Column chromatography
रसायन विज्ञान में कॉलम क्रोमैटोग्राफी एक क्रोमैटोग्राफी विधि है जिसका उपयोग मिश्रण से एकल रासायनिक यौगिक को अलग करने के लिए किया जाता है। क्रोमैटोग्राफी यौगिकों के अवशोषक के लिए विभेदक अधिशोषण के आधार पर पदार्थों को अलग करने में सक्षम है; यौगिक विभिन्न दरों पर स्तंभ के माध्यम से चलते हैं, जिससे उन्हें भिन्नों में अलग किया जा सकता है। तकनीक व्यापक रूप से लागू होती है, क्योंकि कई अलग-अलग अधिशोषक (सामान्य चरण, उल्टा चरण, या अन्यथा) का उपयोग विलायकों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ किया जा सकता है। तकनीक का उपयोग माइक्रोग्राम से लेकर किलोग्राम तक के तराजू पर किया जा सकता है। कॉलम क्रोमैटोग्राफी का मुख्य लाभ प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले स्थिर चरण की अपेक्षाकृत कम लागत और डिस्पोजेबिलिटी है। उत्तरार्द्ध पुनर्चक्रण के कारण पार-संदूषण और स्थिर चरण क्षरण को रोकता है। कॉलम क्रोमैटोग्राफी को विलायक को स्थानांतरित करने के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करके या स्तंभ के माध्यम से विलायक को धक्का देने के लिए संपीड़ित गैस का उपयोग करके किया जा सकता है। एक पतली परत वाला क्रोमैटोग्राफ यह दिखा सकता है कि कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किए जाने पर यौगिकों का मिश्रण कैसे व्यवहार करेगा। कॉलम क्रोमैटोग्राफी करने से पहले पतली परत वाली क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके अलगाव को पहले अनुकूलित किया जाता है। स्तंभ की तैयारी एक स्तंभ एक ठोस अधिशोषक को एक बेलनाकार कांच या प्लास्टिक ट्यूब में पैक करके तैयार किया जाता है। आकार अलग किए जा रहे यौगिक की मात्रा पर निर्भर करेगा। नली के आधार में एक फिल्टर होता है, या तो एक सूती या कांच के ऊन का प्लग, या ठोस चरण को जगह में रखने के लिए कांच का फ्रिट। स्तम्भ के शीर्ष पर एक विलायक जलाशय संलग्न किया जा सकता है। स्तम्भ तैयार करने के लिए आम तौर पर दो विधियों का उपयोग किया जाता हैः सूखी विधि और गीली विधि। शुष्क विधि के लिए, स्तंभ को पहले शुष्क स्थिर चरण पाउडर से भरा जाता है, इसके बाद गतिशील चरण को जोड़ा जाता है, जिसे स्तंभ के माध्यम से तब तक फ्लश किया जाता है जब तक कि यह पूरी तरह से गीला न हो जाए, और इस बिंदु से कभी भी सूखने नहीं दिया जाता है। गीली विधि के लिए, स्थिर चरण पाउडर के साथ इल्यूएंट का एक घोल तैयार किया जाता है और फिर सावधानीपूर्वक कॉलम में डाला जाता है। सिलिका का शीर्ष सपाट होना चाहिए, और सिलिका के शीर्ष को रेत की एक परत द्वारा संरक्षित किया जा सकता है। कार्बनिक पदार्थ को आगे बढ़ाने के लिए एलुएंट को धीरे-धीरे स्तंभ से पार किया जाता है। अलग-अलग घटकों को स्थिर चरण द्वारा अलग-अलग बनाए रखा जाता है और एक-दूसरे से अलग किया जाता है, जबकि वे स्तंभ के माध्यम से अलग-अलग गति से चल रहे होते हैं। स्तम्भ के अंत में वे एक बार में एक को चुनते हैं। पूरी क्रोमैटोग्राफी प्रक्रिया के दौरान इल्यूएंट को अंशों की एक श्रृंखला में एकत्र किया जाता है। भिन्नों को भिन्न संग्रहकों के माध्यम से स्वचालित रूप से एकत्र किया जा सकता है। एक समय में कई कॉलम चलाकर क्रोमैटोग्राफी की उत्पादकता बढ़ाई जा सकती है। इस मामले में बहु धारा संग्रहकर्ताओं का