால பயன்பாட்டிற்காக துண்டுகள் அல்லது சிடிஎன்ஏவை அப்படியே பராமரிக்கிறது. இருப்பினும், கட்டுமான செயல்முறை குளோனிங் இல்லாத முறையை விட மிக நீண்டது. நூலக கட்டுமானத்தில் உள்ள மாறுபாடுகள் அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறை நிறுவனங்களால் அந்தந்த தொழில்நுட்பங்களுக்கு ஏற்ப தயாரிக்கப்பட்டுள்ளன. எண்டோநியூக்ளியேஸ்கள் மற்ற எண்டோநியூக்ளியேஸ்களைப் போலல்லாமல், எம்எம்இஐ (வகை ஐஐஎஸ்) மற்றும் ஈக்கோபி15ஐ (வகை III) கட்டுப்பாடு எண்டோநியூக்ளியேஸ்கள் அவற்றின் இலக்கு பிணைப்பு தளங்களின் கீழ்நோக்கி வெட்டுகின்றன. எம்எம்இஐ 18/20 அடிப்படை ஜோடிகளை கீழ்நோக்கி வெட்டுகிறது மற்றும் ஈகோபி15ஐ 25/27 அடிப்படை ஜோடிகளை கீழ்நோக்கி வெட்டுகிறது. இந்த கட்டுப்பாட்டு என்சைம்கள் அடாப்டர்களில் அமைந்துள்ள அவற்றின் இலக்கு வரிசைகளில் பிணைக்கப்படுவதால், அவை துண்டுகளின் குறுகிய வரிசைகளைக் கொண்ட திசையன்களை வெட்டி வெளியிடுகின்றன அல்லது அவற்றுடன் இணைக்கப்பட்ட சிடிஎன்ஏ, பிஇடிகளை உருவாக்குகிறது. PET பயன்பாடுகள் DNA-PET: PET குறிச்சொற்களுக்கு இடையிலான இணைப்பைக் குறிக்கும் என்பதால், மரபணு மறு வரிசைமுறையில் PET இன் பயன்பாடு ஒற்றை ரீட்களின் பயன்பாட்டை விட நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது. இந்த பயன்பாடு ஜோடி வாரியான இறுதி வரிசைமுறை என்று அழைக்கப்படுகிறது, இது பேச்சுவழக்கில் இரட்டை பீப்பாய் ஷாட்கன் வரிசைமுறை என்று அழைக்கப்படுகிறது. இந்த ஜோடியின் ஒரு பாதியை மரபணுவில் உள்ள ஒரு இடத்திற்கு தனித்துவமாக நங்கூரமிடுவது தெளிவற்ற மற்ற பாதியை வரைபடமாக்க அனுமதிக்கிறது. தெளிவற்ற வாசிப்புகள் என்பது ஒன்றுக்கு மேற்பட்ட இடங்களுக்கு வரைபடமாக்கப்பட்டவை. இந்த அதிகரித்த செயல்திறன் வரிசைமுறையின் செலவைக் குறைக்கிறது, ஏனெனில் இந்த தெளிவற்ற வரிசைகள் அல்லது ரீட்கள் பொதுவாக நிராகரிக்கப்படும். PET வரிசைகளின் இணைப்பு கட்டமைப்பு மாறுபாடுகளைக் கண்டறியவும் அனுமதிக்கிறதுஃ செருகுதல், நீக்குதல், நகல்கள், தலைகீழ்கள், இடமாற்றங்கள். PET நூலகத்தின் கட்டுமானத்தின் போது, துண்டுகள் அனைத்தும் ஒரு குறிப்பிட்ட அளவில் தேர்ந்தெடுக்கப்படலாம். வரைபடத்திற்குப் பிறகு, PET வரிசைகள் ஒருவருக்கொருவர் ஒரு குறிப்பிட்ட தூரத்தில் தொடர்ந்து இருக்கும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது. இந்த தூரத்திலிருந்து ஒரு முரண்பாடு PET வரிசைகளுக்கு இடையிலான கட்டமைப்பு மாறுபாட்டைக் குறிக்கிறது. எடுத்துக்காட்டாக (வலதுபுறத்தில் உள்ள படம்): வரிசைப்படுத்தப்பட்ட மரபணுவில் ஒரு நீக்குதல், குறிப்பு மரபணுவில் எதிர்பார்க்கப்பட்டதை விட அந்த வரைபடத்தை