Fluorescence-lifetime imaging microscopy
फ्लोरोसेंस-लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी या एफ. एल. आई. एम. एक इमेजिंग तकनीक है जो एक नमूने से फ्लोरोफोर के फोटॉन उत्सर्जन की घातीय क्षय दर में अंतर पर आधारित है। इसका उपयोग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, टू-फोटॉन एक्साइटेशन माइक्रोस्कोपी और मल्टीफ़ोटॉन टोमोग्राफी में एक इमेजिंग तकनीक के रूप में किया जा सकता है। फ्लूम में छवि बनाने के लिए इसकी तीव्रता के बजाय फ्लोरोफोर के प्रतिदीप्ति जीवनकाल (एफ. एल. टी.) का उपयोग किया जाता है। फ्लोरोसेंस का जीवनकाल फ्लोरोफोर के स्थानीय सूक्ष्म-वातावरण पर निर्भर करता है, इस प्रकार प्रकाश स्रोत की चमक में परिवर्तन, पृष्ठभूमि प्रकाश की तीव्रता या सीमित फोटो-ब्लीचिंग के कारण फ्लोरोसेंस की तीव्रता में किसी भी गलत माप को रोकता है। इस तकनीक में नमूने की मोटी परतों में फोटॉन प्रकीर्णन के प्रभाव को कम करने का भी लाभ है। सूक्ष्म-पर्यावरण पर निर्भर होने के कारण, जीवनकाल माप का उपयोग पीएच, चिपचिपाहट और रासायनिक प्रजातियों की सांद्रता के लिए एक संकेतक के रूप में किया गया है। फ्लोरोसेंस जीवनकाल एक फ्लोरोफोर जो एक फोटॉन द्वारा उत्तेजित होता है, कई अलग-अलग (विकिरणशील और/या गैर-विकिरणशील) क्षय मार्गों के माध्यम से क्षय दर के आधार पर एक निश्चित संभावना के साथ जमीनी स्थिति में गिर जाएगा। प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए, इन मार्गों में से एक फोटॉन के सहज उत्सर्जन द्वारा होना चाहिए। समूह विवरण में, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति समय के साथ कहाँ के अनुसार क्षय होगी। उपरोक्त में, समय है, प्रतिदीप्ति जीवनकाल है, प्रारंभिक प्रतिदीप्ति है, और प्रत्येक क्षय मार्ग के लिए दरें हैं, जिनमें से कम से कम एक प्रतिदीप्ति क्षय दर होनी चाहिए। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि जीवनकाल, प्रारंभिक तीव्रता और उत्सर्जित प्रकाश से स्वतंत्र है। इसका उपयोग रासायनिक संवेदन में गैर-तीव्रता आधारित माप करने के लिए किया जा सकता है। मापन फ्लोरोसेंस-लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा निर्धारित प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता के साथ छवियां प्राप्त होती हैं, जो किसी को अलग-अलग फ्लोरोसेंस क्षय दर वाली सामग्रियों के बीच अंतर देखने की अनुमति देती है (भले ही वे सामग्री बिल्कुल एक ही तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरोस करें), और ऐसी छवियां भी उत्पन्न करती हैं जो अन्य क्षय मार्गों में परिवर्तन दिखाती हैं, जैसे कि एफ. आर. ई. टी. इमेजिंग में। स्पंदित प्रकाश प्रतिदीप्ति जीवनकाल को एक स्पंदित स्रोत का उपयोग करके समय क्षेत्र में निर्धारित किया जा सकता है। जब फ्लोरोफोर की एक आबादी प्रकाश की