उपयोग किया जाता है। इल्यूएंट प्रवाह की संरचना की निगरानी की जा सकती है और विघटित यौगिकों के लिए प्रत्येक अंश का विश्लेषण किया जाता है, जैसे। विश्लेषणात्मक क्रोमैटोग्राफी, यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रा, या प्रतिदीप्ति द्वारा। रंगीन यौगिकों (या यूवी लैंप की सहायता से फ्लोरोसेंट यौगिकों) को कांच की दीवार के माध्यम से चलती पट्टियों के रूप में देखा जा सकता है। स्थिर चरण स्तंभ क्रोमैटोग्राफी में स्थिर चरण या अधिशोषक एक ठोस है। कॉलम क्रोमैटोग्राफी के लिए सबसे आम स्थिर चरण सिलिका जेल है, अगला सबसे आम एल्यूमिना है। अतीत में अक्सर सेलूलोज़ पाउडर का उपयोग किया जाता रहा है। आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (आरपी), एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी या एक्सपैंडेड बेड एडसोर्प्शन (ईबीए) करने के लिए स्थिर चरणों की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है। स्थिर चरण आमतौर पर बारीक पीसे हुए पाउडर या जेल होते हैं और/या बढ़ी हुई सतह के लिए सूक्ष्मपटल होते हैं, हालांकि ई. बी. ए. में एक तरल बिस्तर का उपयोग किया जाता है। स्थिर चरण के वजन और विश्लेषणात्मक मिश्रण के सूखे वजन के बीच एक महत्वपूर्ण अनुपात है जिसे स्तंभ पर लगाया जा सकता है। सिलिका कॉलम क्रोमैटोग्राफी के लिए, यह अनुपात 20:1 से 100:1 के भीतर होता है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि एनालाइट घटकों को एक दूसरे के कितने करीब से हटाया जा रहा है। गतिशील चरण (इल्यूएंट) गतिशील चरण या इल्यूएंट एक विलायक या विलायकों का मिश्रण है जिसका उपयोग स्तंभ के माध्यम से यौगिकों को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। इसे इसलिए चुना जाता है ताकि ब्याज के यौगिक का प्रतिधारण कारक मूल्य लगभग 0.2-0.3 हो ताकि क्रोमैटोग्राफी को चलाने के लिए समय और इलुएंट की मात्रा को कम किया जा सके। इल्यूएंट को भी चुना गया है ताकि विभिन्न यौगिकों को प्रभावी ढंग से अलग किया जा सके। इल्यूएंट को छोटे पैमाने के प्रीटेस्ट में अनुकूलित किया जाता है, अक्सर एक ही स्थिर चरण के साथ पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टी. एल. सी.) का उपयोग करते हुए, विभिन्न ध्रुवीयता के सॉल्वैंट्स का उपयोग करते हुए जब तक कि एक उपयुक्त विलायक प्रणाली नहीं मिल जाती है। ध्रुवीयता बढ़ाने के क्रम में सामान्य गतिशील चरण सॉल्वैंट्स में हेक्सेन, डाइक्लोरोमीथेन, एथिल एसीटेट, एसीटोन और मेथनॉल शामिल हैं। एक सामान्य विलायक प्रणाली हेक्सेन और एथिल एसीटेट का मिश्रण है, जिसमें अनुपात को तब तक समायोजित किया जाता है जब तक कि लक्ष्य यौगिक में 0.2-0.3 का प्रतिधारण कारक न हो। आम गलत धारणा के विपरीत, अकेले मेथनॉल का उपयोग अत्यधिक ध्रुवीय यौगिकों के लिए एक इल्यूएंट के रूप में किया जा सकता है, और यह सिलिका जेल को भंग नहीं करता है। प्रत्येक विशेष पृथक्करण के लिए एक इष्टतम प्रवाह दर होती है। इल्यूएंट की तेज प्रवाह दर एक कॉलम को चलाने के लिए आवश्यक समय को कम करती है और इस तरह प्रसार को कम करती है, जिसके परिणामस्वरूप एक बेहतर अलगाव होता है। हालांकि, अधिकतम प्रवाह दर सीमित है क्योंकि स्थिर चरण और गतिशील चरण के बीच संतुलन बनाने के लिए विश्लेषक के लिए एक सीमित समय की आवश्यकता होती है, वैन