Polony sequencing
பொலோனி வரிசைமுறை என்பது ஒரு மலிவான ஆனால் மிகவும் துல்லியமான மல்டிபிளெக்ஸ் வரிசைமுறை நுட்பமாகும், இது மில்லியன் கணக்கான அசையாத டிஎன்ஏ வரிசைகளை இணையாக "படிக்க" பயன்படுத்தப்படலாம். இந்த நுட்பம் முதன்முதலில் ஹார்வர்ட் மருத்துவப் பள்ளியில் டாக்டர் ஜார்ஜ் சர்ச்சின் குழுவால் உருவாக்கப்பட்டது. மற்ற வரிசைமுறை நுட்பங்களைப் போலல்லாமல், பொலோனி வரிசைமுறை தொழில்நுட்பம் இலவசமாக பதிவிறக்கம் செய்யக்கூடிய, திறந்த மூல மென்பொருள் மற்றும் நெறிமுறைகளைக் கொண்ட ஒரு திறந்த தளமாகும். மேலும், இந்த நுட்பத்தின் வன்பொருளை பொதுவாக கிடைக்கக்கூடிய எபிஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கி மற்றும் கணினி கட்டுப்படுத்தப்பட்ட ஃப்ளோசெல்/ஃப்ளூயிடிக்ஸ் அமைப்பு மூலம் எளிதாக அமைக்க முடியும். பொலோனி வரிசைமுறை பொதுவாக ஜோடி-இறுதி குறிச்சொற்கள் நூலகத்தில் செய்யப்படுகிறது, டிஎன்ஏ வார்ப்புருவின் ஒவ்வொரு மூலக்கூறும் 135 பிபி நீளம் கொண்டது, இரண்டு 17-18 பிபி ஜோடி மரபணு குறிச்சொற்கள் பொதுவான வரிசைகளால் பிரிக்கப்பட்டு பக்கவாட்டில் உள்ளன. இந்த நுட்பத்தின் தற்போதைய வாசிப்பு நீளம் ஒரு பெருக்கிக்கு 26 தளங்கள் மற்றும் ஒரு குறிச்சொல்லுக்கு 13 தளங்கள் ஆகும், ஒவ்வொரு குறிச்சொல்லிலும் 4 முதல் 5 தளங்களின் இடைவெளியை விட்டுச்செல்கிறது. பணிப்பாய்வு பொலோனி வரிசைமுறையின் நெறிமுறையை மூன்று முக்கிய பகுதிகளாகப் பிரிக்கலாம், அவை இணைக்கப்பட்ட இறுதி-குறிச்சொல் நூலக கட்டுமானம், வார்ப்புரு பெருக்கம் மற்றும் டிஎன்ஏ வரிசைமுறை ஆகும். இணைக்கப்பட்ட இறுதி-குறிச்சொல் நூலக கட்டுமானம் இந்த நெறிமுறை சோதனை செய்யப்பட்ட மரபணு டி. என். ஏவை தோராயமாக இறுக்கமான அளவு விநியோகமாக வெட்டுவதன் மூலம் தொடங்குகிறது. வெட்டு டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகள் பின்னர் இறுதி பழுதுபார்ப்பு மற்றும் ஏ-வால் சிகிச்சைக்கு உட்படுத்தப்படுகின்றன. இறுதி பழுதுபார்ப்பு சிகிச்சை டிஎன்ஏவின் சேதமடைந்த அல்லது பொருந்தாத நீண்ட முனைகளை 5 '-பாஸ்பரிலேட்டட் மற்றும் அப்பட்டமான-முனை டிஎன்ஏவாக மாற்றுகிறது, இது உடனடி அப்பட்டமான-முனை பிணைப்பை செயல்படுத்துகிறது, அதே நேரத்தில் ஏ-வால் சிகிச்சை வெட்டு டிஎன்ஏவின் 3' முனையில் ஏ சேர்க்கிறது. 