एक अल्ट्राशोर्ट या डेल्टा पल्स द्वारा उत्तेजित होती है, तो समय-हल प्रतिदीप्ति तेजी से क्षय होगी जैसा कि ऊपर वर्णित है। हालाँकि, यदि उत्तेजना नाड़ी या पता लगाने की प्रतिक्रिया व्यापक है, तो मापा गया प्रतिदीप्ति, d (t), विशुद्ध रूप से घातीय नहीं होगा। वाद्य प्रतिक्रिया फलन, आई. आर. एफ. (टी.) को क्षय फलन, एफ. (टी.) के साथ संयोजित या मिश्रित किया जाएगा। स्रोत, डिटेक्टर और इलेक्ट्रॉनिक्स की वाद्य प्रतिक्रिया को मापा जा सकता है, आमतौर पर बिखरे हुए उत्तेजना प्रकाश से। क्षय फलन (और संबंधित जीवनकाल) को पुनर्प्राप्त करना अतिरिक्त चुनौती पेश करता है क्योंकि आवृत्ति क्षेत्र में विभाजन तब उच्च शोर पैदा करता है जब भाजक शून्य के करीब होता है। टी. सी. एस. पी. सी. समय-सहसंबद्ध एकल-फोटॉन गणना (टी. सी. एस. पी. सी.) का उपयोग आमतौर पर इसलिए किया जाता है क्योंकि यह स्रोत की तीव्रता और एकल फोटॉन पल्स आयामों में भिन्नता की भरपाई करता है। वाणिज्यिक टी. सी. एस. पी. सी. उपकरण का उपयोग करके एक प्रतिदीप्ति क्षय वक्र को 405 एफ. एस. तक के समय संकल्प के साथ दर्ज किया जा सकता है। अभिलिखित प्रतिदीप्ति क्षय हिस्टोग्राम पॉइसन सांख्यिकी का पालन करता है जिसे फिटिंग के दौरान फिट होने की अच्छाई निर्धारित करने में माना जाता है। अधिक विशेष रूप से, टी. सी. एस. पी. सी. उस समय को रिकॉर्ड करता है जब उत्तेजना लेजर पल्स के संबंध में एक तेज एकल-फोटॉन डिटेक्टर (आमतौर पर एक फोटो-गुणक ट्यूब (पी. एम. टी.) या एक एकल फोटॉन हिमस्खलन फोटो डायोड (एस. पी. ए. डी.)) द्वारा व्यक्तिगत फोटॉन का पता लगाया जाता है। रिकॉर्डिंग को कई लेजर पल्स के लिए दोहराया जाता है और पर्याप्त रिकॉर्ड की गई घटनाओं के बाद, कोई भी इन सभी रिकॉर्ड किए गए समय बिंदुओं में घटनाओं की संख्या का हिस्टोग्राम बनाने में सक्षम होता है। यह हिस्टोग्राम तब एक घातीय कार्य के लिए उपयुक्त हो सकता है जिसमें ब्याज का घातीय जीवनकाल क्षय कार्य होता है, और तदनुसार जीवनकाल पैरामीटर निकाला जा सकता है। 16 से 64 तत्वों के साथ बहु-चैनल पी. एम. टी. प्रणालियाँ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जबकि हाल ही में प्रदर्शित सी. एम. ओ. एस. एकल-फोटॉन हिमस्खलन डायोड (एस. पी. ए. डी.)-टी. सी. एस. पी. सी. एफ. एल. आई. एम. प्रणालियाँ और भी अधिक संख्या में पहचान चैनलों और अतिरिक्त कम लागत वाले विकल्पों की पेशकश कर सकती हैं। गेटिंग विधि पल्स एक्साइटेशन का उपयोग अभी भी इस विधि में किया जाता है। पल्स के नमूने तक पहुँचने से पहले, कुछ प्रकाश एक डाइक्रोइक दर्पण द्वारा परावर्तित होता है और एक फोटोडायोड द्वारा पता लगाया जाता है जो सी. सी. डी. डिटेक्टर के सामने बैठने वाले एक गेटेड ऑप्टिकल इंटेन्सिफायर (जी. ओ. आई.) को नियंत्रित करने वाले विलंब जनरेटर को सक्रिय करता है। जी. ओ. आई. केवल उस समय के अंश के लिए