डिमटर का समीकरण देखें। एक साधारण प्रयोगशाला स्तंभ गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा चलता है। इस तरह के स्तंभ की प्रवाह दर को स्थिर चरण के शीर्ष के ऊपर ताजा इल्यूएंट से भरे स्तंभ को बढ़ाकर या नल नियंत्रण द्वारा घटाया जा सकता है। तेज प्रवाह दरें पंप का उपयोग करके या संपीड़ित गैस का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती हैं (जैसे। हवा, नाइट्रोजन, या आर्गन) स्तंभ (फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी) के माध्यम से विलायक को धक्का देने के लिए। स्थिर चरण के कण का आकार आम तौर पर गुरुत्वाकर्षण स्तंभ क्रोमैटोग्राफी की तुलना में फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी में बेहतर होता है। उदाहरण के लिए, पूर्व तकनीक में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सिलिका जेल ग्रेड में से एक जाली 230-400 (40-63 माइक्रोन) है, जबकि बाद की तकनीक में आमतौर पर जाली 70-230 (63-200 माइक्रोन) सिलिका जेल की आवश्यकता होती है। एक स्प्रेडशीट विकसित की गई है जो फ्लैश कॉलम के सफल विकास में सहायता करती है। स्प्रेडशीट विश्लेषणों की प्रतिधारण मात्रा और बैंड मात्रा, प्रत्येक विश्लेषण को शामिल करने के लिए अपेक्षित अंश संख्या और आसन्न शिखरों के बीच संकल्प का अनुमान लगाती है। यह जानकारी उपयोगकर्ताओं को फ्लैश कॉलम का प्रयास करने से पहले प्रारंभिक पैमाने के पृथक्करण के लिए इष्टतम मापदंडों का चयन करने की अनुमति देती है। स्वचालित प्रणाली कॉलम क्रोमैटोग्राफी किसी भी प्रयोगशाला में एक अत्यधिक समय लेने वाला चरण है और जल्दी से किसी भी प्रक्रिया प्रयोगशाला के लिए अड़चन बन सकता है। बायोटेज, बुची, इंटरचिम और टेलीडेन इस्को जैसे कई निर्माताओं ने स्वचालित फ्लैश क्रोमैटोग्राफी सिस्टम (आमतौर पर एल. पी. एल. सी., कम दबाव वाले तरल क्रोमैटोग्राफी के रूप में संदर्भित) विकसित किए हैं जो शुद्धिकरण प्रक्रिया में मानव भागीदारी को कम करते हैं। स्वचालित प्रणालियों में आम तौर पर अधिक महंगे उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एच. पी. एल. सी.) प्रणालियों पर पाए जाने वाले घटक शामिल होंगे जैसे कि ग्रेडिएंट पंप, नमूना इंजेक्शन पोर्ट, एक यू. वी. डिटेक्टर और इल्यूएंट को इकट्ठा करने के लिए एक अंश संग्राहक। आम तौर पर ये स्वचालित प्रणालियाँ कुछ मिलीग्राम से औद्योगिक कई किलोग्राम पैमाने तक के नमूनों को अलग कर सकती हैं और प्री-एच. पी. एल. सी. प्रणालियों पर कई इंजेक्शन करने के लिए बहुत सस्ता और तेज़ समाधान प्रदान करती हैं। एल. पी. एल. सी. प्रणाली पर संकल्प (या मिश्रण को अलग करने की क्षमता) एच. पी. एल. सी. की तुलना में हमेशा कम होगी, क्योंकि एच. पी. एल. सी. स्तंभ में पैकिंग सामग्री बहुत छोटी हो सकती है, आमतौर पर केवल 5 माइक्रोमीटर इस प्रकार स्थिर चरण सतह क्षेत्र में वृद्धि होती है, सतह की अंतःक्रिया को बढ़ाती है और बेहतर पृथक्करण देती है। हालांकि, इस छोटे से पैकिंग माध्यम का उपयोग पीठ के उच्च दबाव का कारण बनता है और यही कारण है कि इसे उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी कहा जाता है। एल. पी. एल. सी. कॉलम आमतौर पर लगभग 50 माइक्रोमीटर के सिलिका से भरे होते हैं, इस प्रकार पीठ के दबाव और रिज़ॉल्यूशन को कम करते हैं, लेकिन यह महंगे