1 கேபி நீளம் கொண்ட டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகள் 6 சதவீதம் டிபிஇ பேஜ் ஜெல்லில் ஏற்றுவதன் மூலம் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன. அடுத்த கட்டத்தில், டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகள் டி-வால் 30 பிபி நீளமுள்ள செயற்கை ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகளுடன் (டி30) வட்டமயமாக்கப்படுகின்றன, இதில் இரண்டு வெளிப்புறமாக எதிர்கொள்ளும் எம்எம்இஐ அங்கீகார தளங்கள் உள்ளன, இதன் விளைவாக வட்டமயமாக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ உருளும் வட்டப் பிரதிக்கு உட்படுகிறது. பெருக்கப்பட்ட வட்டமயமாக்கப்பட்ட டிஎன்ஏ மூலக்கூறுகள் பின்னர் எம்எம்இஐ (வகை II இன் கட்டுப்பாடு எண்டோநியூக்லீஸ்) மூலம் செரிக்கப்படுகின்றன, இது அதன் அங்கீகார தளத்திலிருந்து தூரத்தில் வெட்டப்பட்டு, 17-18 பிபி குறிச்சொற்களால் (≈ 70 பிபி நீளம்) பக்கவாட்டில் உள்ள டி 30 துண்டுகளை வெளியிடும். ஈ. பி. சி. ஆர் (எமல்ஷன் பி. சி. ஆர்) ப்ரைமர் ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகள் (எஃப். டி. வி 2 மற்றும் ஆர். டி. வி 2) அவற்றின் இரு முனைகளிலும் பிணைக்கப்படுவதற்கு முன்பு ஜோடி-குறிச்சொல் மூலக்கூறுகள் இறுதியில் பழுதுபார்க்கப்பட வேண்டும். இதன் விளைவாக வரும் 135 பிபி நூலக மூலக்கூறுகள் அளவு-தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டு நிக் மொழிபெயர்க்கப்பட்டுள்ளன. கடைசியாக, நூலகப் பொருட்களின் அளவை அதிகரிக்கவும், வெளிப்புற பிணைப்பு தயாரிப்புகளை ஒரே கட்டத்தில் அகற்றவும் பி. சி. ஆருடன் இணைக்கப்பட்ட 135 பிபி எண்ட்-டேக் நூலக மூலக்கூறுகளை பெருக்கவும். இதன் விளைவாக உருவான டிஎன்ஏ வார்ப்புருவில் 44 பிபி எஃப்டிவி வரிசை, ஒரு 17-18 பிபி ப்ராக்ஸிமல் டேக், டி30 வரிசை, ஒரு 17-18 பிபி டிஸ்டல் டேக் மற்றும் 25 பிபி ஆர்டிவி வரிசை ஆகியவை உள்ளன. டெம்ப்ளேட் பெருக்கம் எமல்ஷன் பி. சி. ஆர் மோனோ-அளவு, பாரா காந்த ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-பூசப்பட்ட மணிகள் இரட்டை பயோட்டின் முன்னோக்கி ப்ரைமருடன் முன்பே ஏற்றப்பட்டுள்ளன. ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் பயோடினுடன் மிகவும் வலுவான தொடர்பைக் கொண்டுள்ளது, இதனால் முன்னோக்கி ப்ரைமர் மணிகளின் மேற்பரப்பில் உறுதியாக பிணைக்கும். அடுத்து, முன்கூட்டியே ஏற்றப்பட்ட மணிகள், பி. சி. ஆர் கலவை, முன்னோக்கி மற்றும் தலைகீழ் ப்ரைமர்கள் மற்றும் ஜோடி எண்ட்-டேக் நூலகம் ஆகியவற்றைக் கொண்டு ஒரு நீரிய கட்டம் தயாரிக்கப்படுகிறது. இது குழம்பு உருவாக்க ஒரு எண்ணெய் கட்டத்துடன் கலக்கப்பட்டு சுழல்கிறது. வெறுமனே, எண்ணெய் குழம்பில் உள்ள ஒவ்வொரு நீர்த்துளியிலும் ஒரு மணி மற்றும் ஒரு டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏ மூலக்கூறு உள்ளது, இது பிசிஆர் செய்வதன் மூலம் ஒரு மில்லிலிட்டர் அளவிலான தொகுதிக்குள் மில்லியன் கணக்கான தொடர்பு இல்லாத பெருக்கத்தை அனுமதிக்கிறது. உமிழ்வு உடைப்பு பெருக்கத்திற்குப் பிறகு, முந்தைய படியில் இருந்து வரும் குழம்பு ஐசோபிரோபனால் மற்றும் சோப்பு இடையகத்தைப் பயன்படுத்தி உடைக்கப்படுகிறது (10 எம்எம் டிரிஸ் பிஹெச் 7.5,1 எம்எம் ஈடிடிஏ பிஹெச் 8.0,100 எம்எம் என்ஏசிஎல், 1 சதவீதம் (வி/வி) ட்ரைடான் எக்ஸ்-100,1 சதவீதம் (டபிள்யூ/வி) எஸ். டி. எஸ்), அதைத் தொடர்ந்து தொடர்ச்சியான சுழல், மையவிலக்கு மற்றும் காந்தப் பிரிப்பு. இதன் விளைவாக வரும் தீர்வு வெற்று, குளோனல் மற்றும் குளோனல் அல்லாத மணிகளின் இடைநீக்கம் ஆகும், அவை முறையே பூஜ்ஜியம், ஒன்று அல்லது பல டிஎன்ஏ வார்ப்புரு மூலக்கூறுகளைக் கொண்ட குழம்பு நீர்த்துளிகளிலிருந்து எழுகின்றன. பெருக்கப்பட்ட மணியை அடுத்த கட்டத்தில் செறிவூட்ட முடியும். மணிகள் செறிவூட்டல் பெருக்கப்பட்ட மணிகளின் செறிவூட்டல் ஒரு பெரிய, குறைந்த அடர்த்தி, காந்தமற்ற பாலிஸ்டிரீன் மணிகளுக்கு கலப்பினமயமாக்கல் மூலம் அடையப்படுகிறது, அவை பயோடினைலேட்டட் பிடிப்பு ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுகளுடன் (ஈ. பி. சி. ஆர் பெருக்கி வரிசையை பூர்த்தி செய்யும் டிஎன்ஏ வரிசை) முன் ஏற்றப்படுகின்றன. கலவை பின்னர் செறிவூட்டப்பட்டு பெருக்கப்பட்ட மணிகள் வளாகத்தை பிரிக்கவும், பெரிதாக்கப்படாத மணிகளிலிருந்து பிடிக்கவும் செய்யப்படுகிறது. பெருக்கப்பட்ட, பிடிப்பு மணிகள் வளாகம் குறைந்த அடர்த்தியைக் கொண்டுள்ளது, எனவே பெருக்கப்படாத மணிகள் ஒரு துகள்களை உருவாக்கும் போது சூப்பர்னாடண்டில் இருக்கும். சூப்பர்நேட்டன்ட் மீட்கப்பட்டு NaOH உடன் சிகிச்சையளிக்கப்படுகிறது, இது வளாகத்தை உடைக்கும். பாரா காந்த பெருக்கப்பட்ட மணிகள் காந்தப் பிரிப்பு மூலம் காந்தம் அல்லாத பிடிப்பு மணிகளிலிருந்து பிரிக்கப்படுகின்றன. இந்த செறிவூட்டல் நெறிமுறை பெருக்கப்பட்ட மணிகளை ஐந்து மடங்கு செறிவூட்டும் திறன் கொண்டது. மணிகள் மூடுபனி மணிகள் மூடுபனியின் நோக்கம் நீட்டிக்கப்படாத முன்னோக்கி ஈ. பி. சி. ஆர் ப்ரைமர்கள் மற்றும் வார்ப்புரு டிஎன்ஏவின் ஆர். டி. வி பிரிவின் 3 'முனையில் ஒரு "கேப்பிங்" ஒலிகோனியூக்ளியோடைடைடு இணைப்பதாகும். பயன்படுத்தப்படும் தொப்பி ஒரு அமினோ குழுவாகும், இது ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுகள் இந்த முனைகளுக்கு இணைவதைத் தடுக்கிறது, அதே நேரத்தில், டெம்ப்ளேட் டி. என். ஏவை அடுத்தடுத்த அமினோசிலனேட்டட் ஃப்ளோ செல் கவர்ஸ்லிப் உடன் இணைக்க உதவுகிறது. கவர்ஸ்லிப் வரிசைப்படுத்தல் முதலில், கவர்ஸ்லிப்கள் கழுவப்பட்டு அமினோசிலேன்-சிகிச்சையளிக்கப்படுகின்றன, இது டெம்ப்ளேட் டிஎன்ஏவின் அடுத்தடுத்த சகப்பிணைப்பு இணைப்பை செயல்படுத்துகிறது மற்றும் எந்தவொரு ஃப்ளோரசன்ட் மாசுபாட்டையும் நீக்குகிறது. பெருக்கப்பட்ட, செறிவூட்டப்பட்ட மணிகள் அக்ரிலாமைடுடன் கலக்கப்பட்டு டெஃப்ளான்-முகமூடி கொண்ட நுண்ணோக்கி ஸ்லைடால் உருவாக்கப்பட்ட ஆழமற்ற அச்சில் ஊற்றப்படுகின்றன. உடனடியாக, அமினோசிலேன்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட கவர்ஸ்லிப் அக்ரிலாமைடு ஜெல்லின் மேல் வைக்கவும், 45 நிமிடங்கள் பாலிமரைஸ் செய்ய அனுமதிக்கவும். அடுத்து, ஸ்லைடு/கவர்ஸ்லிப் அடுக்கை தலைகீழாக மாற்றி, ஜெல்லில் இருந்து நுண்ணோக்கி ஸ்லைடை அகற்றவும். சைலேன்-சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட கவர்ஸ்லிப்ஸ் ஜெல்லுடன் சகப்பிணைப்புடன் பிணைக்கப்படும், அதே நேரத்தில் நுண்ணோக்கி ஸ்லைடின் மேற்பரப்பில் உள்ள டெஃப்ளான் அக்ரிலாமைடு ஜெல்லில் இருந்து ஸ்லைடை சிறப்பாக அகற்ற உதவும். கவர்ஸ்லிப்ஸ் பின்னர் ஓட்டம் செல் உடலுடன் பிணைக்கப்பட்டு, இணைக்கப்படாத மணிகள் அகற்றப்படும். டிஎன்ஏ வரிசைமுறை பொலோனி வரிசைமுறையின் உயிர்வேதியியல் முக்கியமாக தசைநார்கள் மற்றும் பாலிமரேஸ்களின் பாகுபாடு திறன்களை நம்பியுள்ளது. முதலாவதாக, தொடர்ச்சியான நங்கூரம் கொண்ட ப்ரைமர்கள் செல்கள் வழியாக பாய்கின்றன மற்றும் 17-18 bp அருகாமை அல்லது தொலைதூர மரபணு டிஎன்ஏ குறிச்சொற்களின் உடனடி 3 'அல்லது 5' முனையில் செயற்கை ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடு வரிசைகளுக்கு கலப்பினமாக்கப்படுகின்றன. அடுத்து, ஃப்ளோரசன்ட் சாயங்களுடன் பெயரிடப்பட்ட சீரழிந்த