पता लगाने की अनुमति देता है जब यह देरी के बाद खुला होता है। इस प्रकार, एक समायोज्य विलंब जनरेटर के साथ, नमूने के प्रतिदीप्ति क्षय की समय सीमा को शामिल करते हुए कई विलंब समय के बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्र करने में सक्षम है। हाल के वर्षों में एकीकृत गहन सी. सी. डी. कैमरों ने बाजार में प्रवेश किया। इन कैमरों में एक छवि गहनक, सी. सी. डी. संवेदक और एक एकीकृत विलंब जनित्र होता है। आई. सी. सी. डी. कैमरे 200 पी. एस. तक के सबसे कम गेटिंग समय और 10 पी. एस. के विलंब चरणों के साथ उप-नैनोसेकंड रिज़ॉल्यूशन एफ. एल. आई. एम. की अनुमति देते हैं। एंडोस्कोप के साथ संयोजन में इस तकनीक का उपयोग मस्तिष्क ट्यूमर के इंट्राऑपरेटिव निदान के लिए किया जाता है। चरण मॉड्यूलेशन फ्लोरोसेंस जीवनकाल को आवृत्ति क्षेत्र में चरण-मॉड्यूलेशन विधि द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। विधि एक प्रकाश स्रोत का उपयोग करती है जिसे उच्च आवृत्ति (500 मेगाहर्ट्ज तक) पर स्पंदित या संशोधित किया जाता है जैसे कि एक एलईडी, डायोड लेजर या एक इलेक्ट्रो-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर या एक ध्वनिक-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर के साथ संयुक्त एक निरंतर तरंग स्रोत। प्रतिदीप्ति (ए) है। विमुद्रीकृत और (बी।) चरण स्थानांतरित; दोनों मात्राएँ फ्लोरोफोर के विशिष्ट क्षय समय से संबंधित हैं। इसके अलावा, उत्तेजना और प्रतिदीप्ति साइन तरंगों के लिए y-घटकों को संशोधित किया जाएगा, और जीवनकाल को इन y-घटकों के मॉडुलन अनुपात से निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, जीवनकाल के लिए 2 मूल्यों को चरण-मॉडुलन विधि से निर्धारित किया जा सकता है। जीवनकाल इन प्रयोगात्मक मापदंडों की एक उपयुक्त प्रक्रियाओं के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। पी. एम. टी.-आधारित या कैमरा-आधारित आवृत्ति डोमेन एफ. एल. आई. एम. का एक लाभ इसका जीवन भर का त्वरित छवि अधिग्रहण है जो इसे लाइव सेल अनुसंधान जैसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाता है। विश्लेषण एल्गोरिदम का लक्ष्य मापा गया क्षय से शुद्ध क्षय वक्र निकालना और जीवनकाल (ओं) का अनुमान लगाना है। उत्तरार्द्ध आमतौर पर एकल या बहु घातीय कार्यों को फिट करके पूरा किया जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक सबसे कम वर्ग पुनरावृत्ति पुनः अभिसरण है जो अवशिष्टों के भारित योग के न्यूनतमकरण पर आधारित है। इस तकनीक में सैद्धांतिक घातीय क्षय वक्रों को उपकरण प्रतिक्रिया कार्य के साथ संयोजित किया जाता है, जिसे अलग से मापा जाता है, और न्यूनतम पाए जाने तक विभिन्न निवेशों के लिए अवशिष्टों की पुनरावृत्ति गणना द्वारा सबसे अच्छा फिट पाया जाता है। समय बिन i में प्रतिदीप्ति संकेत के अवलोकनों के