उच्च दबाव वाले पंपों की आवश्यकता को भी दूर करता है। निर्माता अब उच्च दबाव फ्लैश क्रोमैटोग्राफी प्रणालियों की ओर बढ़ना शुरू कर रहे हैं और इन्हें मध्यम दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (एम. पी. एल. सी.) प्रणालियाँ कहा है जो ऊपर काम करती हैं। कॉलम क्रोमैटोग्राम रिज़ॉल्यूशन गणना आमतौर पर, कॉलम क्रोमैटोग्राफी को स्तंभ के शीर्ष के माध्यम से पेरिस्टाल्टिक पंप, फ्लोइंग बफर और समाधान नमूने के साथ स्थापित किया जाता है। समाधान और बफर कॉलम से गुजरते हैं जहां कॉलम सेटअप के अंत में एक अंश संग्राहक बाहर निकाले गए नमूनों को एकत्र करता है। अंश संग्रह से पहले, स्तंभ से निकाले गए नमूने एक डिटेक्टर जैसे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या मास स्पेक्ट्रोमीटर से गुजरते हैं ताकि नमूना समाधान मिश्रण में अलग किए गए नमूनों की सांद्रता निर्धारित की जा सके। उदाहरण के लिए, यदि आप एक समाधान नमूने से स्तंभ के लिए अलग-अलग बंधन क्षमताओं वाले दो अलग-अलग प्रोटीनों को अलग करते हैं, तो एक अच्छा प्रकार का डिटेक्टर 280 एनएम की तरंग दैर्ध्य का उपयोग करने वाला एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर होगा। प्रोटीन की सांद्रता जितनी अधिक होगी जो स्तंभ के माध्यम से इल्यूटेड समाधान से गुजरती है, उस तरंग दैर्ध्य का अवशोषण उतना ही अधिक होगा। क्योंकि कॉलम क्रोमैटोग्राफी में अलग-अलग सांद्रता पर डिटेक्टर से गुजरने वाले इल्यूटेड समाधान का निरंतर प्रवाह होता है, इसलिए डिटेक्टर को समय के साथ इल्यूटेड नमूने की सांद्रता को प्लॉट करना चाहिए। नमूना सांद्रता बनाम समय के इस प्लॉट को क्रोमैटोग्राम कहा जाता है। क्रोमैटोग्राफी का अंतिम लक्ष्य समाधान मिश्रण से विभिन्न घटकों को अलग करना है। संकल्प मिश्रण से घटकों के बीच अलगाव की सीमा को व्यक्त करता है। क्रोमैटोग्राम का रिज़ॉल्यूशन जितना अधिक होगा, कॉलम द्वारा दिए गए नमूनों के पृथक्करण की सीमा उतनी ही बेहतर होगी। यह डेटा उस विशेष नमूने के कॉलम के पृथक्करण गुणों को निर्धारित करने का एक अच्छा तरीका है। रेजोल्यूशन की गणना क्रोमैटोग्राम से की जा सकती है। आरेख में अलग-अलग वक्र स्तंभ राल के प्रति उनकी आत्मीयता के आधार पर समय के साथ विभिन्न नमूना प्रत्यावर्तन एकाग्रता प्रोफाइल का प्रतिनिधित्व करते हैं। संकल्प की गणना करने के लिए, प्रतिधारण समय और वक्र चौड़ाई की आवश्यकता होती है। प्रतिधारण समय डिटेक्टर द्वारा संकेत का पता लगाने की शुरुआत से लेकर प्रत्येक अलग-अलग नमूने के एल्युशन एकाग्रता प्रोफ़ाइल की चरम ऊंचाई तक का समय है। वक्र चौड़ाई समय की इकाइयों में क्रोमैटोग्राम में विभिन्न नमूनों की एकाग्रता प्रोफ़ाइल वक्र की चौड़ाई है। क्रोमैटोग्राम संकल्प की गणना करने की एक सरल विधि प्लेट मॉडल का उपयोग करना है। प्लेट मॉडल मानता है कि स्तंभ को एक निश्चित संख्या में खंडों या प्लेटों में विभाजित किया जा सकता है और प्रत्येक व्यक्तिगत प्लेट के लिए द्रव्यमान संतुलन की गणना की जा सकती है। यह दृष्टिकोण एक गौसी वितरण वक्र के रूप में एक विशिष्ट क्रोमैटोग्राम वक्र का अनुमान लगाता है। ऐसा करने से, वक्र की चौड़ाई का अनुमान वक्र के मानक विचलन का 4 गुना, 4σ के रूप में लगाया जाता है। प्रतिधारण समय संकेत का पता लगाने की शुरुआत से लेकर गौसी वक्र की चरम ऊंचाई के समय तक का समय है। उपरोक्त आकृति के चरों से, स्तंभ प्लेट मॉडल के विभेदन, प्लेट संख्या और प्लेट की ऊंचाई की गणना समीकरणों का उपयोग करके की जा सकती हैः विभेदन (रु.): रु. = 2 (टी. आर. बी.