நோனாமர்களின் மக்கள்தொகைக்கு நங்கூரம் ப்ரைமரின் நொதி பிணைப்பு எதிர்வினை செய்யப்படுகிறது. வேறுபட்ட பெயரிடப்பட்ட நோனாமர்கள்ஃ 5 'Cy5-NNNNNNT 5' Cy3-NNNNNNNA 5 'டெக்சாஸ் ரெட்-NNNNNNC 5' 6FAM-NNNNNNG சீரழிந்த ப்ரைமர்களைப் போன்ற ஒரு மூலோபாயத்தின் படி டேக் காட்சிகளுக்கு வேறுபட்ட வெற்றியைக் கொண்ட ஃப்ளோரோஃபோர்-டேக் செய்யப்பட்ட நோனாமர்கள் அனீல், ஆனால் பாலிமரேஸ்களுக்கு சமர்ப்பிப்பதற்குப் பதிலாக, நோனாமர்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட டி. என். ஏ-நங்கூர ப்ரைமரில் இணைக்கப்படுகின்றன. ஃப்ளோரோஃபோர் மூலக்கூறின் நிலைப்படுத்தல் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் சமிக்ஞையை வழங்குகிறது, இது மரபணு டிஎன்ஏ குறிச்சொல்லில் வினவல் நிலையில் ஏ, சி, ஜி அல்லது டி உள்ளதா என்பதைக் குறிக்கிறது. நான்கு வண்ண இமேஜிங்கிற்குப் பிறகு, நங்கூரம் கொண்ட ப்ரைமர்/நோனாமர் வளாகங்கள் அகற்றப்பட்டு, நங்கூரம் கொண்ட ப்ரைமருக்கு பதிலாக ஒரு புதிய சுழற்சி தொடங்கப்படுகிறது. ஃப்ளோரசென்ட்லி டேக் செய்யப்பட்ட நோனாமர்களின் ஒரு புதிய கலவை அறிமுகப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, இதற்காக வினவல் நிலை ஒரு தளத்தை மேலும் மரபணு டிஎன்ஏ குறிச்சொல்லுக்குள் மாற்றுகிறது. 5 'சை5-என்என்என்என்என்டிஎன் 5' சை3-என்என்என்என்என்என் 5 'டெக்சாஸ் ரெட்-என்என்என்என்என்என்என் 5' 6எஃப்ஏஎம்-என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்என்எ இறுதி முடிவு ஒரு ஓட்டத்திற்கு 26 தளங்கள் (ஜோடி குறிச்சொற்கள் ஒவ்வொன்றிலிருந்தும் 13 தளங்கள்) ஒவ்வொரு குறிச்சொல்லின் நடுவில் 4-அடிப்படை முதல் 5-அடிப்படை இடைவெளியுடன் ஒரு வாசிப்பு நீளம் ஆகும். பகுப்பாய்வு மற்றும் மென்பொருள் பொலோனி வரிசைமுறை ஒரு ஓட்டத்திற்கு மில்லியன் கணக்கான 26 ரீட்களை உருவாக்குகிறது, மேலும் இந்த தகவல் இயல்பாக்கப்பட்டு வரிசையாக மாற்றப்பட வேண்டும். சர்ச் ஆய்வகத்தால் உருவாக்கப்பட்ட மென்பொருளால் இவற்றைச் செய்ய முடியும். அனைத்து மென்பொருள்களும் இலவசம் மற்றும் வலைத்தளத்திலிருந்து பதிவிறக்கம் செய்யலாம். கருவிகள் இந்த நுட்பத்தில் பயன்படுத்தப்படும் வரிசைமுறை கருவியை பொதுவாக கிடைக்கக்கூடிய ஒளிரும் நுண்ணோக்கி மற்றும் கணினி கட்டுப்படுத்தப்பட்ட ஃப்ளோசெல் மூலம் அமைக்க முடியும். 2005 ஆம் ஆண்டில் தேவையான கருவிகளின் விலை சுமார் 1,30,000 அமெரிக்க டாலர்கள் ஆகும். ஒரு பிரத்யேக பொலோனி வரிசைமுறை இயந்திரம், பொலோனேட்டர், 2009 இல் உருவாக்கப்பட்டது மற்றும் டோவரால் US $170,000 க்கு விற்கப்பட்டது. இது திறந்த மூல மென்பொருள், வினைப்பொருள்கள் மற்றும் நெறிமுறைகளைக் கொண்டிருந்தது மற்றும் தனிப்பட்ட மரபணு திட்டத்தில் பயன்படுத்த திட்டமிடப்பட்டது. பலம் மற்றும் பலவீனங்கள் பொலோனி வரிசைமுறை பொதுவாக கிடைக்கக்கூடிய, மலிவான கருவியின் அடிப்படையில் டிஎன்ஏ வரிசைமுறையின் உயர் செயல்திறன் மற்றும் உயர் ஒருமித்த துல்லியங்களை அனுமதிக்கிறது. மேலும், இது பி. ஏ. சி (பாக்டீரியா செயற்கை குரோமோசோம்) மற்றும் பாக்டீரியா மரபணு வரிசைமுறை, அத்துடன் எஸ். ஏ. ஜி. இ (மரபணு வெளிப்பாட்டின் தொடர் பகுப்பாய்வு) குறிச்சொல் மற்றும் பார்கோடு வரிசைமுறை உள்ளிட்ட மாறுபட்ட பயன்பாட்டை செயல்படுத்தும் மிகவும் நெகிழ்வான நுட்பமாகும். மேலும், உருவாக்கப்பட்ட மென்பொருள், நெறிமுறை மற்றும் வினைப்பொருள்கள் உள்ளிட்ட அனைத்தையும் பகிர்ந்து கொள்ளும் ஒரு திறந்த அமைப்பாக பொலோனி வரிசைமுறை நுட்பம் வலியுறுத்தப்படுகிறது. இருப்பினும், மூல தரவு கையகப்படுத்தல் 786 ஜிகாபிட்கள் வரை அடைய முடியும் என்றாலும், சேகரிக்கப்பட்ட 10,000 பிட்களில் 1 பிட் தகவல் மட்டுமே பயனுள்ளதாக இருக்கும். இந்த நுட்பத்தின் மற்றொரு சவால் தனிப்பட்ட இலக்குகளின் ஒப்பீட்டு பெருக்கத்தின் சீரான தன்மை ஆகும். சீரான அல்லாத பெருக்கம் வரிசைமுறையின் செயல்திறனைக் குறைக்கும் மற்றும் இந்த நுட்பத்தில் மிகப்பெரிய தடையாக இருக்கும். வரலாறு பொலோனி வரிசைமுறை என்பது 1990 களின் பிற்பகுதியிலும் 2000 களிலும் இருந்து பொலோனி தொழில்நுட்பத்தின் வளர்ச்சியாகும். ஒற்றை-அடிப்படை நீட்டிப்பைப் பயன்படுத்தி சிட்டு பொலோனிகளில் வரிசைப்படுத்த 2003 ஆம் ஆண்டில் முறைகள் உருவாக்கப்பட்டன, அவை 5 முதல் 6 அடிப்படை ரீட்களை அடைய முடியும். 2005 வாக்கில், தற்போதுள்ள பொலோனி வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்தை உருவாக்குவதற்கான இந்த ஆரம்ப முயற்சிகள் மாற்றியமைக்கப்பட்டன. பொலோனி வரிசைமுறையின் மிகவும் இணையான வரிசைமுறை-மூலம்-பிணைப்பு கருத்துக்கள் ஏபிஐ திட வரிசைமுறை போன்ற பிற்கால வரிசைமுறை தொழில்நுட்பங்களுக்கு அடிப்படையாக பங்களித்துள்ளன. குறிப்புகள் வெளிப்புற இணைப்புகள் டிஎன்ஏ வரிசைமுறை முறைகள் மரபியல் நுட்பங்கள்