एक समूह के लिए, जीवनकाल का अनुमान निम्न के न्यूनतमकरण द्वारा किया जाता हैः तरंग दैर्ध्य पर निर्भर उपकरण प्रतिक्रिया कार्य सहित प्रयोगात्मक कठिनाइयों के अलावा, पुनरावृत्ति डी-कन्वोलुशन समस्या का गणितीय उपचार सीधा आगे नहीं है और यह एक धीमी प्रक्रिया है जिसने एफ. एल. आई. एम. के शुरुआती दिनों में इसे पिक्सेल-दर-पिक्सेल विश्लेषण के लिए अव्यावहारिक बना दिया था। गैर-फिटिंग विधियाँ आकर्षक होती हैं क्योंकि वे जीवनकाल के आकलन के लिए बहुत तेज़ समाधान प्रदान करती हैं। इस श्रेणी की प्रमुख और सीधी तकनीकों में से एक रैपिड लाइफटाइम डिटरमिनेशन (आरएलडी) विधि है। आरएलडी क्षय वक्र को समान चौड़ाई टी के दो भागों में विभाजित करके सीधे जीवनकाल और उनके आयामों की गणना करता है। विश्लेषण क्षय वक्र को समान समय अंतराल टी में एकीकृत करके किया जाता हैः आईआई आई-th चैनल में दर्ज संकेत है और के चैनलों की संख्या है। जीवनकाल का अनुमान इस प्रकार लगाया जा सकता हैः बहु घातीय क्षय के लिए यह समीकरण औसत जीवनकाल प्रदान करता है। इस विधि को द्वि-घातीय क्षय का विश्लेषण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस विधि की एक बड़ी कमी यह है कि यह उपकरण प्रतिक्रिया प्रभाव को ध्यान में नहीं रख सकती है और इस कारण से विश्लेषण में मापा गया क्षय वक्र के शुरुआती हिस्से को नजरअंदाज कर दिया जाना चाहिए। इसका मतलब है कि संकेत का हिस्सा त्याग दिया जाता है और छोटे जीवनकाल का अनुमान लगाने की सटीकता कम हो जाती है। कन्वोलुशन थ्योरम की दिलचस्प विशेषताओं में से एक यह है कि कन्वोलुशन का इंटीग्रल उन कारकों का उत्पाद है जो इंटीग्रल बनाते हैं। कुछ तकनीकें हैं जो परिवर्तित स्थान में काम करती हैं जो मापी गई वक्र से शुद्ध क्षय वक्र को पुनर्प्राप्त करने के लिए इस गुण का उपयोग करती हैं। लैपलेस और फूरियर परिवर्तन के साथ-साथ लैगुएरे गॉस विस्तार का उपयोग परिवर्तित स्थान में जीवनकाल का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। ये दृष्टिकोण विकेंद्रीकरण आधारित विधियों की तुलना में तेज हैं लेकिन वे छंटाई और नमूना लेने की समस्याओं से पीड़ित हैं। इसके अलावा, लैगुएरे गॉस विस्तार जैसी विधियों का अनुप्रयोग गणितीय रूप से जटिल है। फूरियर विधियों में एकल घातीय क्षय वक्र का जीवनकाल इस प्रकार दिया जाता हैः जहाँः और n हार्मोनिक संख्या है और T पता लगाने की कुल समय सीमा है। अनुप्रयोग एफ. एल. आई. एम. का उपयोग मुख्य रूप से जीव विज्ञान में कोशिकाओं और ट्यूमर में फोटोसेंसिटाइज़र का पता लगाने के लिए एक विधि के रूप में किया गया है और साथ ही ऐसे उदाहरणों में एफ. आर. ई. टी. जहां अनुपातिक इमेजिंग मुश्किल है। तकनीक को 1980 के दशक के अंत और 1990 के दशक की शुरुआत में विकसित किया गया था (गेटिंग विधिः बुगीएल एट अल। 1989 में। कनिग 1989, फेज मॉड्यूलेशनः लैकोविक्ज़ एट अल। 