மேலும் தொலைவில் படித்திருக்கும், ஏனெனில் குறிப்பு மரபணு வரிசைப்படுத்தப்பட்ட மரபணுவில் இல்லாத டிஎன்ஏவின் ஒரு பகுதியை கொண்டிருக்கும். சிஐபி-பிஇடிஃ குரோமாட்டின் இம்யூனோப்ரீசிபிடேஷன் (சிஐபி) மற்றும் பிஇடி ஆகியவற்றின் ஒருங்கிணைந்த பயன்பாடு டிஎன்ஏவின் பகுதிகளை ஆர்வமுள்ள புரதத்தால் பிணைக்க பயன்படுத்தப்படுகிறது. உருவாக்கப்பட்ட ரீட்களின் தெளிவின்மையைக் குறைப்பதன் மூலம் ஒற்றை ரீட் வரிசைமுறையை விட சிப்-பிஇடி நன்மை பயக்கும். சிப் ஹைப்ரிடைசேஷனை (சிஐபி-சிப்) விட நன்மை என்னவென்றால், ஹைப்ரிடைசேஷன் டைலிங் வரிசைகள் வரிசை வாசிப்புகள் கொண்டிருக்கும் புள்ளிவிவர உணர்திறனைக் கொண்டிருக்கவில்லை. இருப்பினும், சிப்-பிஇடி, சிப்-செக் மற்றும் சிப்-சிப் அனைத்தும் மிகவும் வெற்றிகரமாக உள்ளன. சியா-பிஇடிஃ குரோமாட்டின் தொடர்பு பகுப்பாய்வில் பிஇடி வரிசைமுறையின் பயன்பாடு. புரதக் காரணிகளால் பிணைக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ கூறுகளுக்கு இடையிலான புதிய நீண்ட தூர தொடர்புகளைக் கண்டறிவதற்கான மரபணு அளவிலான உத்தி இது. ஈஸ்ட்ரோஜன்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மனித மார்பக அடினோகார்சினோமா உயிரணுக்களில் ஈஸ்ட்ரோஜன் ஏற்பி α (ER-α) ஆல் பிணைக்கப்பட்ட குரோமாடினுக்கு இடையிலான தொடர்புகளின் வரைபடத்தை உருவாக்க ஃபுல்வுட் மற்றும் பலர் (2009) முதல் சியா-பிஇடி உருவாக்கப்பட்டது. சியா-பிஇடி என்பது தொடர்புகள் மற்றும் உயர்-வரிசை குரோமாட்டின் கட்டமைப்புகளை பகுப்பாய்வு செய்வதற்கான ஒரு பக்கச்சார்பற்ற வழியாகும், ஏனெனில் இது அறியப்படாத டிஎன்ஏ கூறுகளுக்கு இடையிலான தொடர்புகளைக் கண்டறிய முடியும். இதற்கு மாறாக, மரபணுவில் ஒரு குறிப்பிட்ட இலக்கு பகுதி சம்பந்தப்பட்ட தொடர்புகளைக் கண்டறிய 3சி மற்றும் 4சி முறைகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. சியா-பிஇடி என்பது ஆர்என்ஏ-பிஇடி மூலம் இணைவு மரபணுக்களைக் கண்டுபிடிப்பது போன்றது, இதில் இணைக்கப்பட்ட குறிச்சொற்கள் மரபணுவில் உள்ள வெவ்வேறு பகுதிகளுக்கு வரைபடமாக்கப்படுகின்றன. இருப்பினும், சிஐஏ-பிஇடி என்பது ஆர்என்ஏ-பிஇடி போன்ற இரண்டு மரபணு பகுதிகளுக்கு இடையில் இயற்கையாக நிகழும் இணைப்பை விட, வெவ்வேறு மரபணு பகுதிகளில் அமைந்துள்ள வெவ்வேறு டிஎன்ஏ துண்டுகளுக்கு இடையிலான செயற்கை பிணைப்புகளை உள்ளடக்கியது. ஆர்என்ஏ-பிஇடிஃ இந்த பயன்பாடு டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் படிப்பதற்கு பயன்படுத்தப்படுகிறதுஃ டிரான்ஸ்கிரிப்ட்கள், மரபணு கட்டமைப்புகள் மற்றும் மரபணு வெளிப்பாடுகள். PET நூலகம் முழு நீள cDNA களைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்படுகிறது, எனவே