Hoechst stain
होक्स्ट दाग नीले फ्लोरोसेंट रंगों के एक परिवार का हिस्सा हैं जिनका उपयोग डीएनए पर दाग लगाने के लिए किया जाता है। इन बिस-बेंज़िमाइड्स को मूल रूप से होक्स्ट एजी द्वारा विकसित किया गया था, जिसने उनके सभी यौगिकों को क्रमांकित किया था ताकि डाई होक्स्ट 33342 कंपनी द्वारा बनाया गया 33,342 वां यौगिक हो। तीन संबंधित होक्स्ट दाग हैंः होक्स्ट 33258, होक्स्ट 33342 और होक्स्ट 34580। रंग होक्स्ट 33258 और होक्स्ट 33342 सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले हैं और उनमें समान उत्तेजना-उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है। आणविक विशेषताएँ दोनों रंग लगभग 350 एनएम पर पराबैंगनी प्रकाश द्वारा उत्तेजित होते हैं, और दोनों 461 एनएम पर अधिकतम उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के आसपास नीले-स्याही प्रतिदीप्ति प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं। अनबाउंड डाई का अधिकतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 510-540 nm सीमा में होता है। होक्स्ट दाग को ज़ेनॉन-या पारा-आर्क लैंप या पराबैंगनी लेजर से उत्तेजित किया जा सकता है। उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच एक महत्वपूर्ण स्टोक्स बदलाव है जो होक्स्ट रंगों को उन प्रयोगों में उपयोगी बनाता है जिनमें कई फ्लोरोफोर का उपयोग किया जाता है। होक्स्ट रंगों की प्रतिदीप्ति तीव्रता भी विलायक के पी. एच. के साथ बढ़ जाती है। होक्स्ट रंग पानी में और डाइमिथाइल फॉर्मामाइड या डाइमिथाइल सल्फॉक्साइड जैसे कार्बनिक विलायकों में घुलनशील होते हैं। सांद्रता 10 मिलीग्राम/एमएल तक प्राप्त की जा सकती है। जलीय घोल कम से कम छह महीने तक 2 से 6 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहते हैं जब वे प्रकाश से सुरक्षित रहते हैं। दीर्घकालिक भंडारण के लिए घोल को-20 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे जमाया जाता है। रंग एडेनिन और थाइमिन से भरपूर अनुक्रमों के लिए वरीयता के साथ डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के छोटे खांचे से जुड़ते हैं। हालांकि रंग सभी न्यूक्लिक एसिड से जुड़ सकते हैं, एटी-समृद्ध डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए स्ट्रैंड फ्लोरोसेंस को काफी बढ़ाते हैं। होक्स्ट रंग कोशिका-पारगम्य होते हैं और जीवित या स्थिर कोशिकाओं में डी. एन. ए. से जुड़ सकते हैं। इस प्रकार, इन दागों को अक्सर सुपरविटाल कहा जाता है, जिसका अर्थ है कि जीवित कोशिकाएं इन यौगिकों के उपचार से बच जाती हैं। कोशिकाएँ जो विशिष्ट ए. टी. पी.-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करती हैं, वे भी सक्रिय रूप से इन दागों को अपने कोशिका द्रव्य से बाहर निकाल सकती हैं। अनुप्रयोग 0.1-12 μg/ml की सांद्रता का उपयोग आमतौर पर बैक्टीरिया या यूकेरियोट कोशिकाओं में डीएनए पर दाग लगाने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-30 मिनट के लिए दाग दिया जाता है और फिर अनबाउंड डाई को हटाने के लिए धोया जाता है। अनबाउंड होक्स्ट डाई का एक हरा प्रतिदीप्ति उन नमूनों पर देखा जा सकता है जो बहुत अधिक डाई से दागदार होते हैं या जिन्हें आंशिक रूप से धोया जाता है। होक्स्ट रंगों का उपयोग अक्सर डी. ए. पी. आई. नामक एक अन्य न्यूक्लिक एसिड दाग के विकल्प के रूप में किया जाता है। होक्स्ट रंगों और डी. ए. पी. आई. के बीच प्रमुख अंतर हैंः होक्स्ट रंग डी. ए. पी. आई. की तुलना में कम विषाक्त होते हैं, जो दागदार कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करता है। कुछ होक्स्ट रंगों में अतिरिक्त एथिल समूह (होक्स्ट 33342) उन्हें अधिक कोशिका-पारगम्य बनाता है। नाभिक धुंधला रंग होते हैं जो धुंधला होने के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की अनुमति देते हैं। होक्स्ट 33342 और 33258 को ब्रोमोडियोऑक्सीयुरिडीन (बी. आर. डी. यू.) द्वारा बुझा दिया जाता है, जिसका उपयोग आमतौर पर विभाजित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है। होक्स्ट 33342 एच 33258 की तुलना में 10 गुना अधिक कोशिका-पारगम्यता प्रदर्शित करता है। कोशिकाएं थाइमाइडिन के विकल्प के रूप में नए संश्लेषित डी. एन. ए. में बी. आर. डी. यू. को एकीकृत कर सकती हैं। जब बी. आर. डी. यू. को डी. एन. ए. में एकीकृत किया जाता है, तो यह माना जाता है कि ब्रोमिन छोटे खांचे को विकृत कर देता है ताकि होक्स्ट रंग अपने इष्टतम बंधन स्थल तक नहीं पहुंच सकें। होक्स्ट रंगों का बंधन बी. आर. डी. यू.-प्रतिस्थापित डी. एन. ए. के लिए और भी मजबूत है; हालाँकि, कोई प्रतिदीप्ति नहीं होती है। कोशिका चक्र की प्रगति की निगरानी के लिए बी. आर. डी. यू. के साथ होक्स्ट रंगों का उपयोग किया जा सकता है। होक्स्ट रंगों का उपयोग आमतौर पर निम्नलिखित अनुप्रयोगों में जीनोमिक डीएनए पर दाग लगाने के लिए किया जाता हैः फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, अक्सर अन्य फ्लोरोफोर फ्लो साइटोमेट्री के साथ कोशिकाओं को गिनने या छांटने के लिए। एक उदाहरण कोशिका चक्र के किस चरण में जनसंख्या की कितनी कोशिकाएँ हैं, इसका विश्लेषण करने के लिए होक्स्ट रंगों का उपयोग है अगरोज जैल में आर. एन. ए. की उपस्थिति में डी. एन. ए. का पता लगाना स्वचालित डी. एन. ए. निर्धारण गुणसूत्र छँटाई होक्स्ट प्रवाह का उपयोग हेमेटोपोएटिक और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। चूंकि ये कोशिकाएं प्रभावी रूप से डाई को प्रवाहित करने में सक्षम हैं, इसलिए उन्हें फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से पता लगाया जा सकता है जिसे साइड पॉपुलेशन कहा जाता है। यह उत्तेजित होचस्ट से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति को लाल और नीले दोनों फिल्टरों के माध्यम से पारित करके और एक दूसरे के खिलाफ होचस्ट लाल और नीले रंग को प्लॉट करके किया जाता है। विषाक्तता और सुरक्षा क्योंकि होक्स्ट दाग डी. एन. ए. से जुड़ते हैं, वे कोशिका विभाजन के दौरान डी. एन. ए. प्रतिकृति में हस्तक्षेप करते हैं। नतीजतन, वे संभावित रूप से उत्परिवर्तनीय और कार्सिनोजेनिक हैं, इसलिए उन्हें संभालने और निपटाने में सावधानी बरतनी चाहिए। होक्स्ट दाग का उपयोग पशुधन और मनुष्यों में शुक्राणुओं को छांटने के लिए किया जाता है। इसकी सुरक्षा पर बहस हुई है। ये भी देखें संदर्भ बाहरी लिंक फ्लोरोसेंट रंगों के लिए वर्णक्रमीय निशान होचस्ट दागों के लिए नियमावली फ्लोरोसेंट जांच और वाणिज्यिक लेबलिंग प्रौद्योगिकियों के लिए एक ऑनलाइन गाइड रंगों को धुंधला करने के लिए फ्लोरोसेंट रंग डीएनए-बाध्यकारी पदार्थ