-टी. आर. ए.)/(डब्ल्यू. बी. + डब्ल्यू. ए.), जहाँः टी. आर. बी. = विलेय बी. टी. आर. ए. का प्रतिधारण समय = विलेय ए. डब्ल्यू. बी. = विलेय बी. डब्ल्यू. ए. की गौसी वक्र चौड़ाई = विलेय की गौसी वक्र चौड़ाई ए. प्लेट संख्या (एन.): एन. = (टी. आर.) 2/(डब्ल्यू./4) 2 प्लेट ऊंचाई (एच.): एच. = एल./एन. जहाँ एल. स्तंभ की लंबाई है। स्तम्भ अधिशोषण संतुलन एक अधिशोषण स्तम्भ के लिए, स्तम्भ राल (स्थिर चरण) सूक्ष्म मोतियों से बना होता है। यहाँ तक कि छोटे कण जैसे प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, धातु आयन या अन्य रासायनिक यौगिक भी सूक्ष्म मणियों पर संयुग्मित होते हैं। माइक्रोबीड से जुड़े प्रत्येक बंधन कण को 1:1 के अनुपात में स्तंभ के माध्यम से भेजे गए विलेय नमूने के साथ बांधने के लिए माना जा सकता है जिसे शुद्ध या अलग करने की आवश्यकता होती है। अलग किए जाने वाले लक्ष्य अणु और स्तंभ के मोतियों पर बाध्यकारी अणु के बीच बंधन को एक सरल संतुलन प्रतिक्रिया Keq = [CS]/([C] [S]) का उपयोग करके मॉडल किया जा सकता है जहां Keq संतुलन स्थिरांक है, [C] और [S] क्रमशः लक्ष्य अणु की सांद्रता और स्तंभ राल पर बाध्यकारी अणु हैं। [सीएस] स्तंभ राल से बंधे लक्ष्य अणु के परिसर की सांद्रता है। इसे एक आधार के रूप में उपयोग करते हुए, एक कॉलम क्रोमैटोग्राफी की बाध्यकारी गतिशीलता का वर्णन करने के लिए तीन अलग-अलग समतापों का उपयोग किया जा सकता हैः रैखिक, लैंगमुइर और फ्रायंडलिच। रैखिक समताप तब होता है जब शुद्ध करने के लिए आवश्यक विलेय सांद्रता बाध्यकारी अणु के सापेक्ष बहुत कम होती है। इस प्रकार, संतुलन को इस प्रकार परिभाषित किया जा सकता हैः [CS] = Keq [C]। औद्योगिक पैमाने के उपयोग के लिए, स्तंभ राल मोती पर कुल बाध्यकारी अणुओं को कारक बनाया जाना चाहिए क्योंकि खाली स्थानों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। लैंगमुइर आइसोथर्म और फ्रायंडलिच आइसोथर्म इस संतुलन का वर्णन करने में उपयोगी हैं। लैंगमुइर आइसोथर्म इस प्रकार दिया जाता हैः [CS] = (KeqStot [C])/(1 + Keq [C]), जहाँ Stot मोतियों पर कुल बाध्यकारी अणु है। फ्रायन्डलिच आइसोथर्म इस प्रकार दिया जाता हैः [CS] = Keq [C] 1/n फ्रायन्डलिच आइसोथर्म का उपयोग तब किया जाता है जब स्तंभ समाधान में कई अलग-अलग नमूनों से जुड़ सकता है जिन्हें शुद्ध करने की आवश्यकता होती है। क्योंकि कई अलग-अलग नमूनों में मोतियों के लिए अलग-अलग बंधन स्थिरांक होते हैं, कई अलग-अलग केक्यू होते हैं। इसलिए, लैंगमुइर आइसोथर्म इस मामले में बंधन के लिए एक अच्छा मॉडल नहीं है। उच्च दबाव का उपयोग करके कॉलम क्रोमैटोग्राफी के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एच. पी. एल. सी.) भी देखें। कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके प्रोटीन को अलग करने के लिए फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एफ. पी. एल. सी.)। संदर्भ बाहरी लिंक फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी गाइड (पीडीएफ) रेडियल फ्लो क्रोमैटोग्राफी क्रोमैटोग्राफी प्रयोगशाला तकनीक