டிடேக்குகள் தனிப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் 5 'மூடப்பட்ட மற்றும் 3' பாலிஏ வால் கையொப்பங்களைக் குறிக்கின்றன. எனவே, ஆர்என்ஏ-பிஇடி டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அலகுகளின் எல்லைகளை வரையறுக்க குறிப்பாக பயனுள்ளதாக இருக்கும். இது மாற்று டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தொடக்க தளங்கள் மற்றும் மரபணுக்களின் பாலியாடெனைலேஷன் தளங்களை அடையாளம் காண உதவும். ஆர்என்ஏ-பிஇடி இணைவு மரபணுக்கள் மற்றும் டிரான்ஸ்-ஸ்ப்லைசிங் ஆகியவற்றைக் கண்டறியவும் பயன்படுத்தப்படலாம், ஆனால் அவற்றுக்கிடையேயான வேறுபாட்டைக் கண்டறிய மேலும் பரிசோதனை தேவைப்படுகிறது. டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் எல்லைகளைக் கண்டுபிடிப்பதற்கான பிற முறைகளில் ஒற்றை-குறிச்சொல் உத்திகள் CAGE, SAGE மற்றும் மிக சமீபத்திய சூப்பர்சேஜ் ஆகியவை அடங்கும், CAGE மற்றும் 5 'SAGE டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தொடக்க தளங்களை வரையறுக்கிறது மற்றும் 3' SAGE பாலியாடெனைலேஷன் தளங்களை வரையறுக்கிறது. இந்த முறைகளை விட PET வரிசைமுறையின் நன்மைகள் என்னவென்றால், PET டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் இரு முனைகளையும் அடையாளம் காட்டுகிறது, அதே நேரத்தில், மரபணுவிற்கு மீண்டும் மேப்பிங் செய்யும் போது மேலும் குறிப்பிட்ட தன்மையை வழங்குகிறது. சி. டி. என். ஏ. க்களை வரிசைப்படுத்துவது டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் கட்டமைப்புகளை பெரிய விவரங்களில் வெளிப்படுத்தலாம், ஆனால் இந்த அணுகுமுறை ஆர்என்ஏ-பிஇடி வரிசைமுறையை விட மிகவும் விலை உயர்ந்தது, குறிப்பாக முழு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமை வகைப்படுத்துவதற்கு. ஆர்என்ஏ-பிஇடியின் முக்கிய வரம்பு டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் உள் எக்ஸான்களின் அமைப்பு தொடர்பான தகவல்கள் இல்லாதது. எனவே, ஆர்என்ஏ-பிஇடி மாற்று பிளவுகளைக் கண்டறிய ஏற்றது அல்ல. கூடுதலாக, குளோனிங் செயல்முறை பயன்படுத்தப்பட்டால், PET களை உருவாக்குவதற்கு முன்பு cDNA நூலகத்தை உருவாக்குங்கள், குளோன் செய்ய கடினமாக இருக்கும் cDNA கள் (நீண்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ட்களின் விளைவாக) குறைந்த அளவைக் கொண்டிருக்கும். இதேபோல், குறைந்த வெளிப்பாடு நிலைகளைக் கொண்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ட்கள் (அல்லது டிரான்ஸ்கிரிப்ட் ஐசோஃபார்ம்கள்) குறைவாக பிரதிநிதித்துவப்படுத்தப்படலாம். மூலக்கூறு உயிரியல் ஆய்வக நுட்பங்கள் மூலக்கூறு உயிரியல் நுட்பங்கள் டிஎன்ஏ வரிசைமுறை