1992,) 1990 के दशक के अंत में अधिक व्यापक रूप से लागू होने से पहले। कोशिका संवर्धन में, इसका उपयोग ई. जी. एफ. रिसेप्टर सिग्नलिंग और तस्करी का अध्ययन करने के लिए किया गया है। टाइम डोमेन एफ. एल. आई. एम. (टी. डी. एफ. एल. आई. एम.) का उपयोग परमाणु लिफाफे में अलग-अलग होमोपॉलिमर में दोनों प्रकार के परमाणु मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन लैमिन ए और बी1 की परस्पर क्रिया को दिखाने के लिए भी किया गया है, जो आगे उच्च क्रम संरचनाओं में एक दूसरे के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। एफ. एल. आई. एम. इमेजिंग न्यूरॉन्स में विशेष रूप से उपयोगी है, जहां मस्तिष्क के ऊतकों द्वारा प्रकाश प्रकीर्णन अनुपातिक इमेजिंग के लिए समस्याग्रस्त है। न्यूरॉन्स में, रास, सी. ए. एम. के. आई. आई., आर. ए. सी. और आर. ए. एन. परिवार के प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए स्पंदित रोशनी का उपयोग करके एफ. एल. आई. एम. इमेजिंग का उपयोग किया गया है। एफ. एल. आई. एम. का उपयोग नैदानिक मल्टीफ़ोटन टोमोग्राफी में इंट्राडर्मल कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ दवा और कॉस्मेटिक यौगिकों का पता लगाने के लिए किया गया है। हाल ही में एफ. एल. आई. एम. का उपयोग पौधों की कोशिकाओं में फ्लेवनॉल का पता लगाने के लिए भी किया गया है। ऑटोफ्लोरोसेंट कोएंजाइम एन. ए. डी. (पी.) एच. और एफ. ए. डी. मल्टी-फोटॉन एफ. एल. आई. एम. का उपयोग स्तनधारी चयापचय में परिवर्तन के लिए मार्कर के रूप में कोएंजाइमों से ऑटो-फ्लोरोसेंस का पता लगाने के लिए किया जाता है। एफ. आर. ई. टी. इमेजिंग चूंकि एक फ्लोरोफोर का प्रतिदीप्ति जीवनकाल दोनों विकिरणशील पर निर्भर करता है। प्रतिदीप्ति) और गैर-विकिरणशील (अर्थात। शमन, एफ. आर. ई. टी.) प्रक्रियाएँ, दाता अणु से स्वीकारक अणु में ऊर्जा हस्तांतरण से दाता का जीवनकाल कम हो जाएगा। इस प्रकार, एफ. एल. आई. एम. का उपयोग करके एफ. आर. ई. टी. माप फ्लोरोफोर की अवस्थाओं/वातावरण के बीच अंतर करने की एक विधि प्रदान कर सकते हैं। तीव्रता-आधारित एफ. आर. ई. टी. मापों के विपरीत, एफ. एल. आई. एम.-आधारित एफ. आर. ई. टी. माप भी फ्लोरोफोर की सांद्रता के प्रति असंवेदनशील हैं और इस प्रकार नमूने में सांद्रता और उत्सर्जन तीव्रता में भिन्नताओं द्वारा पेश की गई कलाकृतियों को छान सकते हैं। फ्लोरोसेंस लाइफटाइम और स्पेक्ट्रल इमेजिंग के लिए फेजर दृष्टिकोण भी देखें संदर्भ बाहरी लिंक फ्लोरोसेंस एक्साइटेड-स्टेट लाइफटाइम इमेजिंग लाइफटाइम और स्पेक्ट्रल एनालिसिस टूल्स इमेजजेः http://spechron.com फ्लोरोसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी प्रिंसिपल ऑफ टी. सी. एस. पी. सी. एफ. एल. आई. एम. (बेकर एंड हिक्ल जी. एम. बी. एच.) फ्लोरोसेंस तकनीक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक