Metabolic engineering
मेटाबोलिक इंजीनियरिंग एक निश्चित पदार्थ के कोशिका के उत्पादन को बढ़ाने के लिए कोशिकाओं के भीतर आनुवंशिक और नियामक प्रक्रियाओं को अनुकूलित करने का अभ्यास है। ये प्रक्रियाएँ रासायनिक नेटवर्क हैं जो जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं और एंजाइमों की एक श्रृंखला का उपयोग करती हैं जो कोशिकाओं को कच्चे माल को कोशिका के अस्तित्व के लिए आवश्यक अणुओं में बदलने की अनुमति देती हैं। मेटाबोलिक इंजीनियरिंग विशेष रूप से इन नेटवर्कों को गणितीय रूप से मॉडल करने, उपयोगी उत्पादों की उपज की गणना करने और इन उत्पादों के उत्पादन को बाधित करने वाले नेटवर्क के पिन पॉइंट भागों की गणना करने का प्रयास करती है। आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीकों का उपयोग इन बाधाओं को दूर करने के लिए नेटवर्क को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है। एक बार फिर इस संशोधित नेटवर्क को नए उत्पाद की उपज की गणना करने के लिए मॉडल किया जा सकता है। चयापचय इंजीनियरिंग का अंतिम लक्ष्य इन जीवों का उपयोग लागत प्रभावी तरीके से औद्योगिक पैमाने पर मूल्यवान पदार्थों का उत्पादन करने में सक्षम होना है। वर्तमान उदाहरणों में बीयर, वाइन, चीज़, फार्मास्यूटिकल्स और अन्य जैव प्रौद्योगिकी उत्पादों का उत्पादन शामिल है। चयापचय इंजीनियरिंग के लिए उपयोग की जाने वाली कुछ सामान्य रणनीतियाँ हैं (1) जैवसंश्लेषक मार्ग के दर-सीमित करने वाले एंजाइम को कूटबद्ध करने वाले जीन को अत्यधिक व्यक्त करना, (2) प्रतिस्पर्धी चयापचय मार्गों को अवरुद्ध करना, (3) विषम जीन अभिव्यक्ति, और (4) एंजाइम इंजीनियरिंग। चूँकि कोशिकाएँ अपने अस्तित्व के लिए इन चयापचय तंत्र का उपयोग करती हैं, परिवर्तनों का कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर भारी प्रभाव पड़ सकता है। इसलिए, चयापचय अभियांत्रिकी में वांछित पदार्थ का उत्पादन करने की कोशिका की क्षमता और उसकी प्राकृतिक उत्तरजीविता आवश्यकताओं के बीच अंतर उत्पन्न होता है। इसलिए, चयापचय एंजाइमों के लिए एन्कोड करने वाले जीनों को सीधे हटाने और/या अधिक व्यक्त करने के बजाय, वर्तमान ध्यान चयापचय को कुशलता से इंजीनियर करने के लिए एक कोशिका में नियामक नेटवर्क को लक्षित करना है। इतिहास और अनुप्रयोग अतीत में, एक वांछित चयापचय की उत्पादकता बढ़ाने के लिए, एक सूक्ष्मजीव को रासायनिक रूप से प्रेरित उत्परिवर्तन द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया था, और उत्परिवर्ती तनाव जो वांछित चयापचय को अधिक व्यक्त करता था, उसे चुना गया था। हालांकि, इस तकनीक के साथ मुख्य समस्याओं में से एक यह थी कि उस चयापचय के उत्पादन के लिए चयापचय मार्ग का विश्लेषण नहीं किया गया था, और परिणामस्वरूप, उत्पादन की बाधाएं और संशोधित किए जाने वाले प्रासंगिक मार्ग एंजाइम अज्ञात थे। 1990 के दशक में मेटाबॉलिक इंजीनियरिंग नामक एक नई तकनीक का उदय हुआ। यह तकनीक सूक्ष्मजीव के चयापचय मार्ग का विश्लेषण करती है, और वांछित यौगिकों के उत्पादन पर बाधाओं और उनके प्रभावों को निर्धारित करती है। इसके बाद यह इन बाधाओं को दूर करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग का उपयोग करता है। सफल चयापचय अभियांत्रिकी के कुछ उदाहरण निम्नलिखित हैंः (i) कोरिनेबैक्टीरियम ग्लूटामिकम में लाइसिन उत्पादन की बाधाओं की पहचान और उत्पादन में सुधार के लिए इन बाधाओं को दूर करने के लिए नए जीनों को सम्मिलित करना (ii) एक नए फैटी एसिड जैव संश्लेषण मार्ग की इंजीनियरिंग, जिसे रिवर्स बीटा ऑक्सीकरण मार्ग कहा जाता है, जो फैटी एसिड और अल्कोहल के उत्पादन में मूल मार्ग की तुलना में अधिक कुशल है जिसे संभावित रूप से उत्प्रेरक रूप से रसायनों और ईंधन में परिवर्तित किया जा सकता है (iii) ई. कोलाई द्वारा उत्पादित सुगंधित चयापचय डी. ए. एच. पी. का बेहतर उत्पादन जो सुगंधित अमीनो एसिड के उत्पादन में एक मध्यवर्ती है। चयापचय प्रवाह विश्लेषण के माध्यम से यह निर्धारित किया गया था कि उपयोग किए गए प्रति ग्लूकोज अणु डी. ए. एच. पी. की सैद्धांतिक अधिकतम उपज 3/7 थी। ऐसा इसलिए है क्योंकि ग्लूकोज से कुछ कार्बन डी. ए. एच. पी. के उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने के बजाय कार्बन डाइऑक्साइड के रूप में खो जाता है। इसके अलावा, डी. ए. एच. पी. का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मेटाबोलाइट्स (पी. ई. पी., या फॉस्फोएनोलपाइरूवेट) में से एक को कोशिका में ग्लूकोज के परिवहन के लिए पायरूवेट (पी. वाई. आर.) में परिवर्तित किया जा रहा था, और इसलिए, अब डी. ए. एच. पी. का उत्पादन करने के लिए उपलब्ध नहीं था। पी. ई. पी. की कमी को दूर करने और उपज बढ़ाने के लिए, पटनायक और अन्य। पी. वाई. आर. को पी. ई. पी. में वापस बदलने वाली प्रतिक्रिया को पेश करने के लिए ई. कोलाई पर आनुवंशिक इंजीनियरिंग का उपयोग किया गया। इस प्रकार, कोशिका में ग्लूकोज के परिवहन के लिए उपयोग किए जाने वाले पी. ई. पी. को पुनः उत्पन्न किया जाता है, और इसका उपयोग डी. ए. एच. पी. बनाने के लिए किया जा सकता है। इसके परिणामस्वरूप 6/7 की एक नई सैद्धांतिक अधिकतम उपज हुई-जो मूल ई. कोलाई प्रणाली की तुलना में दोगुनी है। औद्योगिक स्तर पर, चयापचय इंजीनियरिंग अधिक सुविधाजनक और लागत प्रभावी होती जा रही है। जैव प्रौद्योगिकी उद्योग संगठन के अनुसार, "अक्षय जैव द्रव्य से जैव ईंधन और रसायनों का उत्पादन करने के लिए चयापचय इंजीनियरिंग को लागू करने के लिए उत्तरी अमेरिका में 50 से अधिक जैव शोधन सुविधाओं का निर्माण किया जा रहा है जो ग्रीनहाउस गैस उत्सर्जन को कम करने में मदद कर सकते हैं।" संभावित जैव ईंधनों में लघु-श्रृंखला अल्कोहल और एल्केन (गैसोलीन को बदलने के लिए), फैटी एसिड मिथाइल एस्टर और फैटी अल्कोहल (डीजल को बदलने के लिए), और फैटी एसिड-और आइसोप्रेनोइड-आधारित जैव ईंधन (डीजल को बदलने के लिए) शामिल हैं। मेटाबोलिक इंजीनियरिंग सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में सफलताओं और मेटाबोलाइट क्षति और इसकी मरम्मत या बचाव को समझने में प्रगति की सहायता से दक्षता और प्रक्रियाओं में विकसित हो रही है। प्रारंभिक चयापचय इंजीनियरिंग प्रयोगों से पता चला है कि प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती का संचय इंजीनियर मार्गों में प्रवाह को सीमित कर सकता है और यदि मिलान क्षति नियंत्रण प्रणाली गायब या अपर्याप्त है तो मेजबान कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है। कृत्रिम जीव विज्ञान में शोधकर्ता आनुवंशिक मार्गों को अनुकूलित करते हैं, जो बदले में सेलुलर चयापचय आउटपुट को प्रभावित करते हैं। संश्लेषित डी. एन. ए. की लागत में हालिया कमी और आनुवंशिक परिपथों में विकास चयापचय इंजीनियरिंग की वांछित उत्पादन करने की क्षमता को प्रभावित करने में मदद करते हैं। चयापचय प्रवाह विश्लेषण चयापचय प्रवाह का एक विश्लेषण फ्लक्स संतुलन विश्लेषण में पाया जा सकता है विश्लेषण के लिए एक चयापचय मार्ग की स्थापना इस प्रक्रिया में पहला कदम किसी जीव के चयापचय में सुधार या संशोधन के माध्यम से प्राप्त करने के लिए एक वांछित लक्ष्य की पहचान करना है। इस उत्पाद या परिणाम का उत्पादन करने में सक्षम प्रतिक्रियाओं और चयापचय मार्गों पर शोध करने के लिए संदर्भ पुस्तकों और ऑनलाइन डेटाबेस का उपयोग किया जाता है। इन डेटाबेस में चयापचय और अन्य कोशिकीय प्रक्रियाओं के लिए मार्ग सहित प्रचुर मात्रा में जीनोमिक और रासायनिक जानकारी होती है। इस शोध का उपयोग करते हुए, एक जीव का चयन किया जाता है जिसका उपयोग वांछित उत्पाद या परिणाम बनाने के लिए किया जाएगा। यह निर्णय लेते समय जिन बातों को ध्यान में रखा जाता है, वे हैं जीव का चयापचय मार्ग वांछित मार्ग के कितना करीब है, जीव से जुड़ी रखरखाव लागत, और जीव के मार्ग को संशोधित करना कितना आसान है। एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई) का व्यापक रूप से चयापचय इंजीनियरिंग में एमिनो एसिड जैसे विभिन्न प्रकार के उत्पादों को संश्लेषित करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि इसे बनाए रखना और संशोधित करना अपेक्षाकृत आसान है। यदि जीव में वांछित उत्पाद या परिणाम के लिए पूरा मार्ग नहीं है, तो लापता एंजाइमों का उत्पादन करने वाले जीन को जीव में शामिल किया जाना चाहिए। एक चयापचय मार्ग का विश्लेषण उत्पाद की सैद्धांतिक उपज या कोशिका में प्रतिक्रिया प्रवाह का पता लगाने के लिए पूर्ण चयापचय मार्ग को गणितीय रूप से मॉडल किया जाता है। एक प्रवाह वह दर है जिस पर नेटवर्क में दी गई प्रतिक्रिया होती है। सरल चयापचय मार्ग विश्लेषण हाथ से किया जा सकता है, लेकिन अधिकांश गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर के उपयोग की आवश्यकता होती है। ये प्रोग्राम इन मॉडलों को हल करने के लिए जटिल रैखिक बीजगणित एल्गोरिदम का उपयोग करते हैं। नीचे दिखाए गए निर्धारित प्रणालियों के समीकरण का उपयोग करके एक नेटवर्क को हल करने के लिए, प्रासंगिक प्रतिक्रियाओं और उनके प्रवाहों के बारे में आवश्यक जानकारी दर्ज करनी चाहिए। अभिक्रिया के बारे में जानकारी (जैसे अभिकारक और स्टोइकिओमेट्री) मैट्रिक्स Gx और Gm में निहित हैं। मैट्रिक्स Vm और Vx में प्रासंगिक प्रतिक्रियाओं के प्रवाह होते हैं। जब हल किया जाता है, तो समीकरण से सभी अज्ञात प्रवाहों (Vx में निहित) के मान प्राप्त होते हैं। इष्टतम आनुवंशिक हेरफेर का निर्धारण नेटवर्क में प्रतिक्रियाओं के प्रवाह को हल करने के बाद, यह निर्धारित करना आवश्यक है कि वांछित उत्पाद की उपज को अधिकतम करने के लिए किन प्रतिक्रियाओं को बदला जा सकता है। यह निर्धारित करने के लिए कि कौन से विशिष्ट आनुवंशिक हेरफेर करने हैं, कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम का उपयोग करना आवश्यक है, जैसे कि ऑप्टजीन या ऑप्टफ्लक्स। वे सिफारिशें प्रदान करते हैं कि वांछित उत्पाद के उत्पादन में वृद्धि की अनुमति देने के लिए किस जीन को अत्यधिक अभिव्यक्त किया जाना चाहिए, बाहर फेंक दिया जाना चाहिए या कोशिका में पेश किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि किसी दी गई प्रतिक्रिया में विशेष रूप से कम प्रवाह होता है और उत्पाद की मात्रा सीमित हो रही है, तो सॉफ्टवेयर सिफारिश कर सकता है कि प्रतिक्रिया प्रवाह को बढ़ाने के लिए इस प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने वाले एंजाइम को कोशिका में अत्यधिक व्यक्त किया जाना चाहिए। मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करके आवश्यक आनुवंशिक हेरफेर किए जा सकते हैं। मार्ग और अंतिम लक्ष्य पर उनके प्रभाव के आधार पर जीन अत्यधिक अभिव्यक्त या किसी जीव से बाहर निकल सकते हैं। प्रायोगिक माप एक हल करने योग्य मॉडल बनाने के लिए, अक्सर कुछ प्रवाहों को पहले से ही ज्ञात या प्रयोगात्मक रूप से मापना आवश्यक होता है। इसके अलावा, चयापचय तंत्र पर आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए (यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे मॉडल के साथ संरेखित होते हैं), तंत्र में प्रवाह को प्रयोगात्मक रूप से मापना आवश्यक है। प्रतिक्रिया प्रवाह को मापने के लिए, कार्बन-13 समस्थानिक लेबलिंग का उपयोग करके कार्बन प्रवाह माप किया जाता है। जीव को एक मिश्रण खिलाया जाता है जिसमें अणु होते हैं जहां विशिष्ट कार्बन कार्बन-12 के बजाय कार्बन-13 परमाणु होने के लिए इंजीनियर होते हैं। नेटवर्क में इन अणुओं का उपयोग करने के बाद, डाउनस्ट्रीम मेटाबोलाइट्स को भी कार्बन-13 के साथ लेबल किया जाता है, क्योंकि वे उन परमाणुओं को अपनी संरचनाओं में शामिल करते हैं। विभिन्न मेटाबोलाइट्स का विशिष्ट लेबलिंग पैटर्न नेटवर्क में प्रतिक्रिया प्रवाह द्वारा निर्धारित किया जाता है। लेबलिंग पैटर्न को प्रतिक्रिया प्रवाह निर्धारित करने के लिए कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम के साथ गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) जैसी तकनीकों का उपयोग करके मापा जा सकता है। बैक्टीरियल परिवर्तन भी देखें बायोरिएक्टर जेनेटिक इंजीनियरिंग सिंथेटिक बायोलॉजिकल सर्किट सिंथेटिक बायोलॉजी संदर्भ बाहरी लिंक जैव प्रौद्योगिकी उद्योग संगठन (बी. आई. ओ.) वेबसाइटः बी. आई. ओ. वेबसाइट बायोलॉजिकल इंजीनियरिंग